《DNA的结构与特点》PPT课件.ppt

第一节 核酸是遗传物质,第一章 DNA的结构与特点,The transforming principle is DNA.,1.1 DNA is the genetic material（I）,The genetic material of phage T2 is DNA.,1.2 DNA is the genetic material （II）,Eukaryotic cells can acquire a new phenotype as the result of transfection by added DNA.,1.3 DNA is the genetic material （III）,1957年，Heinz Fraenkel-Conrat和B. Singre 的杂合病毒实验：,烟草花叶病毒的感染和繁殖过程证实 RNA也是遗传物质之一。,1.4 RNA is the genetic material,THE RESULTS,DNA is the genetic material of all organisms except for some viruses; RNA is the genetic material of some viruses.,第一节 核酸的结构与功能,1.1 核酸的一级结构,核酸是由很多单核苷酸聚合形成的多聚核苷酸。 DNA的一级结构，即是指四种核苷酸dNMP (dAMP、dCMP、dGMP、dTMP)按照一定的排列顺序，通过3 - 5 磷酸二酯键连接形成的多核苷酸，由于核苷酸之间的差异仅仅是碱基的不同，故又可称为碱基顺序。,1.1.1 核苷酸的结构,核 糖,腺苷(AR) 脱氧胞苷(dCR),1 ,N9-糖苷键 1 ,N1-糖苷键,核 苷 ( 核糖 Sugarphosphate bond 碱基 ),1.1.2一条多聚核苷酸链,35磷酸二酯键（phosphodiester bond）的形成示意图,1.1.3 一级结构的特点,具有极性； 碱基排列顺序存在多样性。,线条式 法,文字式法,结构式法,小 结：核酸的结构,1.2.1 DNA二级结构的涵义： B型DNA是由两条平行互补的多核苷酸链组成的，构成DNA的两条核苷酸链的方向是相反的（即一条是3 5 ，另一条是5 3 ）；两条链以右手的方向相互缠绕呈螺旋状，因此叫右手双螺旋结构模型。,DNA的双螺旋模型,螺旋,1.2.2 双螺旋的结构特点 1、 Antiparallel ：反向平行、大沟和小沟。 2、DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本分子骨架，碱基排列在内侧,碱基平面与纵轴垂直。 3、碱基对 ： chargaff 原则,1.2.3 双螺旋结构的构象变异,DNA的构象现已知有 A，B，C，D，E，T，Z 7种。 引起DNA双链构象改变有以下因素： （1）核苷酸的一级结构顺序； （2）碱基组成； （3）盐的种类； （4）相对湿度。,A,B,Z,B-DNA构象的特点,右手双股螺旋； 10 base pairs / turn 螺旋扭角为36； 螺距34埃，每个碱基对的螺旋上升值为3.4埃； 碱基倾角 - 2，碱基平面基本上与螺旋轴垂直； 螺旋轴穿过碱基对，大沟宽而略深，小沟窄而略浅。,A-DNA构象的特点,右手双股螺旋； 每圈螺旋l09个碱基对，螺旋扭角为33； 螺距32埃每个碱基对的螺旋上升值为29埃，碱基倾角13，碱基平面不再水平。 螺旋轴不穿过碱基对，而是位于大沟中，碱基对在小沟中围绕着螺旋轴，形成中空结构； 小沟宽而钱，大沟极深，其深度为从螺旋表面经过螺旋轴再向对面延伸一段距离。,Z-DNA构象的发现：,1972年 Pohl et al 发现 poly(dG-dC)在高盐下旋光性发生改变； 1979年 Wang H-J(王惠君), A.Rich对 d(CGCGCG)单晶作X衍射分析提出ZDNA模型,Z- DNA构象的特点,小结：几种DNA构象的结构模式比较,核苷酸一级序列对DNA二级结构的形成有很大影响： AT丰富区常呈B型; B-DNA中多聚（G-C）区易出现左手螺旋DNA（Z-DNA），尤其是嘌呤嘧啶二核苷酸重复单位易于采取Z型构象 ； 而当B型DNA中一条链被RNA替换时则呈A型； 盐浓度对结构也有影响，如：DNA晶体为A型。 