组培第一章讲课稿.ppt

植物组织培养技术,陈 芳 Tel:课程设置,植物组织培养技术 Plant Tissue Culture Technology 本课程是一门学科基础选修课，第6学期上课。 课程总学时数：32，学分：2.0；。 其中：理论教学16学时，分8章讲授； 实践训练16学时，有5次综合性实践训练。,课程简介,植物组织培养是以植物细胞、组织、器官为研究对象，运用工程学原理，利用人工培养基按照预定目标，对植物的器官、组织、细胞和原生质体进行培养，改变生物学性状，生产生物产品，为人类生产和生活服务的一门综合性技术科学，也是现代生物技术的核心技术之一。 它的主要研究内容是研究在无菌及离体条件下，细胞、组织、器官所需 营养条件和环境条件；细胞、组织、器官的形态发育规律，植物材料的 快速大量繁殖方法；原生质体融合方法与机理；再生个体的遗传变异； 种质资源的离体保存机理与方法，通过植物细胞工程实现对植物的遗传 改造，创造新的生物种质，为人类造福。,教学要求,1.考勤纪律要求 学生务必上完所有课时，不准请假，否则取消考试资格。 注意仪表，不准开手机、否则驱逐出教室，计旷课。 2.作业：理论课后留有作业，实验课后写实验报告。 3.考核 平时成绩占30%：包括课堂考勤表现；课后作业、实验报告； 期末考试占70%。,教材及参考书,教材名称： 植物组织培养教程李浚明编译 中国农业大学出版社2005 推荐参考书： 1.谭文澄 观赏植物组织培养中国林业出版社1992 2.曹孜义、刘国民 实用植物组织培养技术教程（修订本）甘肃科学技术出版社1999 3. 谢从华、柳俊主编 植物细胞工程 高等教育出版社 2005 4. 植物生理学通讯植物组织培养栏目,最新网络资源,1.中国组培网： 2.中国植物组织培养培网：/plantculture 3.中国植物组织培养网： 4.浙江省农科院植物组培中心： 5.北京市海淀区植物组织培养技术实验室：,第一章 绪 论,1.植物组织培养的一般概念(重点) 2.植物组织培养发展简史(一般了解) 3.植物组织培养技术的应用(了解) 4.植物组织培养技术在农业上的应用(了解),1.植物组织培养的一般概念,主要内容 植物组织培养的定义 植物组织培养的分类,狭义概念,广义概念,有何区别？,1936年White提出，指分离一个或数个体细胞，分离植物体的一部分在无菌试管的适当条件下培养的技术,指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，使其长成完整的植株，统称为植物组织培养,1.1 植物组织培养的定义,广义和狭义概念有何区别？,组培范围不同，即外植体范围不同。,广义组培,狭义组培,与组织培养有关的几个概念,外植体（Explants）： 由活植物体上切取下来的可以用于组织培养的组织或器官。 愈伤组织（callus）： 原是指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞。 在组织培养中，指在人工培养基上由外植体上形成的一团无 序生长状态的薄壁细胞。,外植体:由活植物体上切取下来的可以用于组织培养的材料。,胚轴,花粉,胚乳,胚,种子,果实,花器,叶,芽,茎,根,组织,原生质体,子叶,子房,苞片,胚珠,花药,花梗,分生组织,成熟组织,花托,叶柄,幼苗,愈伤组织,植物组织培养的具体涵义, 组织培养的主要过程都是在无菌的条件下进行的，外植体、 培养基和培养容器等都必须经过灭菌处理，各项操作都须在无 菌环境中进行的。 组织培养在多数情况下是利用成分完全确定的人工培养基进 行的，因此植物材料处于异养状态。 组织培养的起始材料可以是植物的器官、组织，也可以是单 个的细胞以及原生质体，它们都处于离体状态下。, 组织培养的目的是最终实现细胞的全能性，在离体培养条件下再生成为完整植株。 组织培养物通过连续继代培养可以不断增殖，形成克隆；通过改变培养基成分，特别是其中激素的种类和配比，还可调控培养物的状态和发育方向，达到不同的实验目的。