课件复习资料1(绪论——原理).ppt

微生物代谢控制发酵,（生物工程专业）,Welcome to the study of microbiology!,在新世纪，生命科学研究、生物技术的重大突破。将在医药、农业、环境、能源等领域引发新的产业革命，为解决人类生存与发展面临的健康、资源、环境等重大问题提供强有力的手段。,生物工程专业 20世纪40年代的发酵工学专业 50年代的抗生素制造工学专业 80年代的生物化学工程专业、生物化工专业 90年代发展为生物工程专业 生物工程专业正式设立于1998年，在1998年我国颁布的本科专业目录中，明确生物工程专业属于工学：生物工程包含了原来的生物化工（部分）、微生物制药、生物化学工程（部分）、发酵工程等4个专业。 生物工程专业的相近专业定为应用理学的生物技术专业。因为生物技术专业培养应用研究型人才，而生物工程专业培养应用型工程技术人才，两者的侧重点不同。,生物工程学科的内涵是利用生物体系，应用生物学、化学和工程技术相结合的方法,按照人类的需要改造和设计生物的结构与功能,以便更经济、更有效、大规模地为人类提供所需各种产品的技术，是生物技术成果走向工业化的关键技术。 生物工程学科是以基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程为核心,借助于工程学技术，以生物技术研究成果为对象、实现产业化为基本任务的工学学科。 生物工程广泛应用于化工、医药、食品、农业、能源、资源和环境等领域，近年来发展迅猛。,代谢控制发酵,细胞形态、分类、生理（营养和代谢）,有机物种类、合成、分解。,基因 种类、转录、翻译 调控。,？,Microbiology revolves around two basic themes: basic and applied,Metabolic Control Fermentation,课程性质和任务,性质：学位选修课，24学时，2学分。 任务：使同学掌握利用微生物生产人类所需要的产品的先进调控技术。,课程主要内容和时间安排,第一章 绪论（2） 第二章 微生物代谢调节机制（6） 第三章 微生物代谢控制发酵 （6） 第四章 代谢控制发酵育种的基本技术（4） 第五章 代谢控制发酵的应用（6）,概况,原理,技术,应用,vip_ viplxl,考 核 方 法,平时成绩（20% ） 上课出勤、回答问题、笔记和作业情况。 考试成绩（80% ） 闭卷考试。,教材： 代谢控制发酵 张克旭 主编 中国轻工业出版社 参考教材： 生物化学 魏述众 主编 中国轻工业出版社 途径工程第三代基因工程 张惠展 主编 中国轻工业出版社 现代工业发酵调控学 华东理工大学 储 炬 李友荣 主编 化学工业出版社 微生物生物技术应用微生物学基础原理 科学技术出版社 华中农业大学陈守文 喻子牛等翻译,第一章 绪 论,第一节 发酵工业概况 代表性发酵产品概况：如，酒精、啤酒、酶制剂、有机酸、氨基酸、抗生素、维生素等。 第二节 发酵技术的历史进程 混合菌种发酵阶段；纯种发酵阶段；深层通风发酵阶段；代谢控制发酵阶段；广泛的生物化学工业阶段（生物炼制）。 第三节 微生物代谢概述 微生物细胞代谢的基本概念；细胞代谢的特点；微生物细胞代谢调节的意义；代谢控制发酵理论的发展；代谢控制发酵理论的应用；代谢工程。,第一节 发酵工业概况,发酵：指通过微生物培养，使某种特定代谢产物大量积累的过程。 发酵工程：是基于生物学知识和工程学概念，采用现代生物技术和工程技术手段，利用微生物和动植物细胞的某些特定性状功能，在反应器中为人类生产有用的产品。 掌握生物技术及其产业化的科学原理、工艺过程和工程设计等基础理论，基本技能，能在生物技术与工程领域从事设计、生产、管理和新技术研究、新产品开发的工程技术人才。,菌种选育,发酵工程的内容,过程控制,产品提纯,微生物生物反应器的研究开发，新型发酵装置、生物传感器和使用电子计算机控制的自动化连续发酵的技术； 利用微生物控制或参与工业生产，如采矿、冶金等。,发酵工业：是以粮食和农副产品为主要原料的发酵加工工业。在各产业部门中，年产值已跃居第一位（600/3600多亿元），成为国民经济的主要文柱产业之一。 传统产业主要包括酒精、白酒、啤酒、葡萄酒、淀粉糖、酵母、氨基酸。 现代产业主要包括有机酸、多元醇、酶制剂、核苷酸、维生素、抗生素、生物技术药物、疫苗、诊断试剂等行业。,2006年中国发酵工业主要产品产量,现代发酵工程规模,低值工业品大型化 以规模来取胜（几十数百吨）。如味精、氨基酸、有机酸、抗生素、饲料、食品工业用产品等； 高价值转基因产品小型化（几十数百升）。基因工程大肠杆菌、酵母菌高密度培养；动物细胞植物细胞培养； 研究中心智能化、全能性。,酒精工业的现状,2003年世界乙醇总产量约2500万吨，（历史最高产量为2700万吨）其中美洲产量1650万吨，亚洲442万吨，欧洲380万吨，非洲40万吨，大洋洲16万吨。其中：巴西年产量达1100万吨，美国年产发酵乙醇逾400万吨，俄罗斯年产近100万吨乙醇。 在世界上乙醇的用途以燃料乙醇为主占66%，食用乙醇14%，工业溶剂11%,其它化学工业9%。,2004年我国乙醇实际产量340万吨，生产能力600万吨。 2006年的酒精实际产量571万吨。其中，燃料乙醇占132万吨，用玉米生产的燃料乙醇85万吨。 