AlltechELSD液相色谱检测器.ppt

Alltech 2000 ELSD使用及维护,ELSD的原理:,检测三部曲 ： 雾化 溶剂的蒸发 检测,第一部：雾化,流动相及经色谱柱分离后的样品首先进入雾化器中, 通过喷雾器针孔与雾化气体混合,形成均匀的雾状液滴,第二部：溶剂的蒸发,液滴通过加热的漂移管后溶剂蒸发,保留下薄雾状的样品颗粒。,第三部：检测,样品颗粒通过流动池，激光“撞击”颗粒被散射，形成散射光。光电二极管接收散射光形成信号。,ELSD的主要结构：,按流路顺序由四部分组成： 雾化器(Nebulizer) 漂移管(Drift Tube) 光路部分(Optics) 出口(Exhaust),两种操作模式：Impactor on&off,撞击器开(Impactor on):部分流动相及样品通过光路出口部分，剩余的雾化后形成的大液滴由右侧面的分流口排出；操作时需要较小的气流和温度； 撞击器关(Impactor off)：100的流动相及样品通过光路出口部分，需要较高的气流和温度；,ELSD加热的控制：,加热温度范围：室温120(精度1)； Impactor Off 模式下： 漂移管和雾化器加热到设 定温度，光池和出口 加热到90%的设定温度值； Impactor On模式下： 除雾化器不加热外，其余部分加热到设定温度；,加热部分的组成：,加热模块由三部分组成： 温度过热保险丝/ 加热器电热丝/温度热敏传感器 电源板上有四个指示灯： 由左至右依次为：光池出口漂移管雾化器 颜色分别为：黄灯红灯绿灯桔黄灯,加热部分的组成：,温度过热保险丝由两根桔黄色的线组成，从电源板插入加热部分内部； 正常的情况下是通路的，烧断的时候是开路的； 加热器电热丝电阻： 出口 500X2, 光池 380 X2, 漂移管 243 X2， 雾化器 270 X2,手动控制加热开关：,可以通过Manual Control菜单来手动控制雾化器和漂移管的加热的开关；（Menu)-(3.Diagnostics)- (2.Manual Control) 通入流动相后雾化器温度有一个下降的过程是正常的，在高温时会更明显； 600-020XXXX系列有两个温度显示；600-030XXXX系列有四个温度显示,主板和输入输出板：,对雾化气体的要求：,ELSD要求的入口压力范围：0.45-0.56MPa(65-80PSI),不要超过规定的压力，气压过大容易损坏ELSD内部的气体入口过滤器（货号50135） 使用空气压缩机作为气源时要定期更换变色硅胶和放水，分子筛和活性炭等应每年更换一次； 常规使用的气流量在1.5-3.2升/分钟之间，气体分为两路：一路进入漂移管，另一路进入尾吹部分；,ELSD对流动相的要求：,ELSD检测的是没有挥发的样品颗粒的散射光，所以要求使用高纯的无颗粒的试剂，溶剂的蒸发残渣值应小于1ppm; 流动相应经过0.45um的滤膜过滤后使用，注意选择好滤膜的种类，以免带入更多的颗粒； 必要时需要对溶剂进行重新蒸馏的处理； 非挥发性缓冲液及离子对试剂必须用挥发性的试剂取代，不能使用H3PO4,KH2PO4等； ELSD检测跟溶剂的UV吸收没有关系，可以使用一些在紫外上不能用的试剂，如丙酮等；,挥发性缓冲液和挥发性流动相改型剂,pKa pKb pH Range BP MP,酸 Trifluoroacetic Acid 三氟乙酸 0.3 13.70 72.4C Formic Acid 甲酸 3.75 10.25 100.7C Acetic Acid 乙酸 4.75 9.25 116.0C Carbonic Acid 碳酸 6.37 7.63 碱 Ammonia 氨 9.25 4.75 -33.35C Methylamine 甲胺 10.81 3.19 16.6C