育种学课件：基因工程.ppt

基因工程技术及其在花卉育种上的应用 -柳暗花明又一种,学生:吴兴波 班级：研105 学号：2010104011036 任课教师：赖齐贤,内容简介,一，基因工程的基本操作程序 二，基因工程在花卉育种上的应用,一，基因工程的基本操作程序,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,步骤一：目的基因的获取,目的基因是人们所需要转移或改造的基因, 获取目的基因是实施基因工程的第一步 。,如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。,目的基因的获取方法,人工合成基因,反转录法 根据已知的氨基酸序列合成DNA,从基因文库中获取,基因组文库,cDNA文库,PCR技术：使目的基因的片段在短时间内 成百万倍地扩增。（图文表述复杂，掠去）,1.从基因文库中获取目的基因：,（1）基因文库: 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library) （2）基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库. （3）部分基因文库（如cDNA文库）: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.,1）逆转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,单链DNA(cDNA),双链DNA (即目的基因),逆转录,合成,2.人工合成基因法,2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,用DNA合成仪,步骤二：基因表达载体的构建？,1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。 2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。 3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。,启动子：位于基因首端， 启始转录，RNA聚合酶 识别结合位点，有了才 可以驱动基因转录出mRNA,终止子：位于基因末端， 终止转录。,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,步骤三：目的基因导入受体细胞,导入受体细胞的方法： （1）导入植物细胞 A,农杆菌(易侵染双子叶和裸子植物）转化法：农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上 B，基因枪法（单子叶）：在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主细胞中。 C,花粉管通道法(Made In China):用注射器直接将构建好的目的基因载体提取液注入花粉管。 (2)导入动物细胞 显微注射仪（事不关己，不容赘述） （3）导入微生物（早期常用，不能忘本）,1.将目的基因导入植物细胞（组培）,2.将目的基因导入动物细胞,3.将目的基因导入微生物细胞,大肠杆菌细胞最常用的转化方法是: 首先用Ca2+ 处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞. 第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程. 第二步目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。,步骤四：目的基因的检测,2,检测目的基因是否转录出了mRNA（DNA分子杂交，DNA与RNA),1，检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因（DNA分子杂交，DNA与DNA),3，检测目的基因是否翻译成蛋白质（抗原-抗体杂交）,1， 分 子 水 平,2，个体水平鉴定：抗虫抗病等,前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。,细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,二，基因工程在花卉育种上的应用,（一）楔子 以往育种方法的局限性： 1，自然条件下，植物变异频率较人类所需要的要小得多 2，人工诱变提高变异频率的结果不够理想，且盲目性比较大 3，杂交育种虽然能弥补两者的不足，却也存在着远缘杂交不亲合，难以打破物种生殖隔离，以及在有性生殖过程中，重组时染色体的交换量很小，难以打破某些基因连锁 4，杂交育种寄希望于从亲本获得新型基因库是非常有限的，并且许多观赏植物的品种是不育的。 这些缺点导致采用杂交育种方法育成一个新品种，往往需要经过多年多次杂交，育种周期过长，有时还会使某些优良性状难以保持，给改良某一单一性状带来了极大的不便。 不断成熟的生物技术，特别是基因工程技术，有可能解决一些传统育种不能突破的问题，为花卉性状改良提供全新的思路。,（二）正文 目前该技术在花卉上应用最多的有以下四方面： （1）改变花卉的颜色。世界上第一个操纵花包的基因是由德国科隆蒲朗克研究院分子育种所的科学家于1987年获得的玉米色素合成中的一个还原酶基因，导入矮牵牛花，使它产生了一种新的颜色砖红色。随后，荷兰科学家在红色矮牵牛花中，插入苯基乙烯酮合成酶的反酶基因，获得白色的矮牵牛花及另一种新的色素，并用同一方法，将粉色菊变成了白色。北京大学植物基因工程国家实验室，利用矮牵牛花，首次在我国培育出了白色、紫色相间的基因花。 （2）改变花的外形。同花色基因一样，生物育种学家已经找出了控制花型性状的基因，并且已经分离构造出来，在矮牵牛花、金鱼草、牡丹、芍药等花卉上有了突破性的进展。如英国已经查明一种单基因，能使金鱼草和兰花和兰花的花朵不再呈辐射状对称，从而具有特殊形状。利用基因工程改变花的形态，培育花形大且奇特的花卉新品种，让千姿百态的花卉丰富人们的生活，是高科技的又一大贡献。,（3）增强花的抗逆性。抗病、抗虫、抗冻、抗热、抗污染、抗除草剂的花卉，是人们梦寐以求的，基因工程技术在这方面显示出巨大的潜力。最近几年已有多种基因被鉴定、分离，成功地移植到许多花卉上。我国科学家将抗IMV、CMV病毒的基因导入到唐菖蒲的愈伤组织之中，获得了抗病毒基因植株，已在生产中应用。美国、日本、荷兰也已培育出切花菊抗病、抗虫的基因植株。 （4）延长开花的时间。牡丹雍容华贵，但花期只有20天。我国园艺科技工作应用生物基因工程技术，已使它的盆花货架寿命和切花瓶插时间显著延长，并能承受更长的运输时间。澳大利亚的一家实验室