PTSD 大鼠杏仁核神经元凋亡相关基因 Bax、Bcl-2.doc

ptsd 大鼠杏仁核神经元凋亡相关基因 bax、bcl-2的表达及与细胞凋亡的关系1丁金兰，韩芳，石玉秀* 中国医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，沈阳（110001） e-mail：摘要：观察创伤后应激障碍(ptsd)大鼠杏仁核神经元细胞凋亡相关基因的表达与细胞凋 亡，从杏仁核神经元细胞凋亡揭示ptsd的部分发病机制。成年健康雄性wister大鼠50只，随 机分为sps模型的1d、4d、7d、14d组及正常对照组。应用免疫组化和western blotting技术检 测凋亡相关基因bax、bcl-2在ptsd杏仁核神经元的表达；采用 tunel法检测ptsd大鼠杏仁 核神经元细胞凋亡。ptsd大鼠杏仁核神经元凋亡相关基因bax/bcl-2于4天达高峰，之后渐趋 下降。tunel阳性细胞在sps各组模型均出现，4天达最高峰。ptsd大鼠杏仁核神经元细胞 凋亡中，凋亡相关基因bax、bcl-2各自发挥促进凋亡和抑制凋亡的作用，bax/bcl-2比值升高 促进细胞发生凋亡，可能与杏仁核调节的ptsd恐惧异常的发病机制相关。 关键词：ptsd；杏仁核；凋亡；bcl-2；bax中图分类号： r32281文献标识码： a1. 引言创伤后应激障碍(posttraumatic stress disorder, ptsd)是指由异常威胁性或灾难性心理创 伤导致延迟出现和长期持续的精神障碍1。在严重创伤应激急性期，边缘系统为应激应答敏 感区,其功能和应激联系密切，杏仁核是边缘系统中重要的皮质下核团，因此在 ptsd 的发 病中起重要作用。目前的 ptsd 研究已表明，mri 检测报道海马萎缩2，由于海马神经元凋 亡，致体积减小3, 4。杏仁核和海马的功能密切相关，海马的功能受杏仁核的调节而实现5， 有研究报道 ptsd 杏仁核体积变小,杏仁核的活动量与症状的严重程度成正相关6, 7，那么 ptsd 杏仁核体积变小是否由神经元凋亡所导致呢？近年的研究显示，凋亡相关基因 bax 和 bcl-2 在细胞凋亡的调控中发挥着重要的作用。bax 和 bcl-2 被认为是细胞凋亡调控的最后 通路之一，并且二者比值增大时,细胞趋于凋亡8，因此把两者作为杏仁核神经元细胞凋亡中 的一对基因共同研究显得尤为重要。本研究通过国际上公认的 sps 模型，采用免疫组化、 western blotting 和 tunel 染色方法对大鼠杏仁核神经元细胞进行了检测，旨在为研究 ptsd 杏仁核神经元细胞的形态、功能及部分发病机制提供丰富的理论和形态学证据。2. 材料和方法2.1 实验动物及分组成年健康雄性wistar大鼠50只，体重150180g，中国医科大学实验动物中心提供，随 机分为5组，即sps的1d、4d、7d、14d组及正常对照组,每组10只。2.2 动物模型的建立和取材采用日本文部省召开的“基础和临床的研究进展”的会议确定的关于 ptsd 模型sps 刺1本课题得到国家自然科学基金（项目编号 30600341）的资助。*通信联系人。- 7 -激。sps 刺激是指将大鼠连续进行下述步骤处理，即：大鼠禁锢 2 小时后，立即强迫游泳20min（水深 40cm，水温 25）。经过 15min 的恢复，乙醚麻醉至意识丧失，在笼子中不再 经任何刺激正常饲养至取材。分别取 sps 1d、4d、7d、l4d 及正常对照组大鼠进行灌流固定。大鼠经戊巴比妥钠腹腔 注射麻醉后，用 0.01mpbs 缓冲配置的 4多聚甲醛心脏灌流，取出脑组织，并浸入同种固定液中续固定 3h，常规石蜡包埋，切 5m 厚的冠状切片。2.3 免疫组化（pv法）进行bax、bcl-2染色与图像分析切片脱蜡后，将切片入枸橼酸盐缓冲液中抗原热修复，滴加兔抗鼠bax抗体(购于santa cruz biotechnology公司，工作浓度为1：50），4过夜，滴加igg抗体-hrp多聚体（pv试 剂盒购于zsgb-bio公司）37 30min，dab显色，苏木素染核，常规脱水，透明，中性树 胶封片。光学显微镜(olympus，bx60，japan)下观察，摄片。bcl-2为羊抗兔一抗抗体(购 于santa cruz biotechnology公司，工作浓度为1：50），其余步骤同bax。应用metamorph/dpio/bx41形态学图象分析系统软件，对上述免疫组化染色切片进行了半定量 分析。在高倍（1040倍）视野下，每张免疫组化染色切片取 5 个视野，记录每个视野内阳性细胞 光密度值，取平均光密度。每组大鼠共选取 5 张切片，然后求相应组的bax与bcl-2的比值，具 体半定量分析结果。2.4 western blotting检测凋亡基因bax、bcl-2的表达取新鲜杏仁核组织经匀浆、超声粉碎后高速低温离心，11000rmpmin，取上清；采用 考马斯亮蓝法定蛋白浓度为3mgml；每例标本提取蛋白5og，10%sdspage变性凝胶 电泳，浓缩胶90v、30 min和分离胶110v、 120 min；恒压转移到pvdf膜上，4过夜，5% 脱脂奶粉封闭60min；兔抗鼠bax、bcl-2一抗(工作浓度1：500)中孵育4过夜；igg抗体-hrp 多聚体(工作浓度1：5000)孵育2h，定影，显影，图像分析。应用image j分析软件分析上述结果,目的条带bax、bcl-2 的平均灰度值分别表示bax、bcl-2蛋白水平（灰度值越大，蛋白表达越少）,求各条带的平均灰度值的比值。