油菜籽中4-戊烯基硫代葡萄糖苷的提取、分离及结构鉴定.pdf

油菜籽中42戊烯基硫代葡萄糖苷的提取、 分离及结构鉴定 袁丽凤 郭伟强 3 王志刚 (浙江大学化学系,杭州310028) 摘 要 报道了一个分离鉴定油菜籽中硫苷组分的有效方法。利用溶剂萃取法去除大部分杂质,经弱阴离子 交换剂吸附法制得硫代葡萄糖苷粗品,然后利用液相制备色谱进一步分离纯化,制得一系列硫代葡萄糖苷纯 品。对其中分离较好的一个组分经液2质联用、 核磁共振、 红外及紫外等方法确定其结构为42戊烯基硫苷。此 方法可以作为进一步提取特种硫苷的有效手段。 关键词 液相色谱,42戊烯基硫代葡萄糖苷,油菜籽 2003210227收稿;2003212212接受 1 引 言 硫代葡萄糖苷(简称硫苷)是十字花科蔬菜中重要的次生代谢产物,其结构如图1。某些特殊结构 图1 硫苷的一般结构 Fig. 1 The structure of glucosinolates 的硫苷是抗癌药的重要组成部分,其提取方法和结构表征正日益 引起人们的注意。 根据侧链R基团的不同,可以把硫苷分为3类:脂肪类、 芳香类 和吲哚类。在十字花科中相应内源芥子酶的存在下,硫苷容易水解 生成异硫氰酸酯、 硫氰酸酯和腈类等化合物, pH和侧链R基团的 不同将影响各产物的形成1。由于硫苷具有一定的毒性,国内过去 对硫苷的研究主要集中在油菜籽的脱毒和低硫苷、 低芥酸的新品种的选育上。最近几年发现,硫苷的降解 产物可以抑制真菌和微生物的生长2,如Kirkegaard3曾报道了苯乙基硫苷对线性虫具有抑制作用。同时 还发现一些硫苷还具有抗癌的作用,这主要是通过降解产物激发人体免疫力而起作用4 6 。何洪巨7等 报道了白菜类蔬菜的42戊烯基硫苷的异硫氰酸酯降解产物是形成风味的来源,可以作为一些食品的添加 剂。目前,市面上所售的硫苷纯样只有烯丙基硫苷一种,其他种类的纯样硫苷鲜有销售。因此,分离纯化 硫苷具有一定的理论和现实意义。Visentin8等曾报道了从萝卜根中提取制备42甲硫基232丁烯基硫苷,吴 谋成等9从我国甘蓝型和芥菜型油菜籽中提取制备了22羟基232丁烯基硫苷和32丁烯基硫苷。本实验报道 了从油菜籽中分离、 纯化制备42戊烯基硫苷的方法,并对其作了结构鉴定。 2 实验部分 2. 1 试剂和仪器 DEAE Sephadex A225(Sigma) ;甲醇为色谱纯,其他试剂均为分析纯,样品由浙江省农科院提供,水 为二次蒸馏水。 Waters 600高效液相色谱仪(Waters公司) ;Agilent 1100液相色谱2质谱联用仪(Agilent公司 ) ; Shimadzu UV2265型紫外扫描仪(Shimadzu公司) ;Bruker 400MHz核磁共振仪(Bruker公司) ;Nicolet 560型红外光谱仪(Nicolet公司)。 2. 2 硫代葡萄糖苷的提取和富集 参照Minchinton等 10 的提取方法并稍作修改。称取油菜籽1000 g ,粉碎,于沸水浴中处理5 min , 使内源芥子酶失活。然后在索氏提取器中用石油醚脱脂,低温干燥,制得脱脂油菜籽粉备用。 称取脱脂后的油菜籽粉50 g于烧杯中,加入10滴巯基乙醇和500 mL水浸提15 min ,抽滤,取滤液 加入20 mL 0. 5 mol/ L的Pb(Ac)22Ba(Ac)2溶液,离心,得到约500 mL的提取液,浓缩至100 mL ,再用 第32卷 2004年11月 分析化学(FENXI HUAXUE) 研究报告 Chinese Journal of Analytical Chemistry 第11期 14211425 氯仿约100 mL多次萃取,去除大部分杂质。取水相提取液注入填有DEAE Sephadex A225的层析柱 中,过柱后,先用0. 02 mol/ L的醋酸吡啶溶液和水各500 mL淋洗,再用0. 5 mol/ L的硫酸钾溶液(内含 011 %的巯基乙醇)1000 mL洗脱,收集洗脱液。按上述多次重复操作,合并洗脱液,在55 下用旋转蒸 发仪浓缩至近干。用约300 mL甲醇脱盐,过滤,得到硫苷的甲醇溶液,再用旋转蒸发仪于40 下浓缩 至近干,加入30 mL的蒸馏水,得到含有硫苷钾盐的水溶液供制备色谱用。 2. 3 硫代葡萄糖苷的色谱分离和制备条件 将提取到的硫苷钾盐溶液用分析型HPLC进行分离条件的优化。得到液相色谱分离条件:色谱柱 为Kromstar ODS(5m ,4. 6 mm200 mm)柱;流动相组成为甲醇水= 1585 ,含0. 002 mol/ L的KCl作 图2 硫苷的液相色谱分离图 Fig. 2 The chromatogram of glucosinolates 1. 22羟基232丁烯基硫苷 (2 2hydroxyl232butenyl glucosino2 lates) ;2.烯 丙 基 硫 苷( allylglucosinolates ) ;3. 52甲硫氧基戊基硫苷(52methylsulfinylpentenyl glucosinolates) ; 4. 22羟基242戊烯基硫苷 (2 2hydroxyl242 pentenyl glucosinolates) ; 5. 32丁烯基硫苷 (3 2butenyl glu2 cosinolates) ; 6. 42戊烯基硫 (4 2pentenyl glucosinolates) ; 7.吲哚甲基硫苷(indolylmethyl glucosinolatse) ; 8.苯乙 基硫苷(phenethyl glocosinolates)。 为调节剂,检测波长为230 nm ,8种硫苷得到了很好的分 离(见图 2) 。