因此，植物激素或植物生长调节物质在组织培养中起着至关重要的作用。,植物组织培养的具体涵义, 组织培养是在封闭的容器中进行的，容器内气体和环境气 体通过瓶塞或其他封口材料可以进行交换，但水分不易散 失，容器内的相对湿度通常情况下几乎是100%，因此组培苗 叶片表面一般都缺乏角质层或蜡质层，而且气孔保卫细胞不 具正常功能，气孔始终都是张开的。 组织培养中的环境温度、光照强度和光照时间等都是人工 设定的，找出这些物理因素的最适参数对于组织培养的成功 也很重要。,植物组织培养的具体涵义,植物组织培养(tissue culture)技术,1.2 植物组织培养的分类 -根据培养基状态分类,根据培养材料分类,各类培养方法的基本概念,A 植株培养：培养幼苗或较大的植物体。即通常的试管小植株培养,如从植株到植株的继代繁殖。 B 胚胎培养：培养成熟以及未成熟的离体胚。包括胚、胚乳、胚珠和子房等培养。 C 器官培养：培养植物的根尖、茎尖、叶片、茎段、花器部分、果实。 D 细胞培养：培养分散的细胞或小的细胞团。 E 原生质体培养：培养去除细胞壁、裸露的原生质体。 F 愈伤组织培养：即经植物各种外植体培养形成的愈伤组织培养，最为常见的组织培养为愈伤组织培养。,植株培养,扦 插 苗 培 养,种 子 苗 培 养,组织培养,分生组织培养,薄壁组织培养,输导组织培养,器官培养,离体根培养,茎尖和茎段培养,离体叶培养,花器培养,果实培养,种子培养,胚胎培养,胚乳培养,原胚培养,胚珠培养,种胚培养,细胞培养,看护培养,平板培养,微室培养,悬浮培养,细胞培养方法的基本概念,单细胞培养：用机械法或酶解法由完整的植物器官分离和培养单细胞，使 其产生完整的植株的组织培养方法。主要培养方法如下： A 平板培养：最常用的单细胞培养法。 B 看护培养：是一种把单个细胞置于一块活跃生长的愈伤组织上进行培养， 愈伤组织和培养的细胞之间，有一片滤纸相隔的单细胞培养方法。 C 微室培养：是一种单细胞培养方法，用条件培养基代替看护培养基，将细 胞置于微室中进行培养。 悬浮培养：一种在受到不断搅动或摇动的液体培养基里，培养单细胞及小 细胞团的组织培养系统。,根据培养目的分类,脱毒繁殖,微体快繁,试管嫁接,试管育种,根据培养过程分：,初代培养（Primary culture）：指外植体的最初培养。 继代培养（Subculture）：将初代培养得到的培养体移植于新 鲜培养基中这种反复多次移植的培养，称为继代培养。,根据培养基的作用及培养条件分类,1.根据培养基的作用分为： 1).诱导培养； 2).增殖培养；3).生根培养 2.根据培养条件分为： 1）光培养；2）暗培养,2.植物组织培养发展简史,植物组织培养这门学科的研究开始于德国著名植物生理学 家G.Haberlandt ，至今已有100年的历史，学科的基础是在施 莱登(M.J.Schleiden)和施旺(T.Schwann)创立的细胞学说，大致 经历3个阶段: 2.1 植物组织培养的探索阶段 2.2 植物组织培养的奠基阶段 2.3 植物组织培养的迅速发展及逐步实用化阶段,2.1 植物组织培养的探索阶段 (20世纪初-20世纪30年代),在这一阶段中，细胞学说的产生和细胞全能性学说的提出为植物组织培养技术的产生奠定了理论基础，在这些理论的指导下所开展的有关实验，为其建立进行了有益的探索。 细胞学说: 细胞是有机体，亦是生物体的基本结构单位，由它构成整个生物个体。同时植物细胞又是在生理和发育上具有潜在全能性的功能单位。如果具有与有机体内一样的条件时，每个细胞应该可以独立生活和发展。（Schleiden 和 Schwann分别与1838年和1839年提出的） 细胞全能性学说：高等植物的组织和器官可以不断分割，直到单个细胞。如果每个细胞都有植物个体一样的性质和能力，那么，可以通过植物细胞培养使单个细胞发育成为一个新个体。（1902年德国著名植物生理学家G.Haberlandt提出，他本人被誉为“植物组织培养之父”。）