生医学院实习报告(修改)

东东南大学南大学 生物科学与医学工程学院生物科学与医学工程学院 实实 习习 报报 告告 实习单位实习单位 江江苏苏省省肿肿瘤防治研究所瘤防治研究所 暨暨江江苏苏省省肿肿瘤医院瘤医院 实实 习习 时时 间间 20092009 年年 0707 月月 1010 日至日至 20092009 年年 0909 月月 0606 日止日止 学学 生生 姓姓 名名 张张薇薇 学学 号号 11206101 指导教师指导教师( (单位单位) ) 马马国建国建 陈陈森青森青 沈宗沈宗丽丽 指导教师指导教师( (学校学校) ) 孙剑飞孙剑飞 东南大学 生物科学与医学工程学院 实习报告 第 2 页 共 36 页 装 订 线 目录目录 说明说明33 1 1 前言前言44 1.1 实习背景4 1.2 实习环境4 2 2 实习内容实习内容5-185-18 2.1 实习过程5 2.2 实习内容5-18 3 3 总结总结19-2219-22 3.1 实习小结19 3.2 实习体会20-22 4 4 附录附录23-3123-31 附录 1（染色体分组方法） 23 附录 2（正常人体染色体分析结果）24- 29 附录 3（卵巢癌病人染色体核型分析数据） 30-31 谢辞谢辞3232 学生实习鉴定学生实习鉴定3333 实习生评价表实习生评价表3434 东南大学 生物科学与医学工程学院 实习报告 第 3 页 共 36 页 装 订 线 学校评语学校评语3535 说说 明明 1实习结束之后，每位学生都必须认真撰写实习报告。通过撰写实习报告， 系统地回顾和总结实习的全过程，将实践性教学的感性认识升华到一定的 理论高度，从而提高实习教学效果。实习报告的质量反映了实习的质量， 它是实习成绩评定的主要依据之一。没有在规定时间前递交实习报告者将 不能参加实习成绩评定。 2实习报告要求条理清晰，内容详尽，数据准确。 3实习报告包含“学生实习鉴定”表，由实习单位填写。中英文 2 个版本任选 一份填写即可。 4 “前言”部分。 “实习背景”简介实习目的、学院有关实习的要求、通过何种 方式到此单位实习、实习起止时间等内容；“实习环境”包括实习单位全称、 地址、实习单位性质、规模、简介、所含部门、部门主要工作等内容。 5“实习内容”部分。属报告的主要部分。 “实习过程”概述实习各阶段所从事的 主要工作等；“实习内容”选择某个阶段的工作进行详细描述。 6“总结”部分。 “实习体会”包括本次实习的收获、对以后学习工作的看法等。 7“谢辞”部分。主要指对实习单位、实习单位指导教师，以及合作者的感谢。 8 “学校评语”由学院实习负责教师统一填写。 东南大学 生物科学与医学工程学院 实习报告 第 4 页 共 36 页 装 订 线 1前言前言 1.1实习实习背景背景 应院系对 06 级学生的暑期实习要求，本着提高个人处理工作事宜和人际关系能力的 想法，经由江苏省肿瘤医院工作人员李玫老师的引荐，本人于 2009 年 7 月 10 日至 09 月 06 日在江苏省肿瘤医院进行了为期八周的暑期实习。 1.2实习环实习环境境 江苏省肿瘤防治研究所暨江苏省肿瘤医院，前身系 1960 年建院的江苏医院。1969 年 江苏医院整体搬迁盱眙县后，原址由南京医学院第一附属医院接管创建肿瘤科。1973 年 12 月正式成立江苏省肿瘤防治研究所，1991 年增挂江苏省肿瘤医院牌子。该院是省内惟 一的省属肿瘤专科三级甲等医院，是全省恶性肿瘤防、治、研、教技术指导中心。 医院拥有固定资产 1.4 亿元。根据省级肿瘤专科医院特点，先后引进用于临床诊断、 治疗的全身多排螺旋 CT、E-CT、MRI、DSA、CR 医学影像诊断系统、医用高能电子直线加 速器、后装治疗机、钴治疗机、多叶光栏（MLC） 、三维 TPS、高能超声聚焦刀、冷冻治疗 系统和热疗系统等；用于基础实验研究的流式细胞仪、变性高效液相色谱仪、多规格基因 扩增仪包括适时定量扩增仪、大型液氮罐沉水系统等国内外先进的大型仪器设备。这些设 备的应用大大提高了恶性肿瘤的诊断、治疗和科研水平。 