功能：B型易于表达，Z-DNA则难于结合，与基因表达调控有关。,1.2.4 不同类型二级结构的特点与功能：,1.3 DNA的高级结构超螺旋（Supercoied） 1.3.1 DNA的超螺旋结构是Vinograd在1965年研究多瘤病毒时首先发现的，多瘤病毒DNA是共价闭合环状分子(covalently closed circle)状结构，简称ccc分子。但在生理状态这种ccc分子再度螺旋化成为超螺旋结构(superhelix或supercoil)，即在二级结构的基础上再次螺旋形成的，多见于原核生物。,定义：,正超螺旋：向越来越紧的方向拧形成的超螺旋。 负超螺旋：向越来越松的方向拧形成的超螺旋,超螺旋结构指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。是一种比双螺旋更高层次的空间构象。,环状DNA形成的超螺旋,DNA的超螺旋结构演示,线状DNA形成的超螺旋,不论正超还是负超，都和初级螺旋有关，超螺旋和初级螺旋地关系可用公式表示 : 注：为超螺旋数，为超螺旋状态下初级螺旋圈数，松弛状态下初级螺旋圈数； 当0时为松弛型；当大于0时为正超螺旋；当小于0时为负超螺旋。,1.3.2 超螺旋的生物学意义 目前在生物体内还没有发现正超螺旋，推测负超螺旋可能有利于复制和转录。,凝胶电泳： 电镜观察： 密度梯度离心：,1.4 检测DNA三级结构的方法：,第二节 核酸的特性,2.1.1 变性（Denaturation） ：由双链DNA变成单链DNA的过程叫变性，也叫解链（melting)。,返回,2.1 DNA的变性和复性,高温 极端pH值 尿素 甲酰胺,下列因素可导致DNA变性：,变性原理：变性是热处理或变性剂处理的条件下,直接或间接的打断DNA中的H键，这时双链DNA就会逐渐变成单链。,碱变性：把由碱引起的变性叫碱变性； 热变性：由热引起的变性叫热变性，属于物理变性。,热变性是常用的DNA变性方法之一，因为它方法简单、容易控制，不改变DNA溶液的化学成分，更重要的是它能有效的使DNA发生变性。,DNA变性后DNA物理、化学性质发生如下变化： （1）流体力学的性质发生改变：粘度下降，而沉降 速度增加； （2）DNA的浮力密度增高； （3）生物功能丧失或改变； （4） DNA在260nm处吸收值增加 。 增色效应（hyperchromic effect）:由于DNA变性而引起的260nm紫外光的光吸收值增加的现象。,双链DNA的A260=1.00（浓度为50g/ml时， 对波长260nm紫外线的吸收能力）； 单链DNA的A260=1.37； 游离碱基或核苷酸的A260=1.60。,可见，双链DNA变为单链DNA时，A260会逐渐增加。,不同状态下DNA的吸光值：,2.1.2 溶解曲线与Tm值： 溶解曲线：当缓慢而均匀地(目前可以做到 0.1分)增加DNA溶液的温度，记录各个不同温度下的数值，即可绘制成DNA的溶解曲线，如图所示。,返回,1.40 1.20 1.00,Tm,30 50 70 90 温 度（）,溶 解 曲 线,A260吸光值,解链温度（melting temperature, Tm）：也叫熔点，是A260增加到最大增值一半时的温度，是变性温度范围的中点，用Tm表示。 在生理条件下，一般来讲，体内DNA分子的Tm值在8595 之间。,2.1.3 影响Tm值的因素：,外部条件: DNA的浓度和正离子的浓度。 DNA浓度低于0.4mol/L，单价阳离子增高10倍，Tm增加16.6 （为什么？）。 除此之外，凡能影响H键稳定的试剂都能降低Tm. 