试剂盒原理.ppt

,谈原理，看ELISA究竟为何物 讲方法，瞧试剂盒到底怎么使,第一部分 抗原抗体基本概念 一、概念 抗原（Antigen, Ag）是刺激机体产生免疫应（应是指抗原刺激机体产生免疫应答产物-抗体或免疫效应细胞）答（答是指相应抗原与免疫应答产物结合并将其排除体外）的物质。 抗原主要指病原微生物及其代谢产物以及抗毒素血清和药物等。根据来源可分为外来抗原和自身抗原。,二、抗原的两种基本特性 1. 免疫原性（immunogenecity），是指抗原分子能够刺激机体产生免疫应答（产生特异性抗体及免疫效应细胞）的性质。,Ag,抗体,免疫原性示意图,2. 抗原性（antigenicity），又称免疫反应性，是指抗原分子与免疫应答产物（抗体或免疫效应细胞）发生特异性结合的性质。,抗原性（免疫反应性）示意图,抗体,三、完全抗原与半抗原 1. 完全抗原（complete antigen)具有免疫原性和抗原性的物质。 2. 半抗原（incomplete antigen ）无免疫原性，只有抗原性的物质。 3. 载体（carrier）赋予半抗原以免疫原性的蛋白质。4. 半抗原 + 蛋白质（载体） 完全抗原。 5. 抗原决定簇（antigenic determinant）, 又称表位（epitope）。抗原分子存在的能与TCR/BCR或抗体Fab片段特异性结合的特殊化学基团，是免疫应答特异性的物质基础。,四、 抗体概论 1. 抗体（antibody, Ab） 是由抗原刺激而产生并能与刺激其产生的抗原发生特异性结合的、具有免疫功能的糖蛋白。抗体主要存在血清中，也存在于如呼吸道粘膜液、小肠粘膜液、唾液以及乳汁等其它体液中。 2. 免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig） 具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。,五、单克隆抗体和多克隆抗体 1.多克隆抗体（polyclonal antibody） 抗原分子通常具有多个抗原决定簇，动物免疫后可刺激多种具有相应抗原受体的B细胞发生免疫应答，因而可产生多种针对不同抗原决定簇的抗体。这些由不同B细胞克隆产生的抗体称为多克隆抗体（polycolonal antibody, PcAb）。,2.单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb） A.定义：由单一克隆B细胞杂交瘤产生的、只识别抗原 分子某一特定抗原决定簇的、具有高度特异性的抗体。 B.特点 具有高度均一性。 C.杂交瘤细胞 骨髓瘤细胞 无限增殖； 免疫B细胞 合成、分泌特异性抗体。 D.杂交瘤技术 HAT培养基：次黄嘌(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺 嘧啶核苷(T)。,单克隆抗体制备流程 1.免疫动物 （使小鼠产生致敏B淋巴细胞） 2.细胞融合（加入PEG） 3.选择性培养（HAT选择性培养基） 4.杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化 （ELISA方法进行筛选，特异性，亲和力，效价及交叉反应的评价） 5.单克隆抗体的大量制备 （体内诱生：腹水） （体外培养：细胞培养液）,单克隆抗体与多克隆抗体的比较,第二部分 ELISA试剂盒的组成及原理,操作流程 注意事项,1 间接竞争法测抗原,样本中的待测药物和固相化的抗原共同竞争一定量的抗体，加入酶标记抗抗体（酶标二抗）后能与固相化的抗原抗体复合物特异性结合，经底物显色后检测，样本中药物含量愈高，竞争结合的抗体量愈多，从而结合在固相上的酶标记抗抗体（酶标二抗）量愈少，最后的显色也愈浅。本公司及国内产品多用此法。具体操作步骤如下： 1）加入标准品/样本，再加入抗体，保温反应。样本中药物与固相抗原同时竞争与特异性抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去游离物质及吸附在固相载体上结合不紧密的物质。 2）加酶标抗抗体，固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与样本中受检药物的量负相关。 3）加底物显色，固相上的酶催化底物成为有色产物。通过仪器检测分析，测知样本中抗原的量。