江苏省肿瘤医院设置职能部门 20 个，临床诊疗科室 18 个，基础医学研究室 5 个。肿 瘤诊治学科齐全，肿瘤放疗、化疗、肿瘤普通外科、肿瘤胸外科四大学科均为省级临床重 点专科。其中放疗科为“135 工程”重点学科，是江苏省放射治疗中心。医院作为国家药 物临床试验机构之一，在肿瘤药物临床试验方面有一定优势,为近百余种新药进行了临床 研究。 研究高层次拓展，开展了具有高科技水平的肿瘤分子生物学和癌基因研究。 基因芯 片的开发和应用研究参与国家 863 攻关项目。 江苏省消化道肿瘤的病因学研究获日 本文部省项目资助， 遗传性大肠癌的分子生物学研究获国家留学基金管理委员会和德 国学术交流中心资助。开展的肿瘤遗传性突变、体细胞突变的分析和基因诊断在全国同类 研究中处于前列。 分子生物学研究室拥有国内最大肿瘤标本库、DNA 库和血清库。肿瘤遗传与分子生物 学中心实验室现阶段研究项目主要针对肿瘤病人抑癌基因的突变及遗传易感性分析，研究 基因包括 MLH1、MSH2、APC、MYH、BRCA1、BRCA2 及 MTHFR 等。拥用省内最大的肿瘤标本 库。配有流式细胞器、DNA 序列分析仪、变性高效液相色谱仪、凝胶成像系统等仪器设备。 本次实习主要是在分子生物学研究室进行，对该实验室的研究方向以及一些基本的实 东南大学 生物科学与医学工程学院 实习报告 第 5 页 共 36 页 装 订 线 验操作进行了系统学习。 2实习实习内容内容 2.1实习过实习过程程 2009 年 6 月 16 日提交实习申请； 2009 年 7 月 10 日人事处报告； 2009 年 7 月 13 日7 月 20 日：分子生物学实验室的参观了解，文献查阅，流式细胞 术检测实验的见习，参与了医院的早会。(指导老师：陈森青、沈宗丽、吴晓柳、戴立玲)； 2009 年 7 月 27 日9 月 6 日：综合实验 (第一阶段：细胞水平 7 月 27 日8 月 12 日)老师讲述肿瘤遗传学分子生物学中心 实验室以及遗传学研究室的主要研究内容、技术平台，对于该科室的研究有了整体的了解； 重点是核型分析实验的实际操作；实验期间兼有文献翻译等等内容。 （指导老师：马国建） (第二阶段：分子水平 8 月 13 日-9 月 6 日)试剂盒提取实验、DNA 甲基化实验、以及 高压液相色谱分析仪的使用学习。(指导老师：马国建、李金田、张元颖)。 2.2实习实习内容内容 1 1、对于实验室的了解对于实验室的了解 本实验室主要是进行细胞水平的研究和分子水平的研究。其中分子水平的研究主要是 对于细胞形态进行的组织学研究，包括可靠的诊断学研究，病理学和影像学的研究，所采 用的方法主要是荧光原位杂交技术。分子水平的研究主要是在基因的，是更加先进的研究 方法。而本科室的主要研究内容有：基因表达、基因遗传多态性以及表遗传学（甲基化表 达）科室的技术平台有：PCR、遗传多态性（高压液相色谱分析） 、测序分析以及 MSP。 2 2、流式细胞术检测（流式细胞术检测（FlowFlow CytometryCytometry） 东南大学 生物科学与医学工程学院 实习报告 第 6 页 共 36 页 装 订 线 1） 实验原理： 除电源外，流式细胞仪主要由四部分组成：流动室和液流系统；激光源和光学系统； 光电管和检测系统；计算机和分析系统。其中流动室是仪器的核心部件。这四大部件共同 完成了信号的产生、转换和传输的任务。 信号的产生、转换和传输在压力作用下，鞘液管中的鞘液被持续不断地压入流动室， 形成一股稳定地连续的液流，保证了样本液稳定地处于鞘液液流的轴线上，并以单个细胞 形式直线通过激光照射区。激光照射区又称测量区，是指液流与激光束垂直相交的点。当 细胞携带荧光素标记物通过激光照射区时，产生代表细胞内部不同物质、不同波长的荧光 信号，这些信号以细胞为中心，向空间 360。立体角发射，产生散射光和荧光信号。在免 疫分析中常要同时探测两种以上波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，或二向色性分 光器，来有效地将各种荧光分开。 