到目前为止，乙醇生产企业（包括生产车间）已达1000多个，遍及各省市自治区（西藏除外），其中以山东、四川最多。产量居世界第二位。 总体来讲，我国酒精行业发展速度偏快，短期内国内酒精市场供大于求，盈利空间变小，企业生存面临困难。,酒精工业的困难与机遇,乙醇生产原料占总成本的70%以上，原料是企业的生命线 。目前，我国酒精的原料结构相对单一，玉米占总原料的近70%。按3.2吨玉米产1吨酒精计算，每年消耗玉米约1300万吨。 2006年全国玉米产量1.44亿吨，当年全国玉米深加工量3589万吨，玉米价格已达到1660元/吨。进口木薯价格仍保持高价上涨态势 ，原料市场供应紧张 。,一、原料紧张,国家发展和改革委员会 2007年9月发布,乙醇工业在为国民经济做出突出贡献的同时又是一个污染十分严重的行业。现行的乙醇生产工艺所造成的污染以水污染最为严重，生产过程的废水主要来自发酵醪蒸馏乙醇后排除的废糟、生产设备的洗涤水、以及蒸煮、糖化发酵、蒸馏工艺的冷却水等。每生产一吨成品乙醇约排放13-16吨乙醇废糟，乙醇废糟为高浓度有机废水，呈酸性，CODCr高达50000-70000mg/L，是乙醇工业最主要的污染源。,二、污染严重,世界平均水平单位酒精能耗300-400公斤标煤，我国是800公斤。 酒精生产企业在节能、自动化、综合利用和废渣废水治理等方面与先进国家尚有很大差距，从另一个角度说，差距也是潜力。,三、能耗太高,酒精工业技术进步方向,1 、木质纤维素生产酒精,2 、清液发酵技术生产酒精 3、 高浓度发酵技术生产酒精 国外的高浓度酒精发酵是常用的技术，酒精浓度达到14-15%，我国同类工艺尚处于试验阶段，酒精浓度也可达到14%，但相关配套工艺存在问题。 4、 废弃物综合利用技术,啤酒工业情况,2004年啤酒总产量达到2700万吨，超过美国（2400万吨），德国（1250万吨），跃居世界第一。但人均消费量仅为世界平均水平的70%，为欧美等发达国家的1/61/7。 工艺技术，产品质量，市场营销等总体水平与啤酒先进国家仍有一定的差距。,白酒工业情况,1996年白酒产量创历史最高达到800万吨。 2004年450万吨。白酒产量明显下降，主要原因是产业政策、消费习惯、社会节奏加快、健康、驾驶等原因限制了白酒的消费。白酒是民族特色产品，其生产工艺为我国独有，具有民族性。,黄酒工业情况,2003年黄酒产量为130万吨，生产水平居国际领先，有的工艺配方被列为国家无限期秘密。但总的发展趋势缓慢，大厂增产，小厂减产。,葡萄酒工业情况,2004年葡萄酒产量35万吨，主要有张裕，长城，等主要厂家，中国以白葡萄酒、干白葡萄酒、红葡萄酒为主，相对品种单一，生产技术和产品质量与先进国家相比有一定的差距。,酶制剂工业,全年总产量25万吨左右，年销售额7亿元左右。糖化酶 16万吨，技术水平3000035000u/mL，国外最高50000u/mL以上。-淀粉酶4万吨，6000u/mL，大多由国外引进菌种，其中高温淀粉酶占76%左右。蛋白酶5万吨，技术水平2000025000u/mL 主要是洗涤剂用酶，碱性蛋白酶。,其他酶种（小酶种）,小酶种 主要有纤维素酶、凝乳酶、脂肪酶、果胶酶、葡萄糖异构酶等。 国内酶制剂工业的主要困难：（1）技术水平低，产品在价格与质量上不能与国外大型公司的产品相比较，竞争困难。中国的制造成本占销售价的75-80%，国外占销售价的3035%。（2）品种少，产品结构不合理。,国内外工业酶制剂应用领域比较,有机酸工业的产业状况,1 柠檬酸 2003年28万吨，世界柠檬酸90万吨，欧洲约为25万吨，美国23万吨，中国2002年出口21万吨。 技术水平：国内工业产酸水平1216%，国外1820%。 2 衣康酸 2003年，8000吨，大部分出口。工业产酸水平812%，国外产酸水平14%。,有机酸工业状况,3 乳酸 2003年1.3万吨 国内主要是DL型乳酸，L-乳酸有少量生产，工业水平910%，中试水平1214%。 世界乳酸消费量约为1315万吨/年，最近因为PLA的发展，乳酸工业迅猛发展，现在由美国道化学公司和卡吉尔合资（CDP）建设年产量14万吨的PLA工厂。据美国玉米种植协会称，每年用于PLA制造玉米量约为1270万吨，相当于美国用于乙醇生产的玉米量。据报道，美国的L-乳酸的发酵水平约为18%。,4 苹果酸 中国最高年产量100吨。主要以反丁烯二酸为原料，用固定化细胞来转化，投料浓度11.3%，转化率90%以上。发酵法生产水平约为9%左右，但后提取工艺尚未解决。 世界苹果酸的需求量约为2.4万吨，日本市场需要55006000吨/年，主要用于食品加工、化妆品、沐浴剂。直接发酵水平1012%，固定化细胞转化率也为90%左右。,氨基酸工业的产业状况,谷氨酸（味精） 2003年 世界产量120万吨，我国80万吨。技术水平：产酸910%，转化率55-58%。提取收率92%，精制收率95%，总收率87.4%,产酸率12-14%，总收率95%。 2006年，我国味精产量达到170万吨，比2005年提高了25%，出口量达到20多万吨，出口到50多个国家和地区。 世界上味精主要企业有日本的味之素、韩国的CJ集团和大象集团、台湾的味单公司。,我国主要味精生产企业（2006年）,赖氨酸 2006年，我国生产能力达70万吨。产量30万吨。市场需求量约22万吨。 