然后在Waters C18 (2. 5 30 cm)柱上完成42 戊烯基硫苷的制备,分离情况见图3。收集42戊烯基硫苷 峰(即图3中的3号峰 ) 12 次,将收集液在40下浓缩至 干,多次加入甲醇将少量的KCl脱除,吹干甲醇,然后冷冻 干燥,得到42戊烯基硫苷的提纯物。 3 结果与讨论 3. 1 分离条件的选择 粗提取的硫苷为硫苷钾盐类物质,选择反相色谱分离 模式进行分离时,硫苷的分离条件需视R基团的不同而加 以改变。在色谱条件的诸因素中,甲醇含量的变化对出峰 时间和分离度的影响最大,但单纯的水与甲醇体系很难得 到对称的色谱峰形。加入微量的KCl作为调节剂,可以改 善色谱分离条件,使得峰形对称,而且能在收集液中设法将 其除去,对测定的影响很小。另外,由于制备色谱仪的分离 效果不如分析型液相色谱仪上的好,且每次进样量达到 1 mL ,致使分析色谱图2中的前5种硫苷在制备色谱图3中没有得到很好的分离。图3中的1号峰和 2号峰之间还含有3种硫苷,但后3种硫苷都得到了很好的分离。 图3 硫苷的液相制备色谱图 Fig. 3 The preparation chromatogram of glucosi2 nolates 1. 22羟基232丁烯基硫苷 (2 2hydroxyl232butenyl glucosino2 lates) ; 2. 32丁烯基硫苷 (3 2butenyl glucosinolates) ; 3. 42 戊烯基硫苷 (4 2pentenyl glucosinolates) ; 4.吲哚甲基硫 苷( indolylmethylglucosinolatse ) ;5.苯 乙 基 硫 苷 (phenethyl glocosinolates)。 3. 2 结构的鉴定 分别以液相色谱2质谱联用法、 红外光谱法、 紫外光谱 法及核磁共振氢谱法对硫苷提纯物中的3号峰进行了结构 鉴定,证明了侧链R基团为42戊烯基。 3.2. 1 液相色谱2质谱联用法 采用负离子源电喷雾接 口,在溶剂脱除后得到硫苷钾盐的硫苷负离子峰。从ESL2 MS质谱图可以看到相对丰度最大的m/ z为386处的峰, 对应42戊烯基硫苷钾盐的M - K - ,这与Botting等 11 的 结论相一致。 3. 2. 2 红外光谱法 根据红外谱图(图 4) 分析,在3396 cm - 1处较钝较强的一个吸收峰 ,对应OH的伸缩振动; 2916 cm - 1 处 一 个 较 小 的 吸 收 峰,对 应CH2的 CH伸缩振动吸收峰;1630 cm - 1为 CC伸缩振动吸 收峰;1567 cm - 1对应 CN的伸缩振动;1410 cm - 1和 1253 cm - 1主要对应 SO的反对称伸缩振动和对称伸缩 振动;1111 cm - 1和 1061 cm - 1对应吡喃葡萄糖苷上各种 CO伸缩振动;986 cm - 1和 912 cm - 1处对应 端烯基的CH弯曲振动吸收峰;803 cm - 1处对应 CS的特征吸收峰。 4151 分 析 化 学第32卷 3. 2. 3 紫外光谱法 分析紫外光谱图,最大吸收峰在225. 6 nm处,对应了SCN在紫外区的特征 吸收 9 。 3. 2. 4 核磁共振氢谱法 42戊烯基硫苷结构的进一步鉴定采用核磁共振氢谱(图 5) 。D2O作溶剂,硫 苷吡喃葡萄糖苷上OH的活泼H被置换为D ,在氢谱图上不出峰,其它不活泼氢可观察到氢峰。 =5.88(1H,m ,CH3CH2 ) , = 5. 25 - 4. 96(2H,m ,CHCH3 2,= 4. 7为H2O峰,= 3. 87 (2H,d ,CH32OD ) ,= 3. 77 - 3. 37(5H,m ,吡喃环上的 H) ,= 2. 78(2H,t ,CNCH3 2CH2 ) , =2145(2H,m ,CH3 2CHCH2 ) , =1.25(2H,m ,CH2 CH3 2CH2 )。 3. 3 结论 在对油菜籽经过上述溶剂萃取、 阴离子交换富集、 液相制备色谱分离纯化后,又经质谱、 红外、 紫外 光谱和核磁共振等结构表征方法确定,所得到的硫苷提取物(制备色谱图3中的第3号峰)的结构如下。 CH2CHCH2 CH2CH2 C SC6H11O5 NOSO-3K+ 致 谢 浙江省农业科学研究院的张童青高工和浙江大学植检中心的吴晓丹老师对本研究给予了很大的帮助,特 此致谢。 References 1 Seera B , Rosa E , Iori R , Barillari J , Cardoso A , Abreu C , Rollin P.Scientia Horticulrae, 2002 , 92 : 7581 2 Delaquis P J , Mazza G.Food Technol., 1995 , 11 : 7384 3 Kirkegaard J , Matthiessen J.Cereals Biof umigation Update, 1997 , 6 : 12 4 Gamet2Payrastre L , Lumeau S , Gasc N , Cassar G, Rollin P , Tulliez J.A nticancer Drugs ,1998 , 9 : 141148 5 Zhang Y, Talalay P.Cancer Res., 1994 , 54( suppl) : 19761981 6 Bonnessen C , Eggleston I M , Hayes J D.Cancer Res. ,2001 , 61 : 61206130 7 He Hongju(何洪巨) , Chen Hang(陈 杭) , Schnitzler W H.Scientia Agricultura Sinica . 