经荧光染色的细胞受到适合的光激发后产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而 进行测量的。最常用的光电转换器是光电倍增管(PMT)。从 PMT 输出的电信号需要经过放 大后才能输入分析仪器。流式细胞仪中一般备有两类放大器：线性放大器和对数放大器。 在免疫学测量中常使用对数放大器。 放大后的电信号被传送到计算机，再经模一数转换器传输到微机处理器形成数据文件， 保存在计算机上。保存在计算机上的数据可在脱机后再进行数据处理和分析。 流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。由喷嘴射出的液流柱在电信号作用 下发生振动，断裂形成均匀的小液滴。根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选， 而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收 集器中。使用不同孔径的喷孔及改变液流速度，可能会改变分选效果。从参数测定经逻辑 选择再到脉冲充电需要一段延迟时间。精确测定延迟时间是决定分选质量的关键，可根据 具体要求进行适当调整。 数据的显示和分析数据处理主要包括数据的显示和分析。单参数直方图是使用最多的 图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析。单参数直方图是由 x、Y 二方向 组成的二维平面图。横座标 x 是所测的荧光或散射光的强度，用“道数”(Channel No) 来表示。选择的放大器类型不同，标度不同。纵座标 Y 通常表示被测细胞的绝对数目。正 常情况下，数据分析得到的图形为具有一个或若干个峰的曲线图。对曲线图的解释应该具 体问题具体分析。 除直方图外，数据显示方式还包括二维点图、二维等高图、假三维图和列表模式等。 二维点图也是比较常用的数据显示类型。它显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系， 也是二维平面图，横纵坐标可以根据自己选定的被测参数自行决定，点的位置表明了细胞 和颗粒具有的二个被测参数的数值。二维点图所提供的信息量要大于单参数直方图。 东南大学 生物科学与医学工程学院 实习报告 第 7 页 共 36 页 装 订 线 2）实验目的： 在本实验室进行流式细胞术检测的目的是通过对于免疫细胞的常规检测，对肿瘤病人 各个化疗阶段的情况进行检测对比，从而对于其病情进行评价以确定下一阶段的治疗方案。 采用多参数流式细胞术，对 PB 中淋巴细胞比例，及淋巴细胞中 T、B、NK 细胞的比例，及 T 细胞亚群进行检测。这方面的临床应用有：原发性或继发性免疫缺陷病、自身免疫性疾 病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观察与预后判断、移植免疫检测等。 3）实验步骤： 1、取病人血液作为样本。经过胰酶等处理。标本如果是属于淋巴细胞等血细胞、骨髓 细胞或白血病细胞系或类淋巴细胞系，要经 Ficoll 分离，作单细胞分离处理，但若为实 体组织或贴壁生长的上皮成纤维样细胞，需采用酶消化法(胰蛋白酶、胶原酶等)，化学法 （EDTA、EGTA 和柠檬酸盐）消化分散液或洗液最好用无钙、镁 PBS，柠檬酸盐的浓度为 40mol/L，并同时采用机械分散法。 2、本次检测采用的显示方式是二维点图： 全血流式术 XCF-FCM 图 东南大学 生物科学与医学工程学院 实习报告 第 8 页 共 36 页 装 订 线 4）实验记录（免疫常规记录）以及结果分析 测量对象测量因素测得值正常细胞参考值（%） CD3+64.210.4 CD4+35.18.1 CD8+24.76.0 T 细胞 CD4/CD81.440.41 NK 细胞CD3-/CD(15+16)+)21.259.20 B 细胞CD19+8.633.44 对于消化道癌、肝癌、肺癌来说，CD8+的会超过常人，其他数值均低于正常值。 流式细胞术在肿瘤学的作用很广。