国内技术水平产酸8-10%，转化率35-40%，提取率可达90%。 异亮氨酸 世界产量约为400吨，日本的生产能力约为350万吨。国外最高产酸水平4-5%，我国的实际生产能力已达80万吨，产酸水平2-2.4%转化率25-30%，提取率60%左右。,苯丙氨酸 世界产量8000吨，日本产量2500吨，世界最高产酸水平5-6%。我国的生产能力150吨左右，技术水平：最高产酸3.5%，酶法生产月2.5月桂酸生产1苯丙氨酸。,苏氨酸 2006年，全球饲料中苏氨酸的需求量11万吨/年，中国的需求量2万吨/年。我国的生产能力2万吨左右，产酸水平7-8%，转化率30-35%。,维生素发酵工业的状况,维生素Vc 实际产量3.5万吨，二步发酵技术由我国发明，居世界领先水平。 VB2 实际产量500吨左右，细菌发酵水平为7000mg/L，酵母发酵水平约为4500mg/L。国外细菌发酵水平12-15g/L。医药级收率65%，饲料级收率85%，发酵时间65-72h。 VB12 实际产量4吨左右。国外发酵水平：150-160mg/L;发酵时间168h，医药级收率70%，饲料级收率80%，摇瓶条件200r/min。,-胡萝卜素（-carotane） 年生产能力10吨左右，国外发酵水平2000-2500mg/L发酵时间96-120h晶体产品收率75-80%。我国发酵生产水平1000-1200mg/L，实验室水平：2000mg/L。,微生物多糖与功能性寡糖产业状况,黄原胶（xanthan gum） 我国的实际生产能力达到2.5万吨。世界市场需求3.5万吨左右，国外产糖水平：3.5%,发酵时间48h，转化率70-75%。收率90%。我国的产糖率2.6-3.0%,转化率65-70%。每口油井需要黄原胶3.5吨。主要用途分散剂和食品。,-环状糊精 中国实际产量450万吨，酶法转化率70-75%，收率80-85%。国外品种较齐全，有-、-、-等及其衍生物。 低聚异麦芽糖 中国实际产量1.5万吨，世界产量3万吨左右。 低聚果糖 国内实际生产能力600吨，世界的产量4500吨。固定化细胞转化，转化率在50%以上。,低聚木糖 国内正在建厂生产。以玉米芯和蔗糖渣中的半纤维素为原料用木聚糖水解酶水解而成。国内外工艺一样，但国外应用开发较好，目前世界市场需要400吨，在所有寡聚糖中价格最贵，约2500-3000日元/。,海藻糖（Trehalose） 国内已经生产，国内是从酵母发酵液中提取，以淀粉为原料酶法生产正在研制中。国外两种工艺都存在，均已工业化生产。酶法生产的产量可以大幅度提高，成本低于前者的70倍。,酵母工业,2004年酵母工业总产量约为4.3万吨左右，其中安琪酵母公司3万吨，主要以面包酵母，酿酒活性干酵母为主，药用酵母也呈下降趋势。 但近来食用酵母的开发受到重视。,发酵甘油 中国的发酵甘油技术居国际领先水平，产率达10-12%，最高可以达到14-15%，国内实际生产能力约有2000吨左右，由于受到皂化甘油价格的冲击，世界性发酵甘油都处于缓慢发展中。,木糖醇工业,生物加氢生产木糖醇 国内有两条路线： XyloseXylitol Glucose ArabitolXyluloseXylitol 第一路线已经进入较大规模试验，第二路线正在研究，国外与我国的研究进展基本一致，但更重视以葡萄糖为原料的工艺研究。,核糖工业,D-核糖（D-Ribose） 已有两家工厂生产，能力400吨左右。发酵产糖量6-8%，转化率35-45%，发酵时间60-80h，提取收率75%。D-核糖有多种用途，但目前主要用来作为半合成VB2的原料，从经济角度，它优于目前的VB2发酵法。,第二节 发酵工业的历史进程,发酵工业的历程几乎与中华文明史同步，在史前就有传说 起源阶段 （混合菌种发酵） 纯种发酵 深层通风发酵 代谢控制发酵 广泛的生物化学工业,起源阶段 （混合菌种发酵）,起源阶段 天然发酵（混合菌种发酵），主要产品：以酒类和酿造产品为主，该阶段的特点是人们不清楚发酵机理，只是靠经验相互传授。主要产品黄酒、白酒、酱品、腐乳、干酪等。,纯种发酵- 发酵工业的第一个台阶,知识背景：微生物的发现，纯种培养技术的成熟，产品有酒精、乳酸、丙酮丁醇等。 特点：参与的微生物已经搞清楚，但发酵的机理不清楚。 发酵类型：主要是厌氧发酵。,深层通风发酵 发酵工业的第二个台阶,知识背景：1929年弗莱明发现青霉素，二次大战对青霉素的大量需求。 主要产品 ：抗生素、维生素、有机酸、酶制剂、酵母等。 特点：利用微生物自身代谢的产品，一般为好氧代谢。,代谢控制发酵 发酵工业的第三个台阶,知识背景：生物化学、微生物遗传学及分析分析方法的进步，同位素的使用，对微生物代谢途径的认识。 主要产品：1956年谷氨酸的发酵成功，氨基酸发酵，核苷酸、有机酸发酵等。 特点：人为干预了微生物的代谢。,广泛的生物化学工业 (发酵工业第四个台阶),知识背景：现代生物技术的发展，分子生物学的应用，基因工程、细胞工程、定向育种技术、工程菌株的构建、克隆技术、动植物细胞发酵等知识的应用。产品：氨基酸、有机酸、细胞生长因子、白细胞介素、激素类药物、疫苗、（乙肝酵母科隆疫苗），甚至器官组织等。 克隆在生物进化中，只能通过有性生殖的生物，但以人为干扰的方式产生同质后代的技术。,生物炼制,生物炼制是对应于石油炼制而出现的术语。 