,探索阶段- Haberlandt,观点：高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞 贡献：提出细胞全能性，首次进行离体细胞培养， 发表了植物组织培养的第一篇论文植物离体细胞 培养实验，提出了胚囊液在组织培养中的作用和 看护培养法等可行性的预见。 实验：小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青 属表皮细胞的离体培养。 培养基：Knop+蔗糖 细胞 无分裂 培养失败的原因： 取材不当：细胞高度分化 培养基中无生长激素,Haberlandt,我愿意指出：在我的培养实 验中，虽然经常观察到细胞的明 显生长，但从未观察到细胞分 裂。发现单细胞培养的条件，将 是未来培养试验的难题。在未 来，人们可以成功地从营养细胞 培养出人工胚。,关于植物离体单细胞培养实验,Haberlandt,探索性的实验,1904年：德国植物胚胎学家汉宁（E.Hanning)在无机盐和蔗糖溶液中培 养萝卜和辣根菜的胚，并使其在离体条件下发育成熟，得到植株，首次获得 胚培养成功，发表胚培养的第一篇论文 1922年：Knudson采用胚培养法获得兰花幼苗，克服其种子发芽困难的 问题。 1925年：Laibach亚麻种间杂交幼胚培养得到杂种，从而证明了胚培养在 植物远缘杂交中利用的可能性,1933年：我国李继侗等进行银杏离体胚培养，获得了3mm以上大小的 胚，即可正常生长成小植株，并发现胚乳提取物能促进银杏离体胚的生长， 为后人利用植物组织提取液促进培养物生长提供了实验根据。 1922年，美国的Robbins和德国的Kotte分别报道培养离体根尖获得某些 成功，这是有关在无菌条件下进行器官培养的最早实验 小结：在这一时期，一些植物的幼胚培养获得了成功，离体器官培养有 了一定进展。,2.2 植物组织培养的奠基阶段 (20世纪30年代-60年代末),作为一门技术，它必须具有一定的程序性，即它具有一定的技术模式。在这个时期，植物组织培养建立了两个与培养技术有关的重要模式:一是培养基模式，二是激素调控模式。它们的建立是许多科学家长期研究的结果。其中具有重要影响的代表人物和实验分述于下。,两个重要发现：,20世纪30年代中期，在植物组织培养领域有两个重要发现： 认识了B族维生素对植物生长的重要意义； 发现了生长素是一种天然的生长调节物质。 导致这两个发现的主要是White和Gautheret的实验。,20世纪30年代培养基模式和组培方法的建立,1934年：White（怀特，美国）培养番茄根尖建立了无性繁殖系，获得了 离体根培养的真正成功。 1937年，他又发现3种B族维生素对离体根生长的 重要作用。 1939年：White培养烟草种间杂种幼茎切段原形成层成功。怀 特研制出了White培养基。 1934年：Gautherete（高斯雷特，法国）培养山毛杨、黑杨形成层组织产 生了愈伤组织(Callus)，发现了生长素IAA的促进作用。 1939年，培养胡萝 卜根小外植体成功。 1939年：Nobecourt（诺必考特，法国）培养胡萝卜根和马铃薯块茎薄壁组 织成功。,植物组织培养的奠基人,Gautherete， White和Nobecourt一起被誉为植物组织培养的奠基人。 他们的贡献在于：建立了植物组织培养的综合培养基，它包括无机盐、 有机物和生长激素，发现了B族维生素在组织培养中的作用，基本建立了植 物组织培养技术。我们现在所用的若干培养方法和培养基，原则上都是这3 位科学家所建立的方法和培养基的演变。 1943年，white 提出了植物细胞“全能性”学说，并出版了植物组织培 养手册，从而使植物组织培养为一门新兴学科。