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硕 士 研 究 生 开题报告,5-氮杂脱氧胞苷联合放疗对鼻咽癌RASSF1A基因甲基化和表达的影响,硕士研究生开题报告,研究生 ：邓岩,导 师：姚运红 副教授 时 间：2005年8月19日,02,硕士研究生开题报告,开题报告,一、立题依据与研究现状 二、实验目的 三、技术路线 四、主要实验方法 五、预期结果 六、经费预算 七、时间安排,03,立题依据,第一部分,04,硕士研究生开题报告,立题依据,RASSF1A基因 RASSF1A蛋白 RASSF1A基因的高甲基化与肿瘤 5-氮杂脱氧胞苷,05,硕士研究生开题报告,RASSF1A基因,很早以来，医学研究人员就发现肿瘤患者3p 染色体出现等位缺失的现象,（常见肺癌患者）,于是推测该区域可能存在某种抑癌基因。 1998 年,Sekido 等在肺癌及乳腺癌细胞系的研究中发现3p21. 3 存在一个120kb长的最小纯合缺少区。 2000 年,Dammann 等4 使用酵母双相杂交筛选的方法自该区分离出一种能与DNA 修补蛋白(XPA) 相互作用的候选cDNA(互补DNA) ,其核苷酸序列的羧基端与鼠RAS 效应蛋白Nore1 和Maxp1 高度同源,遂命名为RAS 区域相关家族1 ,即RASSF1 基因,06,硕士研究生开题报告,RASSF1A基因,Ras 基因除了具有促进细胞生长、增殖的作用外还具有一个非常重要的功能抑制细胞生长、促进细胞凋亡和衰老。RASSF1A 基因可能是Ras 激活信号传导通路中一个非常重要的负向调节基因,在肿瘤的发生、发展、预后等方面具有重要意义。该基因主要存在3 种不同的转录本，共同编码与Ras 相关的同源区(RalGDS/AF26 ,RA)。这三个转录本分别是： RASSF1A 、RASSF1B 、RASSF1C,07,硕士研究生开题报告,RASSF1A,RASSF1A 含外显子1和2,其cDNA 全长1 873 bp ,含340 个氨基酸的开放读码框,编码产物为相对分子质量为38 800 的蛋白多肽,其N端与富含半胱氨酸的甘油二酯或佛波酯结合区高度同源,也被称作蛋白激酶C 保守区1 (protein kinase C conserved region 1 ,PKCC1)。在正常组织中都有表达,但在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、鼻咽癌、肾癌等肿瘤中存在较高的表达缺失。,08,硕士研究生开题报告,RASSF1B,RASSF1B 也含外显子2,但其外显子1与转录本A 不同,该转录本cDNA 全长1 664 bp ,可能仅编码Ras同源区(RA)。主要表达于造血系统的组织细胞,在肿瘤中的表达缺失率不高,约37.13 %,09,硕士研究生开题报告,RASSF1C,RASSF1C 外显子起自1,无2,全长117 kb ,编码含270 个氨基酸的蛋白,但不含PKCC1 区, 相对分子质量为32 000。正常组织和肿瘤中都有较好的表达 因此，RASSF1A基因可以成为一种研究的重要候选抑癌基因。表达产物是RASSF1A 蛋白,10,硕士研究生开题报告,RASSF1A蛋白,RASSF1A 蛋白作为Ras 效应蛋白家族中的一员,主要以GTP 依赖的方式结合Ras 传导通路上游的Ras/ GTP 而被激活发挥抑制细胞生长、促进细胞凋亡和衰老的功能。 研究发现,RASSF1A 蛋白的氨基酸序列除了包含RA 区、PKCC1 区外还包含了一个ATM(ataxia telangiectasia mutated) 蛋白的磷酸化位点，ATM参与细胞周期调控、有丝分裂中染色体重组、端粒长度监测及DNA 损伤细胞学反应。 RASSF1A 蛋白通过磷酸化ATM 蛋白的PI3K位点活化来发挥抑制肿瘤的作用。,11,硕士研究生开题报告,RASSF1A蛋白,1、RASSF1A 蛋白通过抑制Ras 激活生长效应信号的传导途径而发挥作用;另一种可能机制则是RASSF1A 蛋白的失活导致Ras 作用的失衡,使其主要发挥促进生长的作用。 2、RASSF1A 蛋白可能是细胞周期蛋白D1 (cyclin D1) 的抑制蛋白。