生物炼制是以生物质（农业废弃物、油脂、植物基淀粉和木质纤维素材料）为原料，生产各种化学品、可降解材料、燃料和其它生物能源等 。 生物炼制的名词是21世纪才出现的，第一届国际生物炼制大会于2005年在比利时的根特举行。 生物炼制的内涵早已被科学家重视，它的发展将是一个长期的渐进过程，只有在产品质量、价格等方面竞争过石化产品时，才能被市场所接受。,生物炼制目前研究热点,乙二醇、丙二醇、丙三醇（甘油）、1，3-丙二醇 聚乳酸（PLA） 聚丁二酸丁二醇酯，即聚丁烯琥珀酸酯（PBS）,第三节 微生物代谢概述,3.1 细胞代谢的基本概念,代谢的概念（p1）,代谢 （Metabolism）：包括合成代谢和分解代谢 ，是细胞内发生的各种化学反应的总和。 分解代谢（Catabolism）：又称异化作用，是指由复杂的营养物质分解成简单化合物的过程； 合成代谢（Anabolism）：又称同化作用，是指由简单的化合物合成复杂的细胞物质的过程。,初级代谢（primary metabolism）：是微生物产生和生长、繁殖所必需的物质（如蛋白质、核酸等）的过程。 次级代谢（Secondary metabolism）：微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程。,凡能为微生物提供所需C的营养物质,凡能为微生物提供所需N的营养物质,微生物生长不可缺少的微量有机物,无机：CO2、NaHCO3；有机：糖类、脂肪 酸、花生粉饼、 石油等,无机：N2、氨、铵盐、硝酸盐等； 有机：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等。,维生素、氨基酸、碱基、蛋白胨、动植物提取液等,糖类尤其是葡萄糖,铵盐、硝酸盐,维生素,用于构成细胞物质和代谢产物。还可以是异养型微生物的主要能源物质,主要用于合成蛋白质、核酸以及含N的代谢产物,一般是酶和核酸的组成成分,生物反应都在温和的条件下进行，大多为酶所催化； 反应具有顺序性； 具有灵敏的自动调节机制。,3.2 微生物代谢的特点,微生物的生长及代谢,增长不明显,快速增长,活菌数目达到最大（K值）,活菌数目急剧减少,代谢活跃体积增大大量合成初级代谢产物,细胞分裂速率最快个体形态、生理特征较稳定,繁殖速率等于死亡速率细胞内大量积累次级代谢产物，某些细菌可形成芽孢,繁殖速率小于死亡速率菌体出现多种形态（畸形），细胞解体、释放代谢产物,适应新环境,适应了环境后，条件适宜、营养物质充足等,营养物质消耗、有毒代谢产物积累、PH值的变化，种内斗争加剧,生存条件极度恶化，有毒代谢产物积累过，生存斗争最剧烈,长短与菌种、培养条件有关,可作为菌种也可作科研材料,制取代谢产物特别是次级产物,分子水平调控,3.3 微生物代谢调控,Renewable raw materials,Biofuels Biomaterials Chemicals,Cell Factory,细胞水平调控,营养物质、辅助因子、膜的通透性、生长特性,反应器水平调控,3.4 细胞代谢调节的意义（P1）,通过代谢调节，将错综复杂的代谢反应相互制约，使其彼此协调，随着细胞内外条件的变化而调节代谢反应的速率、方向和流量，既不使代谢物积累而造成浪费，也不致因代谢物的缺损而供不应求，保持各种代谢物的浓度相对稳定和动态平衡，使细胞正常生长。,3.5 代谢控制发酵的概念（P2）,发酵：指通过微生物培养，使某种特定代谢产物大量积累的过程。 代谢控制发酵：利用遗传学的方法或其他生物化学的方法，人为地在DNA分子水平上，改变和控制微生物的代谢，使有用目的产物大量生成、积累的发酵。,3.6 代谢控制发酵理论的发展（P2）,1956年，谷氨酸发酵成功后，对生产菌株本身的研究逐渐深入，开始形成了代谢控制发酵技术。 代谢控制发酵理论使发酵由野生型菌株的发酵向高度人为控制的发酵转移，由依赖于微生物分解代谢的发酵向依赖于合成代谢（产物大量积累）的发酵转移。 从随机诱变盲目地挑选高产菌株发展到菌种定向选育。,代谢控制发酵理论发展的基础（P3）,生物化学的发展：代谢途径研究不断深入 微生物遗传学的发展：发现了分解代谢途径的操纵子和合成代谢操纵子的调控机制 分子生物学的发展：通过转导、转化、接合、原生质体融合等方法获得目的重组子，通过DNA重组技术构建工程菌株 设备及工程学的发展：合理控制环境条件、采用过程控制的方法对发酵过程进行最优化控制。,3.7 代谢控制发酵理论的应用（P5）,加速限速步骤的反应速度； 改变分支代谢途径流向； 构建代谢旁路； 改变能量代谢途径； 延伸代谢途径； 构建新的生物合成途径。,分 子 育 种 Kellogg et al,1981,体 外 进 化 Timmis et al,1988,途 径 工 程 MacQuity, 1988 Tong et al,1991,细 胞 工 程 Nerem,1991,代 谢 工 程 Baley, 1991 Stephan et al,1991,代谢工程：,1991，CIT & MIT, Bailey & Stephanopoulos, Science Toward a science of metabolic engineering Network rigidity and metabolic engineering in metabolite overproduction 1996, 第一次国际代谢工程会议召开。