Ethylamine 乙胺 10.66 3.34 -6.3C Triethylamine 三乙胺 11.01 2.99 89.3C 缓冲液 Ammonium Formate 甲酸胺 3.0-5.0 120C Pyridinium Formate 甲酸吡啶翁 3.0-5.0 Ammonium Acetate 乙酸胺 3.8-5.8 111C Pyridinium Acetate 乙酸吡啶翁 4.0-6.0 Ammonium Carbonate (for reverse phase) 碳酸胺（用于反相） 8.0 (adjusted) Ammonium Carbonate 碳酸胺 5.5-7.5 & 9.3-11.3 离子对试剂 Pentafluoropropionic Acid 五氟丙酸 0.6 96-97C Heptafluorobutyric Acid 七氟丁酸 0.6 120C Nonafluoropentanoic Acid 九氟戊酸 0.6 140C Pentadecafluoroocatanoic Acid 十五氟辛酸 0.6 189C Tridecafluoroheptanoic Acid 十三氟庚酸 0.6 175C,ELSD参数的设定：,ELSD参数的设定：,选择正确的操作条件-Impactor开关(根据含水或有机溶剂，样品的挥发性等)； Impactor关(优化温度及气流-参考操作手册内的部分，注意流速若超过1ml/min.需要按比例提高建议值，小于1ml/min可以适当减少温度和气流)；使用梯度洗脱时应参考水相最多的条件设定参数； Impactor开(按样品及溶剂分两种初始条件)，上限流速5ml/min； 使用制备大流速超过5ml/min时，需要使用分流器(货号50194) ；,ELSD开关机的顺序(Impactor Off 模式下)：,开机： 先用流动相平衡色谱柱约30分钟，注意不要通入ELSD中； 根据流动相的组成计算ELSD的温度和气流，将ELSD置于Run状态下通气升温； 达到条件后接入流动相，约1520分钟后可以进样分析； 关机： 流动相中只含有有机相/水的情况： 1.切断流动相,保持ELSD的条件不变约15分钟; 2.将ELSD的温度降至70,气流量保持不变或适当降低,到达温度后停气关机; 流动相中含有缓冲液或改型剂的情况: 将色谱柱替换为两通, 直接用输液泵将100%水以0.6ml/min左右的流速通入ELSD约30分钟,然后重复以上的两步;,两种模式的注意事项：,撞击器开的模式下，随时注意废液缸中液体的高度。当液面接近废液缸口时，必须倒掉部分液体。在倾倒液体时请记住需留有足够液体浸没管子。 在撞击器关的模式下，无须查看液面高度，因为在此模式下无废液排出。 无论在哪一种模式下工作，管子必须埋在液面下面，同时不能够有鼓气泡的现象。 每天检查排气管和废液冷阱，经常倒掉废液。请勿让瓶子装满，这样会造成排出气体通过冷凝液返气泡，从而增加噪音。,排气冷阱及废液的示意图:,ELSD计算机控制软件的使用:,尽量不要使用Temporary Method,有时会造成传送 的方法在ELSD上不执行; 当打开计算机控制软件后,ELSD面板的按钮将被锁定, 不要长时间使用Unlock Keypad,容易造成计算机与ELSD间的通讯故障; 不要用中文名称来命名方法; ELSD具有1,2,4,8,16共5种增益(Gain),从1到16能够增加75%的信噪比(S/N),不过从8增长到16只能增加4%的S/N;,雾化器的结构及清洁程序:,1.气体和液体在雾化器出口处瞬间混合,形成气溶胶; 2.将O形圈取下后放入50:50的甲醇:水溶液中超声10-15分钟; 3. ELSD 2000 诊断窗第二项雾化器气体压力测试，气压过高显示雾化器可能被堵塞,正常情况下在2.0L/min的气流量下应该在20-25PSI以下; 4.