cyclin D1 对RASSF1A 蛋白的活性非常敏感,活化RASSF1A 蛋白能明显的抑制cyclin D1 在细胞内积聚从而抑制细胞由G1 期进入S 期,对细胞增殖起负性调节作用。,12,硕士研究生开题报告,RASSF1A蛋白,3、RASSF1A 蛋白在分裂间期分布在细胞微管,在有丝分裂期分布在细胞中心体和纺锤体, 并最终通过细胞分化周期调控蛋白20 ( cell division cycle control protein20 ,cdc20) 作用到促后期复合物(anaphase promoting complex ,APC) 上,抑制APC 磷酸化活性使细胞有丝分裂停滞在中后期,13,硕士研究生开题报告,RASSF1A基因高甲基化与肿瘤,现已明确RASSF1A 基因在肺癌等癌症中表达失活的机制是由于其启动子区CpG岛的特异性高甲基化所致。 虽然抑癌基因的失活还可由突变所致,但对该基因的研究结果表明,RASSF1A 基因的突变率在肺癌中还不及10 %,而RASSF1A 启动子区发生高甲基化的比率在小细胞肺癌、非小细胞肺癌系中分别高达100 %和63 %,非恶性肺组织中无一例发生甲基化。 研究表明：不表达RASSF1A 蛋白的A549 肺癌细胞系经甲基化抑制剂处理并重新表达RASSF1A 蛋白后,可减少其细胞克隆形成, 抑制非贴壁性细胞生长; 而表达RASSF1A 蛋白的裸鼠移植肿瘤较对照组的肿瘤生长明显减慢。,14,硕士研究生开题报告,RASSF1A基因高甲基化与肿瘤,邵康,赫捷,程邦昌,等RASSF1 基因不同转录本在肺癌组织中的转录表达及临床意义. 中华肿瘤杂志,2003 ,25 (2) :1492153.研究还发现RASSF1A 与淋巴结转移及TNM分期相关,伴淋巴结转移者或病期较晚的病例癌组织者RASSF1A 的表达缺失均显著高于无淋巴结转移者( P 0. 05)及病期较早者( P 0. 01),15,硕士研究生开题报告,5-氮杂脱氧胞苷,DNA甲基化修饰有多种方式，其中DNA胞嘧啶C-5位甲基转移酶(DNA甲基化酶)识别DNA的5-CG-3序列(CpG),把S腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基转移到胞嘧啶的5位,生成5甲基胞嘧啶(5mC)2。DNA甲基化抑制剂能逆转甲基化效应,包括防止甲基化CpG的突变,重激活因甲基化抑制的基因等。,16,硕士研究生开题报告,5-氮杂脱氧胞苷,这些抑制剂及其作用靶点较多。其中胞苷类似物5氮杂脱氧胞苷的作用机制已很清楚,目前已进入临床实验阶段，用于白血病治疗。其他化合物大多停留在临床前实验阶段。 5氮杂胞苷、5氮杂脱氧胞苷和胞苷结构类似,它们能与DNA甲基化酶共价结合,降低酶的生物 活性。但此类化合物体内体外实验均有细胞毒和致突变作用。,17,鼻咽癌是一种多因素参与的多基因遗传性疾病。然而，研究RASSF1A 基因的甲基化与鼻咽癌的转移关系的文章不很多，因此，本研究旨在从一个新的角度反映鼻咽癌的本质,研究现状,18,硕士研究生开题报告,研究现状,Lo KW, Kwong J , Hui AB , et al. High frequency of promoter hypermethylation of RASSF1A in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Res ,2001 ,61 :387723881.：分析了4 例鼻咽癌移植瘤标本、4 株鼻咽癌细胞系和21 例原发性鼻咽癌标本,发现RASSF1A 基因5Cp G 岛的完全甲基化率在移植瘤中为100 %(4/ 4) ,在鼻咽癌细胞系中为75 %(3/ 4) ,在原发性鼻咽癌中为66.17 %(14/ 21) ,在正常鼻咽上皮没有甲基化,基因突变只在原发性鼻咽癌中发现2 个,19,硕士研究生开题报告,研究现状,在有高度甲基化的细胞系和移植瘤中发现有RASSF1A 基因的高表达缺失, 在用甲基化抑制剂5氮杂脱氧胞苷(52aza22 ,deoxycytidine)处理后,RASSF1A 基因重新表达并显著抑制细胞的生长和增殖。 Chow 等将野生型RASSF1A 基因转染到RASSF1A 基因缺陷型的鼻咽癌细胞C66621 中,发现重新表达RASSF1A 蛋白的鼻咽癌细胞C66621 能显著减少其细胞克隆形成, 抑制非贴壁性细胞生长。