，,组织培养的奠基人,研究的主要内容:利用嘌呤类物质处理烟草髓愈伤组织以控制组织的 生长和芽的形成 Skoog(1944)和崔瀓等(1951)培养烟草时，发现腺嘌呤或腺苷不但可 以促进愈伤组织的生长，还可解除生长素对芽生长的抑制作用，诱导芽的 形成，确定腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一腺 嘌呤生长素：比值高，生芽；低，生根；相等，不分化。 20世纪40年代，组织培养技术的另一项发展是：Overbeek等(1941) 受次把椰子汁作为补加物引入到培养基中，使曼佗罗的心形期幼胚能够 离体培养至成熟证明椰子汁在植物幼胚培养中的有效性.,20世纪40年代-50年代初,20世纪50年代-60年代中期：,植物组织培养引人注目的进展（细胞全能性的证实阶段): 1952年，Morel和Martin首次证实，通过茎尖分生组织的离体培养，可以 由已受病毒侵染的大丽花中获得无病毒植株。 1953-1954年，Muir进行单细胞培养获得初步成功。 1955年，Miller等由鲱鱼精子DNA中分离出一种首次为人所知的细胞分裂 素，并把它定名为激动素(Kinetin) 1957年，Skoog和Miller提出了有关植物激素控制器官形成的概念，即根芽 控制理论。即激素调控模式的建立。,1958年，Steward（施图尔德，英国）等以胡萝卜为材料，在胡萝卜愈伤组 织和细胞培养中诱导产生了胚状体，并发育成完整植株，首次通过实验证 实了Haberlandt关于细胞全能性的设想，成为了植物组织研究历史中的一 个里程碑。 1958年，Wickson和Thimana指出，应用外源细胞分裂素可促成在顶芽存 在的情况下处于休眠状态的腋芽的生长。 1960年， Morel培养兰花茎尖成功，实现了快速繁殖和去病毒的目的，该 方法繁殖系数极高，导致“兰花工业”的兴起，证实了植株再生的第四种方 式原球茎型。,细胞全能性的证实,细胞全能性的证实,1960年，Cocking等人用真菌纤维素酶分离原生质体获得成功。 1964年，Guha和Maheshwari报道，在毛曼佗罗中通过离体花药培养由花粉 诱导得到了单倍体植株。 1967年，Bourgin和Nitisch通过花药培养获得了完整的烟草植株。 1972年，Carlson通过两个种的烟草原生质体融合培养，获得了第一个体细 胞杂交的杂种植株。,小结,综上所述，在这一发展阶段中，通过对培养条件和培养 基成分的广泛研究。特别是对B族维生素、生长素和细胞分裂 素在组织培养中作用的研究，已经实现了对离体细胞生长和 分化的控制，从而初步确立了组织培养的技术体系，并首次 用实验证明了细胞全能性的设想，为以后的发展奠定了基础。,2.3 植物组织培养的迅速发展 和逐步实用化阶段(20世纪70年代至现在),20世纪70年代以来组织培养理论、实践、技术和方法不断完善和发展，形成独具特色的专业技术. 在实验技术上建立了较完整的实验程序，已成为一种重要和精细的实验技术。 组织培养已广泛应用于生物学的许多分支学科，并取得丰硕的成果。,在这一阶段，组织培养技术的发展概括起来可以分为 5个方面： (1)原生质体培养取得重大突破； (2)细胞融合技术应运而生； (3)花药培养取得显著成绩； (4)离体快繁和脱毒技术得到广泛应用； (5)与分子生物学联姻，产生了转基因育种技术。,本阶段组织培养技术发展的五个方面,小结,植物组织培养的历史就是植物细胞全能性理论提出、证明 和得到广泛应用的历史。植物组织培养在技术上的发展，主要 特点概括为： a. 研究材料范围逐步扩大； b. 培养方法逐步完善； c. 培养基不断改进； d. 实验手段逐步完备。,在我国,1.早在20世纪30年代，李继侗等进行银杏离体胚培养，获得了 3mm以上大小的胚，即可正常生长成小植株，并发现培养基中 加入胚乳提取物能促进银杏离体胚的生长，为后人利用植物组 织提取液促进培养物生长提供了实验根据。 2.罗宗洛等对玉米根尖培养成功。 3.罗士韦将菟丝子茎尖培养成功并在试管内开花。,3.