雾化器污染会造成信号噪音上升,灵敏度下降,峰尖上分叉等;,漂移管污染的清洁程序:,污染时会造成基线噪音,重复性差等,用手电筒从出口处照入就能看到漂移管的洁净程度; 用附件的长柄毛刷蘸水从出口伸入漂移管小心擦拭管壁,不要损坏撞击器开关; 将ELSD设定为110和2.8L/min的气量后用100%水1.0ml/min的流速冲洗ELSD一小时; 停止流动相保持ELSD温度和气量30分钟,将残余的液体带走;,光路部分的结构及清洁方法:,由光池,光阱,激光光源及前置放大器(包含光电二极管)四部分组成; 光池和光阱表面是完全涂黑的,光池和光阱可以用绸布蘸酒精或水擦拭.光阱中的固体杂质应该去处干净; 激光光源的使用寿命很长,且不会发生衰减,正常的功率值在4.7MV左右; 在不通流动相的时候运行Optics Test,在3-20Mv之内能够通过测试;,ELSD分析结果的定量计算:,1.ELSD的响应遵从散射光的原理,Y=aXn, 在很多范围内是非线性的,采用UV常用的单点外标法计算会有很大误差; 2.可使用两点对数线性法, 在待测样品含量的左右各称取两份对照品,将对照品的峰面积与浓度同时取对数,得到Y=aX+b的直线,将待测样品的峰面积取对数后带入方程,得到的X值的反对数即为所求样品的含量;,ELSD分析结果的定量计算:,3.三点随行二次曲线是指以待测样品为中心，采取高、中、低三个浓度（如80%,100%,120%）的对照品随行实验，以三个浓度对照品进样量与峰面积进行二次曲线拟和，得到随行二次曲线方程，即： Y=ax2+bx+c （1） 其中：Y为峰面积 X 为进样量 （当a=0时，三点成一条直线） 再将供试品峰面积代入（1）式，计算供试品进样量。,ELSD使用的过程中的常见故障:,1.雾化器或漂移管不加热: 可能原因: A.温度过热保险断: a).完全不加温; b).低温能加上去,高温上不去,此情况处于似断非断之间 B.加热器电热丝烧坏 (测量加热器电阻) C.温度热敏传感器坏 (测量热敏电阻) D.使用控制软件的临时方法; 2.通气加温基线有不规则噪声或脉冲: 可能原因:A.气体不纯,可能含有颗粒; B.雾化器或漂移管有微粒脱落;,ELSD使用的过程中的常见故障:,3. 通入流动相后基线有不规则的噪声或脉冲: 可能原因: A.HPLC泵有脉动; B. 流动相中有不挥发的物质; C. 流动相脱气处理的不好,含有空气; D. 色谱柱有固定相脱落; 4.气体的流量上不去,达不到设定值: 可能原因: A.N2钢瓶或压缩机的输出压力不够,应在0.45-0.56MPa之间; B. 从气源到ELSD的气路管有堵塞,首先检查ELSD的入气口是 否正常; C. 操作不当导致流动相进入气路管,比例电磁阀被溶液腐蚀; D. 气体质量流量计需要重新校正或出现故障;,ELSD使用的过程中的常见故障:,5.光学诊断(Optics Test)不通过: 可能原因: A.光池有污染; B. 光阱有污染; C.光池的进出口连接间有污染; D.前置放大器透镜和激光镜片有污染; 6.光池或光阱中有积水: 可能原因: A.检查光池温度控制是否正常; B. 使用高水份流动相时要用高温和气流清扫ELSD后才能 关机; C.停止流动相,用高温和气流清扫30分钟;,ELSD使用的过程中的常见故障:,7.ELSD灵敏度降低: 可能原因: A.激光光源的能量太低或激光头的位置不在正中央; B.漂移管和雾化器有污染需要清洗; C.光电二极管老化; D.前置放大器有受潮漏电的情况; 8.ELSD的峰面积的重复性差: 可能原因: A.检测整个HPLC系统是否正常,分流瓶中是否鼓气泡； B.漂移管和