,20,以上资料表明：,1. RASSF1A 基因是鼻咽癌的一个非常重要的候选抑癌基因,启动子区的高度甲基化至少是其失活的主要机制之一。（当然，基因缺失的作用不可忽视。）,2. RASSF1A基因表达低下是鼻咽癌的晚期转移的重要事件，可能是伴随性改变，甚至是鼻咽癌发生转移的主导因素,21,第二部分,实验目的,22,实验目的,1. RASSF1A 基因的高甲基化和RASSF1A 基因的表达在鼻咽癌转移方面有无统计学意义,23,实验目的,2.通过5-氮杂脱氧胞苷联合放疗对RASSF1A 基因的表达的影响，研究该药物、放疗各自的疗效和联合疗效,24,第三部分,技术路线,25,鼻咽癌细胞系接种裸鼠,RASSF1A基因甲基化水平及其在鼻咽癌细胞系表达,5-氮杂脱氧胞苷处理,检测RASSF1A基因甲基化水平,分析比较其差异性,RASSF1A基因及蛋白表达,放疗,空白对照,5氮杂脱氧胞苷联合放疗,鼻咽癌组织,正常组织,免疫组织化学 检测RASSF1A蛋白,26,主要实验方法 （一）甲基化特异性PCR（MSP） MSP法原理:单链DNA的胞嘧啶(C)可被亚硫酸氢盐脱氨基转变为尿嘧啶(U),而5 甲基胞嘧啶(5 mC)则不能被修饰,仍保持为5 甲基胞嘧啶(5 mC),根据5 甲基胞嘧啶与胞嘧啶修饰后的不同,发生甲基化与未发生甲基化DNA的上游引物之间的差别为胞嘧啶(C)变为胸腺嘧啶(T),下游引物的差别为鸟嘌呤(G)变为腺嘌呤(A)。据此设计甲基化(p16m)等位基因特异引物和非甲基化(p16u)引物,用这两对引物对同一模板进行扩增来检测待扩增片段的甲基化状况。能用p16m引物扩增的,说明了该扩增片段已发生了甲基化,能用p16u引物扩增的,说明了该扩增片段没发生甲基化,如用两对引物都能扩出,则说明了该扩增片段存在部分程度的甲基化。本研究所扩增的片段位于启动子和第一外显子,其引物序列见表 -,27,硕士研究生开题报告,（一）甲基化特异性PCR（MSP）,引物引物序列 bp p16m(上游)5 TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC 3150 p16m(下游)5 GACCCCGAACCGCGACCGTAA 3 150 p16u(上游)5 TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT 3 151 p16u(下游)5 CAACCCCAAACCACAACCATAA 3 151 PCR:反应总体积50l,包括经亚硫酸钠修饰后的模板DNA约50ng,引物各300dNTP1.25mmol/L,1.25UDNA聚合酶,1* PCR缓冲液(16.6mmol/L硫酸铵、67mmol/L Tris HClpH8.8、10mmol/L2-巯基乙醇67mmol/LMgCl2)反应条件为95热启动15m,然后于9530s、6030s、7230s各循环35次,最后于72延伸10min,同时以正常人外周血淋巴细胞(PBI)DNA作为阴性对照3,以水作为空白对照。取扩增产物于2%琼脂糖凝胶中电泳,凝胶成像系统观察,拍照。,28,主要实验方法 （一）逆转录PCR 1、 抽提鼻咽组织和鼻咽癌细胞株总RNA，42oC完成 2、引物Oligo（dT）15：正义引物5-TCTGGGGCGTCGTGCGCAAA-3;反义产物5-GAACCTTGATGAAGCCTGTG-3 3、 内对照：甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH） 4、 扩增产物在10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙啶（小心，强烈致瘤剂）染色 5、 测定RASSF1A和GAPDH基因产物条带吸光度的相对比值。该比值表示RASSF1A基因的相对表达强度。 -,29,主要实验方法,5氮杂脱氧胞苷 5 aza CdR1.0mol/L（可以采用的浓度分别为0.1,0.5,1.0,2.0,5.0mol/L） 免疫组织化学技术 放疗 DT36Gy/18次 ,30,第四部分,预期结果,31,1. 未用5 氮杂脱氧胞苷与放疗前测甲基化正常组织程度低，鼻咽癌组织甲基化程度高，能与转移能力正相关,3