,代谢工程是关于代谢途径的分析与修饰的科学 。它是应用分子生物学与反应工程技术不断发展融合的结果，是对细胞（包括微生物、植物、动物、乃至人体细胞）内的代谢途径网络系统分析的基础上进行定向地有目的的改造，以更好的利用细胞代谢进行化学转化、能量转导和超分子组装。,代谢工程的用途：,几乎跨越了生物技术的全部领域，主要包括： 异源蛋白的生产； 扩大底物利用范围； 生产新物质； 对环境有害物质的降解； 提高菌体对环境的适应能力； 阻断或降低副产物的生成； 代谢产品生产速率和生产能力的提高； 植物、动物 代谢工程； 人体和组织 代谢工程。,代谢工程的方法步骤,分析 反应工程技术 确定决定生理状态的参数 阐明代谢网络的控制结构 提出待修饰的靶标 评价修饰后的生化影响,合成 应用分子生物学技术 宿主细胞中新基因的表达 基因的插入、缺失等改造 酶量的调节，内源酶的扩增 酶活性的调节，解除抑制等,代谢工程的实质是：将通量及其控制进行量化的方法与分子生物学技术结合起来，用以执行所建议的基因修饰任务。,代谢工程的核心代谢控制分析（MCA),通过途径中酶的活性、代谢物、效应物和其它参数所施加的通量控制程度进行定量的表述。 代谢工程必须包括实验和理论两种方法来确定细胞的代谢通量。如物质平衡、同位素标记、光谱学方法（如 NMR）、质谱学及联用方法（如GC-MS, LC-MS等）。,第二章 微生物代谢调节机制,第一节 细胞结构在代谢调节中的作用 第二节 酶活性调节机制 第三节 酶量调节机制 第四节 能荷调节及细胞膜透性调节 第五节 分支合成代谢途径的反馈调节模式,微生物是自然界长期进化的产物，它之所以能生存至今，是因为微生物细胞具有为了生存和竞争而进行自身调节的保障机制。 代谢控制发酵的关键，取决于微生物代谢调节机制是否能够被解除，即能否人为地控制微生物的代谢，使有用的目标产物大量生成。,工业发酵是微生物群体活动的动态过程。此过程即伴随异化和同化作用而发生的物质流动；又伴随能量形式的转换而发生的电子流动；还伴随不同水平上的代谢调节而发生的信息流动。,第一节 细胞结构在代谢调节中的作用,细胞内酶的隔离分布,代谢途径有关酶类常常组成多酶体系，分布于细胞的某一区域 。,酶的隔离分布的意义 避免了各种代谢途径互相干扰。,胞质：糖酵解，糖原合成，磷酸成糖途径，脂肪酸合成，部分蛋白质合成,线粒体：脂肪酸氧化，三羧酸循环，呼吸链，氧化磷酸化,细胞核：核酸的合成、修饰,内质网：蛋白质合成，磷脂合成,胞质和线粒体：糖异生，胆固醇合成,溶酶体：多种水解酶,细胞膜的物质转运功能,1单纯扩散(simple diffusion) O2、CO2等脂溶性气体分子，由细胞膜的高浓度一侧向低浓度一侧扩散。 2易化扩散(facilitated diffusion) 不溶于脂质的物质，在膜蛋白的介导下，也能由膜的高浓度一侧向低浓度一侧扩散。 3主动转运(active transport) 物质（分子或离子）由膜的低浓度一侧移向高浓度一侧，由细胞膜上的特殊蛋白质参与，必须由被转运的物质外部（膜或细胞）供给能量。 4出胞（exocytosis）和入胞（endocytosis） 大分子物质或物质团块的跨膜转运。被转运的物质由膜性结构包围后进行转运。Ca2+在物质出胞过程中起重要作用。,第二节 酶活性调节机制,酶（enzyme）是具有生物催化功能的生物大分子。 一类是经典的酶，即由活细胞产生的具有催化功能的蛋白质（P酶） ； 另一类主要是由RNA或DNA组成的核酸酶（R酶） 。 现在已经发现的生物体内存在的酶有近8000种，而且每年都有新酶发现。 迄今数百种酶已达到了均一纯度，大约有200多种酶得到了结晶。,三大营养素,共同中间产物,共同最终代谢通路,三大营养素可在体内氧化供能。,1、微生物代谢体系,由氨基酸合成嘌呤环,甘氨酸,再与R-5-P合成核酸,天冬氨酸 （Asp）,=o,=o,嘧啶环合成的原料,Gln CO2,任一供能物质的代谢占优势，常能抑制和节约其他物质的降解。,例如,从能量供应的角度看，三大营养素可以互相代替，并互相制约。 一般情况下，供能以糖、脂为主，并尽量节约蛋白质的消耗。,primary structure building block secondary structure structure domain tertiary structure subunit quaternary structure,2、“酶” 相关的基本概念,绝大部分酶的化学本质是蛋白质，具有一般蛋白质的结构层次,酶的晶体分析表明酶是链长约为100-2500个氨基酸的蛋白质,酶,活性中心 （多为疏水区）,结构中心 （维持空间结构、决定酶的专一性、参与活性调节、免疫、分子识别等过程）,结合基团,催化基团,Ser His Asp Cys Tyr Glu,酶的作用机制,酸碱催化 共价催化 邻近和定向效应 变形或张力作用 金属离子催化 多元催化,化学,结构,关键酶（key enzyme）,关键酶是参与代谢调节的酶的总称。作为一个反应链的限速因子，对整个反应起限速作用。,代谢途径是一系列酶促反应组成的，其速度及方向由其中的关键酶决定 。,例：糖代谢的关键酶,PRPP的合成,POH2C,OH,OH,OH,O-P-O-P,POH2C,OH,OH,O,O,PRPP合成酶,ATP,AMP,R-5-P PRPP, 速度最慢，它的速度决定整个代谢途径的总速度，故又称其为限速酶(limiting velocity enzymes)。