内部条件: GC含量：当GC的含量上升1%，则Tm上升0.4 马默多蒂（Marmur-Doty）关系式： Tm = 69.3+0.41(G +C)%， 或 GC%=（Tm-69.3）2.44,2.1.4 小结：Tm值的大小取决于DNA的碱基组成和变性条件： 1）特定的DNA在特定的条件下所测得Tm值是相对恒定的，但相同的DNA在不同的条件下或不同的DNA在相同的条件下，Tm值是不同的。 2）GC含量高，AT含量低的DNA其Tm值就高，反之亦然。,2.2 复性（renaturation） 定义 ：热变性的DNA在一定的条件下还可以重新形成原来的双螺旋结构，这个过程叫复性或退火（annealing）。 6.2.1 复性条件 （1）温度降低要缓慢，不能淬火； （2）有足够高的温度以破坏无规则的链内氢键，但又不能太高一般使用比Tm低10-15的温度； (3) 有足够的盐浓度以消除磷酸基的静电斥力，常用的盐浓度为0.15至0.50mo1/L的NaCl。,返回,2.2.2 复性机制： （1）无规则碰撞：首先从单链分子的无规则碰撞运动开始，这种碰撞过程是随机的，与DNA的浓度，溶液的温度和离子强度有关; （2）成核作用（nucleation）：只有当应该配对的一部分碱基相互靠近时，一般认为需要10个一20个碱基对特别是富含GC的节段首先形成氢键，产生一个(或几个)双螺旋核心； （3）拉拉链作用（Zippering）：两条单链的其余部分就会像拉拉链那样迅速形成双螺旋结构。,2.2.3 变性与复性的转换,2.2.4 影响复性反应的因素,DNA片段的大小及复杂性； DNA的浓度； 温度：最佳复性温度一般比Tm低 10-15C； (4)盐的浓度：复性时要求盐的浓度达到 足够高。,6.2.5 检测DNA复性的方法,(1) 减色效应（hpochromic effect）： 测定光密度，即OD值（optical density），DNA从单链变成双链，OD260减少30%; (2) 羟基磷灰石柱层析： 吸附双链DNA较牢。,7.1、 反向重复序列(inverted repeats ) 7.2、富含AT的序列 7.3、嘌呤和嘧啶的排列顺序对双螺旋结构稳定性的影响,1）反向（倒转）重复序列：能在DNA单链或RNA中可形成发夹结构，在双链DNA中有可能形成十字架结构。 倒位重复的两个互补拷贝间可有一到几个核苷酸的间隔，也可以没有间隔。没有间隔的又称回文序列（palimdrome sequence），这种结构约占所有倒位重复的三分之一。 例如：大肠杆菌的转录终止子；tRNA的三叶草结构中的茎环结构。,返回,倒转重复序列中的单链可形成发卡结构,ACG CTA TGAG TAG CGT,双链倒转重复序列可形成十字架结构,核酸分子中的回文序列（Palindrome）：,酶切位点； 5TGGCCA 5 TTAGCC 3ACCGGT 3 AATCGG,2）镜像重复,指存在于同一股上DNA区段的反向重复序列。,AATTCAAGGGAGAAGTATAGAAGAGGGAAGGATC TTAAGTTCCCTCT TCATATCT TCTCCCTTCCTAG,大肠杆菌复制起点,7.2 富含AT的序列： 例如: 复制起点和转录起始点,嘌呤和嘧啶的排列顺序不同，双螺旋的稳定性具有显著的差异： 5 -GC-3 和5 -CG-3 的稳定性相差很大，前者的稳定性远大于后者。 原因：虽然它们的氢键数目是相同的，但是它们的相邻碱基之间的堆集力不同。即从嘌呤到嘧啶的方向的碱基堆集作用显著地大于同样组成的嘧啶到嘌呤方向的碱基推集作用。(这里的方向就是常规的从5 端到3 端的方向)。这是因为前者的嘌呤环和嘧啶环重迭面积大于后者的嘧啶环和嘌呤环的重迭面积，这在B型DNA中确是如此。,返回,7.3 嘌呤和嘧啶的排列顺序对双螺旋结构稳定性的影响,RNA存在高级结构，而且高级结构对RNA执行功能非常重要，例如tRNA and rRNA，都是以高级结构来执行特定的生物学功能. 一级结构 RNA的结构 二级结构 三级结构,RNA的一级结构：是由四种核糖核酸（AMP、GMP、CMP、UMP）按一定顺序，通过3，5磷酸二酯键连成的线形分子，其表示方法与DNA相同。,RNA二级结构：单链RNA自行盘绕形成局部双螺旋的多“茎”多“环”结构，螺旋部分称为“茎”或“臂”，非螺旋部分