,2 直接竞争法测抗原,（1）直接竞争酶标抗原法测抗原 样本中的待测药物和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，经底物显色后检测，样本中药物含量愈高，结合在固相上的酶标抗原量愈少，最后的显色也愈浅。 （2）直接竞争酶标抗体法测抗原 样本中的待测药物和固相抗原竞争结合一定量的酶标记抗体，经底物显色后检测，样本中药物含量愈高，结合在固相上的酶标抗体愈少，最后显色也愈浅。 直接竞争法具体操作步骤如下： 1）加入标准品/样本，再加入酶标抗体（或酶标抗原），保温反应。样本中药物与固相抗原（或酶标抗原）同时竞争与特异性抗体（或固相抗体）结合，形成固相抗原-酶标抗体复合物（或抗体-酶标抗原复合物）。洗涤除去游离物质及吸附在固相载体上结合不紧密的物质。 2）加底物显色，固相上的酶催化底物成为有色产物。通过仪器检测分析，测知样本中抗原的量。 国外大部分ELISA试剂盒均采用此类型。,3 双抗体夹心法测抗原,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如乳铁蛋白。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。（曲线正相关）,第三部分 分析软件使用及结果分析,第四部分 ELISA试剂盒可能出现的问题及解决方法,第五部分 常见的霉菌毒素及其危害、限量标准,黄曲霉毒素（Alfatoxins）：包括B1、B2、G1、G2、M1、M2等17种，其中B1毒性最强。黄曲霉毒素中毒可降低畜禽对疾病的抵抗力； 玉米赤霉烯酮（Zearalenone）：雌激素样作用，繁殖机能障碍； 呕吐毒素（Vomitoxin）：采食量下降、增重下降，皮肤炎症； T-2毒素(T-2 Toxin)：口腔溃疡，食欲不振，皮肤炎症，消化道紊乱； 伏马毒素(Fumonisin)：神经错乱，肝脏受损； 赭曲霉毒素(Ochratoxins)：产生肾毒素，痛风症。,霉菌毒素的残留限量,GB 2761-2011 食品安全国家标准黄曲霉毒素限量标准,霉菌毒素的残留限量,GB 13078-2001 饲料卫生标准黄曲霉毒素限量标准,霉菌毒素的残留限量,第六部分 试剂盒结果分析,灵敏度:应用该方法能检测待测抗原的最低量。 准确度:指测定值(平均值)与真实值的接近程度,表示分析结果的正确性，由于无法知道样本的真实浓度，故通常采用添加回收率来表示。 回收率=(测定值-空白值)/添加量 精密度:指用某种方法重复测定同一均质样品所得测定值的彼此接近程度,表示分析结果的重复性，用变异系数表示。,第六部分 试剂盒结果分析,检测限（LOD ）：指分析方法能够从样品背景信号中检测出待测物质存在时所需最低浓度。LOD反映了分析方法整体的灵敏度效能指标。LOD=B+2SD或B+3SD。（试剂盒中检测限=灵敏度*样本稀释倍数） 定量限（LOQ ）：指分析方法能够对样品中待测物进行定量测定的最低浓度。用于定量方法的验证。一般要求其CV10%,回收率80%，LOQ=B+10SD。,第六部分 试剂盒结果分析,残留检测限（MRL）：规定的样本中药物最高不得超过的浓度。很多情况下各国规定的值之间有一定的差异，多数情况下我国规定的值较日本、欧盟、美国的高一些。 阴性和阳性 阴性：即样本中不含被检测物质 阳性：样本中含有被检测物质 假阴性与假阳性 假阴性：因为某些因素的影响，原本含有被检测物的样本检测的结果为阴性 假阳性：与假阴性的情况相反,第六部分 试剂盒结果分析,零标OD值：1.4-2.3，表示产品的稳定性，过高的OD值可能是由于操作失误引起的。（酶标仪的选择） IC50：半数抑制浓度。是控制曲线整体形状的关键。（是结果稳定程度的代表参数） 线性（R2值）：代表现有数据和方程式趋势线的拟合度，R2越接近1说明拟合度越好，方程式更符合现有数据的存在规律。（不能仅仅以此为依据判断结果准确性）,第六部分 试剂盒结果分析,第一抑制率（B1/B0）：75-85%。 变异系数（CV）：CV =（ 标准偏差 SD / 平均值Mean ） 100% 。要求CV10%。 特别注意： 精密度与准确度没有必然联系。 以上所有参数均需综合考量，缺一不可。,设备型号 吸光度范围 检测类型 Bio-Rad-550（美国伯乐） 0.02.5 紫外检测 Ultramark （美国伯乐） 0.04.5 紫外检测 MK-3 （热电，同FC） 0.04.0 紫外检测 Multiskan Ascent （热电，自带孵育器） 0.06.0 紫外检测 Bio-tek ELX800（美国宝特） 0.04.0 紫外检测 CliniBio 0.03.2 Anthos 2010（英国安图斯） 0.03.3 紫外检