, 催化单向反应不可逆或非平衡反应，它的活性决定整个代谢途径的方向。, 这类酶活性除受底物控制外，还受多种代谢物或效应剂的调节。,关键酶催化的反应具有以下特点：,快速代谢调节,迟缓代谢调节,代谢调节主要是通过对关键酶活性的调节而实现的。,按照酶在代谢调节中的作用不同进行分类（P8-9）：,调节酶：包括变构酶、同工酶、多功能酶 静态酶：一般与代谢调节关系不大 潜在酶：指酶原、非活性型或与抑制剂结合的酶,3、酶活力的调控机制,（1）. 变构调节的概念,小分子化合物与酶分子活性中心以外的某一部位特异结合，引起酶蛋白分子构象变化，从而改变酶的活性，这种调节称为酶的变构调节或别构调节。,关键酶的变构调节,被调节的酶称为变构酶或别构酶 (allosteric enzyme) 使酶发生变构效应的物质，称为变构效应剂 (allosteric effector), 变构激活剂allosteric effector 引起酶活性增加的变构效应剂。 变构抑制剂allosteric effector 引起酶活性降低的变构效应剂。,（2）. 变构调节的机制,变构效应剂：,底物、终产物 其他小分子代谢物,调节酶一般为变构酶，是具有多亚基四级结构的蛋白质，具有两个活性部位（催化部位和变构部位）。,变构效应剂 + 酶的调节亚基,当酶处于T型时，因其调节部位转至聚合体内部而难以与AMP结合，故对AMP不敏感而表现出较高的活性。 在第一个AMP分子与调节部位结合后，T型逐步转变成R型，各亚基构象相继发生改变，调节部位相继暴露，与AMP的亲和力逐步增加，酶的活性逐渐减弱。,果糖-1,6-二磷酸酶的变构调节（疏松和紧密）,Fructose-1，6-disphosphate,乙酰CoA羧化酶，它是脂肪酸合成过程中的关键酶。 它的每个亚基有不同的功能，分别是：生物素载体蛋白，它能结合辅基生物素；生物素羧化酶，它能催化生物素发生羧化反应；羧基转移酶，它能将生物素上的羧基转移给乙酰CoA形成丙二酰CoA；调节亚基，它能与柠檬酸或异柠檬酸结合，使原聚体聚合为多聚体。,乙酰CoA羧化酶的变构调节（酶分子多聚化）,由四种不同亚基构成的原聚体,多聚体催化活性，ATPMg2+可使多聚体解聚为原聚体而使酶失活。长链脂酰-CoA可拮抗柠檬酸的促聚合作用，因此，它们都是该酶的变构抑制剂。,调节酶一般为变构酶，是具有多亚基四级结构的蛋白质，具有两个活性部位（催化部位和变构部位）。,天冬氨酸转氨甲酰酶 ATCase Aspartate transcarbamoylase,（3）. 变构调节的特点,来自E.coli的天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase）是研究得最多的一个调节酶 它提供了一个生物合成途径的调节中别构反馈抑制的最好的一个例子 Arthur Pardee等人发现ATCase的一个最有效的抑制剂是代谢途径的终产物胞嘧啶三磷酸（CTP） 当CTP水平高时，CTP与ATCase结合，降低CTP合成的速度，反之当细胞内CTP水平低时，CTP从ATCase上解离，加快CTP合成速度。他们还发现ATP是酶的别构激活剂。,a regulatory subunit with CTP bound (the right-hand image) and without CTP (the left-hand image).,调节酶的反应速度与底物浓度（或变构抑制剂浓度）的关系曲线呈S型，有协同性，存在有底物或效应物对反应速度发生影响的阈值。,调节酶多处在合成代谢途径上，而且一般在代谢途径的第一步或分支点上，多受终产物的反馈抑制。 中间产物不影响调节酶的活力。 调节酶后面酶的活性对最终产物是不敏感的。,变构酶具有脱敏作用，即经特定处理后，不丧失酶活性而失去对变构效应物的敏感性。此时，一般发生了变构酶解聚或结构基因突变。 调节酶与负效应剂非共价结合而引起的变构作用，对酶活性的控制是一种快速、敏感和高效的调节方式。,（4）. 变构调节的生理意义, 代谢终产物反馈抑制 (feedback inhibition) 反应途径中的酶，使代谢物不致生成过多。,变构调节使能量得以有效利用，不致浪费。,变构调节使不同的代谢途径相互协调。,酶的化学修饰调节,1. 化学修饰的概念,酶蛋白肽链上某些残基在酶的催化下发生可逆的共价修饰(covalent modification)，从而引起酶活性改变，这种调节称为酶的化学修饰。,2. 化学修饰的主要方式,磷酸化 - - - 去磷酸,乙酰化 - - - 脱乙酰,甲基化 - - - 去甲基,腺苷化 - - - 脱腺苷,SH 与 S S 互变,酶的磷酸化与脱磷酸化,Examples of covalent modification,Protein phosphotases,Reverse the effects of kinases, catalyze hydrolytic removal of phosphoryl groups attached to proteins,3. 化学修饰的特点,酶蛋白的共价修饰是可逆的酶促反应，在不同酶的作用下，酶蛋白的活性状态可互相转变。催化互变反应的酶在体内可受调节因素如激素的调控。 