植物组织培养技术的应用,3.1 在植物育种上的应用 3.2 种苗脱病毒及快速繁殖 3.3 细胞培养生产有用次生产物 3.4 在细胞生物学和发育生物学研究中的应用 3.5 在植物遗传、生理生化及植物病理等基础研究中的应用,3.1 在植物育种上的应用,将常规植物育种技术与植物组织培养技术相结合，可以获得常规技术 难以获得或无法获得的种质材料，缩短育种周期，提高育种效率。 主要应用如下： a. 快速获得特殊倍性材料; b. 克服远缘杂交不亲和； c. 克服杂种胚早期夭折； d. 导入外缘基因； e. 突变体筛选； f. 种质资源保存.,具体内容：,采用花药和花粉培养可以很快获得单倍体。单倍体经过加倍即可获得纯 合材料，从而缩短了育种周期。利用胚乳培养技术可以获得三倍体，用于 瓜、果植物果实无核育种。 采用原生质体融合技术可以获得亲缘关系很远的两亲本之间的细胞杂 种，克服远缘杂交的不亲和，并有可能创造新物种。 利用幼胚培养技术可以克服杂种胚的早期夭折。 应用细胞工程技术进行细胞器转移、基因转移、染色体转移等，实现外 源基因的导入。 利用细胞培养和原生质体培养中自发的各种遗传变异，进行人工的定向 诱变，完成有益的突变体筛选。 采用组织培养技术保存植物种质，节约人力、物力和耕地，且避免不可 预测因素对种质资源造成的损失。,3.2 种苗脱病毒及快速繁殖,这是目前植物组织培养应用最多，最广泛和最有效的一个 方面。植物病毒是引起无性繁殖作物品种退化的主要因素，主 要进行茎尖培养脱除病毒。对于脱毒苗，新育成、新引进、稀 缺良种、优良单株，濒危植物和基因工程植株等可通过离体快 速繁殖，同时可不受地区、气候的影响，比常规方法快数万倍 到数百万倍的速度扩大繁殖，及时提供大量优质种薯和种苗。,植物离体快繁的实际的应用,有以下几个方面： 良种快繁,新育成的、新引进的、新发现的稀缺良种的快繁； 少量脱毒良种苗的快繁和无病毒苗大量快繁； 特殊育种材料快繁； 制种材料的快速繁殖； 基因工程植株的快繁； 自然和人工诱导有用突变体的快繁； 离体保存种质的快繁; 濒危植物的离体快繁。,实 例,实例1: Morel(1960)提出的离体无性繁殖兰花的方法很快被兰 花生产者所采用，迅速建立起“兰花工业”，用这种方法繁殖 的兰花至少已有35个属150余种 实例2: 马铃薯茎尖脱毒，无毒种苗和微型脱毒种薯已在马铃 薯生产国广泛应用，根本上解决了马铃薯的退化。,3.3 细胞培养生产有用次生产物,利用植物组织或细胞大规模培养，以合成人类需要的天然有机物，通过 细胞培养的植物种类已达100多种，所能鉴别的有用成分超过300种。 这些有用次生产物，如药用植物中的有效成分，香料植物中的香精，以 及工业生产中重要的一些次生产物和初生产物，有些已投入工业化生产，预 计今后将有更大发展。 利用植物生产有用次生产物具有广阔的应用前景： 首先，节约大量耕地； 另外，保护生态环境，提高生产效率。,目前已取得的进展,Arregain 和bonner在1950年首先进行了培养橡胶茎愈伤组织获取橡胶的尝试，近50年来飞速的发展，从400多种植物培养细胞中分离到600多种次级代谢产物，其中60多种在含量上超过或等于其原植物，20多种以上干重超过1%。 在日本，人参细胞培养已达130600L发酵罐；德国用1000L发酵罐培养毛地黄细胞；在我国，人参细胞培养也已实现产业化。 利用培养细胞的生物转化能力生产高值化合物，德国科学家进行了出色地研究。他们在毛地黄细胞的培养中加入生物合成途径的中间化合物毛地黄毒素和-甲基毛地黄毒素，培养细胞几乎以100%的转化速率使之羟基化，变为医药强心剂地高辛。,3.4 在细胞生物学和发育生物学研究中的应用,植物不同组织、细胞培养获得再生个体，及其在此过程中所形成的调控 技术本身，进一步揭示了植物细胞全能性学说的本质和内涵，是对细胞生 物学领域的重要贡献。 原生质体体系的建立为植物细胞的单细胞研究提供了良好的实验体系。 利用人工细胞突变体，可以定向观察某一发育负方向所产生的生物学效 应。 离体培养的器官发生和体细胞胚发生及其调控已成为植物形态建成的良 好实验体系，从而