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One of the best separated component would be confirmed as 42pentenyl glucosinolate by means of mass spectrometry , nuclear magnetic resonance spectrometry , ultraviolet spectroscopy and in2 frared spectrometry. This research will be used as an effective method for getting special glucosinolate com2 pounds. Keywords Liquid chromatography , 42pentenyl glucosinolate , rapeseed (Received 27 October 2003 ; accepted 12 December 2003) 第40届IUPAC学术大会征稿通知 第40届IUPAC学术大会将于2005年8月1419日在北京国际会议中心举行。会议主题为 “Innovation in Chemistry” 。会议主席为中国化学会理事长白春礼院士;秘书长为中国化学会秘书长姚建年研究员。 会议设置8个分组,分别为: (1) Environmental Chemistry and Green Chemistry;(2)Chemistry in the Life Sciences and Chemical Biology; (3) Materials Chemistry , Supermolecular Chemistry and Nanochemistry;(4) Information Technology in Chemistry and Com2 putational Chemistry; (5) Innovation in Physical Chemistry and Biophysical Chemistry , Research Methods and Techniques; (6) Innovation in Methodology , Techniques and Instrumentation in Analytical Chemistry; (7) Innovation in Chemical Educa2 tion and Teaching Methods;(8) Innovation in the Chemical and Petrochemical Industries and“Responsible Care”to Society 各分组主席分别为:徐晓白院士,张礼和院士,杨玉良院士,陈凯先院士,张存浩院士,汪尔康、 周其凤院士和洪定一 教授。 会议已邀请9位国际著名的化学家作大会报告,其中包括4位诺贝尔奖获得者:Prof. Akira Fujishima (University of Tokyo , Japan) :“Water Photolysis and Photocatalytsis How to Extend Fundamental Finding to Actual Applications”;Prof. Alan J. Heeger (Nobel Laureate , University of California at Santa Barbara , USA) :“Semiconducting and Metallic Polymers: FromPlastic Electronicsto Novel Biosensors”; Prof. Jianguo HOU (University of Science and Technology of China , China) : “Study of single Molecules and their Assembly by Scanning Tunneling Microscopy”; Prof. Charles M. Lieber ( Harvard University , USA):“Nanoscience and the Pathway to Nanotechnologies”; Prof. William N. Lipscomb , (Nobel Laureate , Harvard University , USA) :“Structure and Functions in Chemistry and Biology: Experimental and Computational Studies”; Prof. Yuri Oganessian (Joint Institute of Nuclear Research , Russia) :“Synthesis and DecayPropertiesof Superheavy Elements”; Prof. John E. Walker (Nobel Laureate , University of Cambridge , UK) :“报告题目待定”; Prof. Jiming Wang (SINOPEC , China) :“Petrochemical Technology of Chi