具有放大效应，效率较变构调节高。 磷酸化与脱磷酸是最常见的方式。,同一个酶可以同时受变构调节和化学修饰调节。,丙酮酸脱氢酶的磷酸化共价修饰,例 1 丙酮酸脱氢酶,例2 谷氨酰胺合成酶,图,2,-,35,通过共价修饰对,GlnS,调节的机制,ATase,-,腺苷酰基转移酶；,UTase,-,尿苷酰基转移酶；,UR,-,脱尿苷酰基酶；,?,-,KG,1,和,Gln,1,分别表示,?,-,KG,和,Gln,对酶的抑制作用,例3，胶质红假单胞菌中的柠檬酸裂解酶(CL)也是一种共价调节酶,图,2,-,36,共价调节酶,酶的可逆共价修饰的作用：,（1）因酶构型的转换是由酶催化的，故可在很短时间内经信号启动，触发生成大量有活性的酶（或改变酶的活性）有效控制细胞的生理代谢。 （2）这种修饰作用可更容易控制酶的活性的响应代谢环境的变化，这系统有能随时响应的特性，经常处于活化与钝化状态之间的来回变换。,6H,2,O,6HAc,脱乙酰基酶,Glu,I,AcS,-,CL,Hs,-,CL,无活性,柠檬酸,连接酶,连接酶,（有活性）,（无活性）,6AMP+6PPi,ATP+6HAc,潜在酶的激活,调节酶：包括变构酶、同工酶、多功能酶 静态酶：一般与代谢调节关系不大 潜在酶：指酶原、非活性型或与抑制剂结合的酶,通过辅酶水平的活性调节,辅酶是一些小分子有机化合物，主要参与酶的催化过程，在反应中传递电子、质子或一些基团，多为维生素。 与酶结合紧密的辅酶成为辅基，与酶结合疏松的为辅底物。,辅酶在酶促反应中的作用特点,辅酶在催化反应过程中，直接参加了反应。 每一种辅酶都具有特殊的功能，可以特定地催化某一类型的反应。 同一种辅酶可以和多种不同的酶蛋白结合形成不同的全酶。 一般来说，全酶中的辅酶决定了酶所催化的类型（反应专一性），而酶蛋白则决定了所催化的底物类型（底物专一性）。,水溶性维生素与辅酶,大多数辅酶的前体主要是水溶性 B 族维生素。许多维生素的生理功能与辅酶的作用密切相关。,1、嘧啶环中的两个氮原子来自（ ） A. 谷氨酰胺 B谷氨酸和氨基甲酰磷酸 C. 谷氨酰胺和天冬酰胺 D. 天冬氨酸和氨基甲酰磷酸 E. 谷氨酰胺和谷氨酸 2、羧化酶的辅酶含（ ） A. 生物素 B. 硫胺素 C. 核黄素 D. 尼克酰胺 E. 叶酸 3、下列（ ）可促进可逆的酶促反应 A. 己糖激酶 B. 磷酸果糖激酶 C. 磷酸甘油磷酸激酶 D. 丙酮酸激酶 E. 糖原磷酸化酶 4、下列关于酶的磷酸化叙述错误的是（ ） A. 磷酸化和去磷酸化都是酶促反应 B. 磷酸化或去磷酸化可伴有亚基聚合和解聚 C. 磷酸化只能使酶变为有活性的形式 D. 磷酸化反应消耗ATP E. 磷酸化发生在酶的特定部位。 5、常见的酶活性中心的必需基团有( ) A. 半胱氨酸和胱氨酸的巯基 B. 组氨酸的咪唑基 C谷氨酸、天冬氨酸的侧链羧基 D苏氨酸的羟基 E. 丝氨酸的羟基,A,C,C,BE,C,第二章 微生物代谢调节机制,第一节 细胞结构在代谢调节中的作用 第二节 酶活性调节机制 第三节 酶量调节机制 第四节 分支合成代谢途径的调节模式 第五节 能荷调节及细胞膜透性调节,本次课程主要内容,酶量调节原理； 操纵子的概念和类型； 操纵子调控机理举例； 二次生长现象； 降解物阻遏和CRP正调机制； 真核细胞的酶量调节。,一、酶量调节原理 基本概念,酶量的调节，指微生物合成酶的数量的调节。在微生物生物合成体系中，代谢产物常常抑制或者诱导酶的生物合成，这种酶的数量调节的方式又称为酶合成调控。 由代谢终产物抑制酶合成的负反馈作用称为反馈阻遏（feedback repression），反之，正反馈称为酶诱导作用（induction）。,酶量的调节是通过控制酶基因的生物合成来进行的 基因（Gene）：是一段编码蛋白质多肽链和功能RNA的DNA。 基因组(genome)：一个细胞或病毒所携带的全部遗传信息或整套基因。,基因经过转录、翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子的过程。基因表达是受调控的。,* 基因表达(gene expression),基因表达的规律,1、时间特异性或发育阶段特异性,2、空间特异性或组织细胞特异性,基因表达伴随时间顺序所表现出的这种分布差异，实际上是由细胞在器官的分布决定的，所以空间特异性又称细胞或组织特异性(cell or tissue specificity)。,在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现，称之为基因表达的空间特异性(spatial specificity)。,基因表达的方式,按对刺激的反应性，基因表达的方式分为：,1.组成性表达,某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达，基本不受环境因素的影响，通常被称为管家基因(housekeeping gene)。,无论表达水平高低，管家基因较少受环境因素影响，而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。区别于其他基因，这类基因表达被视为组成性基因表达(constitutive gene expression)。,2.