2.5 tunel 染色采用tunel法原位标记dna片段检测凋亡细胞，原位细胞凋亡检测试剂盒(由roch公司 提供) ,组织切片常规脱蜡至水，0.3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶活性，蛋白酶k消化, tdt反应液、anti-fluorescein antibody 工作液37 各作用1 h, dab显色，苏木素复染，常规 脱水，透明，中性树胶封片。不含tdt反应液的为阴性对照。每张玻片分别随机取5个高倍镜视野，计数凋亡细胞数和细胞总数，计算凋亡指数，凋 亡指数凋亡细胞数/细胞总数100。2.6 统计学分析所得数据使用spss13.0 统计软件。计量资料用平均数标准差表示。应用单因素方差分 析， p0.05 判为具有统计学意义。3. 结果3.1 大鼠杏仁核bax, bcl-2的免疫组化染色结果免疫组化染色阳性信号为棕黄色，阳性表达的bax 和bcl-2 染色定位于细胞浆（图1，2）。bax免疫组化结果显示，在正常组大鼠杏仁核中极少量bax阳性信号，而在sps1天，杏 仁核中 bax表达明显增多；bax的这种高表达在sps4天达到高峰，而在7天，bax表达量下降，14天表达进一步下降，明显低于sps4天组，与正常对照组相似（图1）。bax在sps后表达增 加，这是促进细胞凋亡的特征。bcl-2免疫组化结果显示，在正常组大鼠杏仁核中bcl-2呈极弱阳性反应，而在sps1天时， 杏仁核中bcl-2表达较正常对照组大鼠明显增高，sps4天、7天、14天，bcl-2表达量较1天组 渐趋下降（图2）。bcl-2在正常大鼠杏仁核中几乎没有表达，但在sps后则出现表达，这是 机体对抗凋亡的一种反应。图1. 1a 正常对照组bax 免疫反应阳性细胞 400fig.1 1a immunoreaction of bax in rat amygdala of control group4001b sps 4天组bax免疫反应阳性细胞4001b immunoreaction of bax in rat amygdala of sps 4d4001c sps 14天组bax免疫反应阳性细胞4001c immunoreaction of bax in rat amygdala of sps 14d400图2. 2a 正常对照组bcl-2免疫反应阳性细胞 400fig.2 2a immunoreaction of bcl-2 in rat amygdala of control group 4002b sps 4天组bcl-2免疫反应阳性细胞4002b immunoreaction of bcl-2 in rat amygdala of sps 4d4002c sps 14天组bcl-2免疫反应阳性细胞 4002c immunoreaction of bcl-2 in rat amygdala of sps 14d400对上述免疫组化染色切片在高倍视野下,记录每个视野内阳性细胞吸光度值，取平均光 密度(od)。然后求相应组的bax与bcl-2的比值，具体半定量分析结果见表1。表1 不同时间点大鼠杏仁核神经元bax及bcl-2表达情况(od)（xs，n=10）table 1 the amygdala neurons bax and bcl-2 expression at different time(od) (xs)组别baxbcl-2bax/ bcl-2正常组 sps-1d组 sps-4d组 sps-7d组 sps-14d组23.25522.152681.89115.369487.34434.3659858.6422 3.215440.4356 2.983525.69353.269763.15256.436143.53194.865237.17154.198332.29833.51640.70510.32641.29670.4381*2.00640.6325*1.57760.3953*1.25190.2967*注：与正常组比较，*表示 p 0.05。由表中可知，bax/ bcl-2的比值在4天达高峰，7天和14天渐趋下降至正常。3.2 western blotting结果正常组条带较淡,sps各组条带明显比正常组深，与正常组相比,蛋白表达明显上调（图3）。 蛋白表达随时间变化与免疫组化阳性细胞od值随时间变化一致，见表2。表2 杏仁核bax 、bcl-2 western botting的平均灰度值（xs）table.2 the average gray value in amygdale of bax and bcl-2 western botting组别baxbcl-2bax/ bcl-2正常组 sps-1d组 sps-4d组 sps-7d组 sps-14d组189.691510.264571.70684.561265.11313.6294120.83316.8652141.63708.5497180.681413.152151.53617.2681161.05157.8249184.50628.9546198.94379.52751.0499 0.25840.47320.1537*0.40430.1263*0.65490.1948*0.71190.2161*注：与正常组比较，*表示 p 0.05。