可诱导和可阻遏表达,在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因称为可诱导基因。,可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导(induction)。,如果基因对环境信号应答是被抑制，这种基因是可阻遏基因。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏(repression)。,在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无论其为何种表达方式，均需协调一致、共同表达，即为协调表达(coordinate expression)，这种调节称为协调调节(coordinate regulation)。,基因表达调节的基本原理,1、基因表达的多级调控,基因激活,转录水平 转录后加工 mRNA降解,基因表达可在多层次上受到调节,2、基因转录调节基本要素,基因表达的调节与基因的结构、性质，生物个体或细胞所处的内、外环境，以及细胞内所存在的转录调节蛋白有关。,三个基本要素： 1）特异的DNA调节序列 2）调节蛋白 3）RNA聚合酶,酶量的调节,诱导,阻遏,例如：葡萄糖效应,例如：乳糖操纵子,例如：色氨酸操纵子,二、操纵子的概念和举例 （原核生物基因转录调节）,Regulation of Prokaryotic Gene Transcription,1、因子决定RNA聚合酶识别特异性,2、主要通过操纵子模式进行调节,3、阻遏蛋白对转录的抑制作用（阻遏机制）是普遍存在的负调控作用,存在于原核生物中的一种主要的调控模式是操纵子（operon）调控模式，该模式也见于低等真核生物中。 所谓操纵子（operon）是指原核生物基因组的一个表达调控序列，长度约1000bp左右，由若干结构基因串联在一起，其表达受到同一调控系统的调控。,典型的操纵子可分为控制区和信息区两部分。控制区由各种调控基因所组成，而信息区则由若干结构基因串联在一起构成。,（1）酶合成的诱导作用：,在细菌中普通存在，如大肠杆菌可利用多种糖作为碳源，当用乳糖作为唯一碳源时，开始细菌不能利用乳糖，但23分钟后就合成了与乳糖代谢有关的三种酶,（1）半乳糖苷酶：水解乳糖的酶，使乳糖水解成 半乳糖和葡萄糖,（2）-半乳糖透性酶：促使乳糖通过细胞膜。,（3）-半乳糖苷转乙酰基酶（硫代半乳糖苷转乙酰酶）：这酶的功能不清，可能是将不能代谢的乳糖类似物乙酰化，并将它们排出体外。,乳糖究竟如何诱导了这三种酶的合成呢？,1961年法国Monod和Jacob提出了著名的乳糖操纵子(lactose operon）模型，这模型的提出犹如当年Watson和Crick发现DNA双螺旋模型一样，受到人们的重视，人们把它看作生物学的第二个里程碑。,这里乳糖是诱导物、诱导了这三种酶的合成，这三种酶就是诱导酶。,乳糖操纵子调节机制,1、乳糖操纵子(lac operon)的结构与组成,乳糖操纵子模型的基本要点：,一群功能相关的结构基因相邻，并且共同受同一个操纵基因和启动子所控制。,一群功能相关的结构基因（structural gene）和操纵基因（operator）、启动子（promoter）组成了一个操纵子(operon) 。,为什么称它们为一个操纵子呢？因为它们又共同受一个调节基 因（regulator gene）所调节。,乳糖代谢基因表达调控 （环境中没有乳糖时的基因状态）,乳糖代谢基因表达调控 （环境中具有乳糖时的基因状态）,（2）酶合成的阻遏作用,最终产物的阻遏：,以E.Coli Trp操纵子为例，Trp操纵子含有5个结构基因，它们编码的酶蛋白催化分支酸转变为Trp，Trp是辅助遏物（corepressor）。,色氨酸 合成 Trp 操纵子,色氨酸操纵子（trp operon）属于阻遏型操纵子，主要参与调控一系列用于色氨酸合成代谢的酶蛋白的转录合成。当细胞内缺乏色氨酸时，此操纵子开放，而当细胞内合成的色氨酸过多时，此操纵子被关闭。 色氨酸操纵子的调控机制与乳糖操纵子类似，但通常情况下，操纵子处于开放状态，其辅阻遏蛋白不能与操纵基因结合而阻遏转录。 而当色氨酸合成过多时，色氨酸作为辅阻遏物与辅阻遏蛋白结合而形成阻遏蛋白，后者与操纵基因结合而使基因转录关闭。,酶合成的阻遏作用,Trp 高时,Trp 低时,mRNA,O,P,trpR,调节区,结构基因,RNA聚合酶,RNA聚合酶,?,1、色氨酸操纵子（转录衰减作用）,色氨酸操纵子,色氨酸操纵子转录衰减(attenuation)机制：即在色氨酸操纵子第一个结构基因与启动基因之间存在有一衰减区域，当细胞内色氨酸酸浓度很高时，通过与转录相偶联的翻译过程，形成一个衰减子结构，使RNA聚合酶从DNA上脱落，导致转录终止。,前导序列,第10、11密码子为trp密码子,14aa前导肽编码区:,包含序列1,形成发夹结构,UUUU 3,前导肽,前导mRNA,1.当色氨酸浓度高时,转录衰减机制,衰减子结构 就是终止子 可使转录,RNA聚合酶,终止,前导肽,前导mRNA,RNA聚合酶,2.当色氨酸浓度低时,Trp合成酶系相关 结构基因被转录,序列3、4不能形成衰减子结构,分解代谢产物的阻遏：,在基质中当同时存在多种分解代谢物时，某些酶的合成往往被容易分解利用的碳源（如葡萄糖）所阻遏。