图3 western blotting 检测各组bax, bcl-2蛋白表达各条带从左向右依次为正常对照组及sps的1、4、7、14d组fig3 the expression of bax, bcl-2 protein in different group (western blotting)3.3 tunel染色结果光镜下见凋亡细胞深染为棕黄色,非凋亡细胞的核呈蓝色。在未加tdt酶和标志液的切 片未见阳性细胞；正常组可见少量tunel阳性细胞。sps各组均可见散在的tunel阳性细 胞，sps4天阳性细胞数达高峰,（p0.05）之后呈逐渐下降趋势（图4）。sps各组与正常组 及sps组间的差异有统计学意义( p 0.05) (见表 3)图4. 4a 原位末端标记法（tunel）标记正常对照组的凋亡细胞400fig.4 4a tunel detected the normal control group of apoptotic cells4004b sps4d 原位末端标记法（tunel）标记出大量凋亡细胞4004b many tunel-positive cells were detected 4d after sps4004c sps14d 原位末端标记法（tunel）标记出少量凋亡细胞4004c few tunel-positive cells were detected 14d after sps400表3. 大鼠杏仁核神经元细胞的凋亡指数table.3 apoptotic index（ai）of rat amygdale neurons组别鼠数凋亡指数（%）正常组 sps-1d组 sps-4d组 sps-7d组 sps-14d组101.19641.5146109.21963.2913*1015.69512.1785*1010.13853.9291*103.35842.2435*注：与正常组比较，*表示 p 0.054. 讨论近年来,由于战争、自然灾害、暴力事件等频频发生,创伤后应激障碍发病率越来越高， 造成脑内各结构功能失调，给人们的身心造成创伤。杏仁核是恐惧形成和表达的关键中枢， 作为大脑中一个关键的区域来调节这些消极应激。杏仁核结构的改变导致功能的异常，因此， 研究它的结构从而研究它的发病机制越来越重要。从遭受脑损伤和情绪创伤性事件的越南老 兵身上我们发现大量这些个体中ptsd的出现损伤包括杏仁核的前颞部9。还有的研究发现 在ptsd时杏仁核体积减小，在应激状态下，杏仁核神经元细胞可能发生了凋亡从而导致了 杏仁核的体积减小。本文从这一角度检测了杏仁核神经元细胞的形态改变。细胞凋亡(apoptosis)，又称程序性细胞死亡(programmed cell death)，是指细胞为维持内 环境稳定，由基因活动指导下的主动性死亡。目前已知凋亡过程中伴随着一系列凋亡相关基 因的表达，其中bcl-2基因蛋白家族在细胞凋亡的调控中发挥着重要的作用，并被认为是细 胞凋亡调控的最后通路之一。bcl-2表达水平较高时,形成bcl-2/ bcl-2同源二聚体,抑制细胞凋亡，而 bax作为bcl-2的同源体，是bcl-2家族中最具有促进凋亡特征的基因。bax被表达并转位于线粒体是对各种细胞死亡信号的反应, bax能诱导各种蛋白分解, 抑制bcl-2的作用， 从而有促进凋亡作用10，bax表达水平较高时,形成bax/ bax同源二聚体,加速细胞凋亡11。 近年的研究提示bcl-2与bax调节细胞凋亡,不仅取决于自身表达的高低,还与bax/ bcl-2比值 有关, bax/ bcl-2在中枢神经细胞凋亡中起关键作用。bax / bcl-2比值决定了在创伤刺激下细 胞是否进入凋亡12,13，当比值增大时,细胞趋于凋亡。因此,把两者作为杏仁核神经元细胞凋 亡中的一对基因共同研究显得更为重要。本实验结果显示，bax/ bcl-2比值在sps后明显上调， 提示凋亡相关基因bax和bcl-2调控ptsd杏仁核神经元细胞的凋亡。ptsd大鼠杏仁核神经元细胞凋亡中，凋亡相关基因bax、bcl-2各自发挥促进凋亡和抑 制凋亡的作用，bax/bcl-2比值升高促进细胞发生凋亡，可能与杏仁核调节的ptsd恐惧异常 的发病机制相关。本实验通过tunel染色测定凋亡指数发现，sps各组的凋亡指数明显高于正常对照组， 并且都具有统计学意义，表明ptsd大鼠杏仁核神经元细胞发生凋亡，导致杏仁核结构改变， 可能与ptsd杏仁核部分发病机制相关。目前，ptsd的全部发病机制机制尚未完全清楚，ptsd可能引起脑一系列神经生化、生 理的异常，最终导致杏仁核损伤。因此对ptsd的发病机制还需进一步探讨。参考文献1kessler rc. post-traumatic stress disorder: the burden to the individual and to society. j clinpsychiatrt,2000, 61(suppl5) 4-12.2lindauer rj, vlieger ej, jalink m, et al. effectsof psychotherapy on hippocampal volume in out-patients with post-traumatic stress disorder: a mri investigation. psychol med ，2005，35(10):14211431.3lei zhan，et al 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