对于各种肿瘤有其对应的方法。比如对 DNA 含量进行检 测，对 DNA 倍体和 S 期比例可以对于一些早期癌症的治疗进行指导。 本次实验通过对于几种不同的癌症病人的免疫常规检测，对他们的癌症化疗效果作出了评 价，并且对于下一步的化疗进行了指导。 3 3、核型分析实验、核型分析实验 A、实验总体了解 1、器材： 超净台、培养箱、离心机、酒精灯、冰盘、培养瓶、吸管、移液管、橡皮盖及玻片。 消毒过程：培养瓶、吸管、移液管（泡酸洗净然后高压处理） 橡皮制品（肥皂粉洗净后 高压） 玻片（先泡酸然后反复冲洗，最后使用无菌蒸馏水） 2、试剂： 1640 培养液（已配制好） 小牛血清（在无菌条件下由小牛颈动脉采血后分离血清，置于 56C 水浴中 30min 灭活， 置于 4C 冰箱中保存） PHA（植物血凝素；淋巴细胞只有在 PHA 的刺激下才能进入有丝分裂，其中的粘多糖成 分刺激分裂，而蛋白质则起凝集作用） 秋水仙素（本实验选用秋水仙碱） 蒸馏水 低渗液（0.075M KCl 溶液） 3、制片过程： 主要分为三步：培养（短期）制片观察（经验+经历）对 23 对染色体进行综述 实验中心思想：无菌 a、消毒灭菌无菌： 通风橱、消毒保存一个星期 b、手法问题： 枪头、玻璃器皿过火灭菌；37培养（短期培养无需 CO2液氧）每 24h 摇匀一次，观察上 层培养液是否清亮（未粉红渐渐转为黄色） ； 培养前 2 小时，加秋水仙碱使其抑制在染色 体中期。 东南大学 生物科学与医学工程学院 实习报告 第 9 页 共 36 页 装 订 线 过程概述：低渗处理固定滴片过火分散染色油镜分析 B、实验的具体操作 7月21日 7月26日消毒处理溶液配制（实验准备阶段） 1、粗制重铬酸钾加上粗制的硫酸，将玻璃器皿捆绑牢固，泡酸 48h。 2、配制酒精：将 95%的酒精配制成 75%的酒精。 3、超净台清洗工作：将超净台用皂粉水里外清洗一遍后用净水冲干，由内到外擦拭酒精， 再打开紫外灯。 4、气息橡皮盖：皂粉水反复洗净，放入恒温箱烘干。 5、基本操作的练习：火焰上方盖瓶塞，注意点：瓶子倾斜 45 度。 6、工作液的配置：1、PH=6.8 Srensen 缓冲液（KH2PO4 1.15g + Na2HPO412H2O 2.95g 溶于 250ml 蒸馏水中）2、PH=6.4 Srensen 缓冲液（KH2PO4 1.58g + Na2HPO412H2O 1.79g 溶于 250ml 蒸馏水中）3、低渗液（1.4g KCl 加水至 250ml) 姬母萨染液（Giemsa； 原液配制Giemsa 粉末 1g+甘油即丙三醇 66ml+甲醇 66ml；将 Giemsa 粉剂放入乳钵中， 边滴加甲醇边充分研磨，充分溶解后再加入甘油，混合摇匀，用有色玻璃瓶保存，室温放 置一周后使用。 ） 7、高压灭菌 8、紫外分光光度计说明书翻译和学习。 9、玻片清洗冷藏：先将玻片一片一片地放入酸缸中浸泡 48h 后取出冲洗干净并且烘干后 一片一片地泡入酒精中过夜。将泡于酒精中一片一片取出在自来水下冲洗至表面乌夜啼残 留为标准。冲洗完毕后再用蒸馏水冲洗一遍后放入盛有蒸馏水的烧杯中放入冰箱制作冰片。 10、在超净台下配制 2mg/ml 秋水仙碱和 4mg/ml 的 PHA 放入冰箱中冷冻备用。 11、染色体分组方法的详细学习（方法记录见附录附录1） 7月27日8月6日正式实验过程 Step1: 于门诊部取男性血样 3ml，由静脉采血 3ml，注入含有肝素（100 单位/ml）的抗凝管内混 匀，分成 6 份，每份吸取 0.4ml。 取 1）小牛血清 15%5ml/份7 份=5.25ml 2)1640 培养液 85%5ml/份7 份=29.75ml 3)4mg/ml 的 PHA 25ug/ml5ml/份7 份4000ug/ml=0.219ml. 三者混合后，分别取 5ml 与 0.4ml 的血液混合后分装六瓶，盖瓶塞后置于 37培养箱培 养。 Step 2: 保证细胞培养的流水式电热恒温培养箱的温度恒为 37。每隔 24h 取出分装瓶观察上层 培养液，若从粉红渐成微黄，且清亮；下层细胞株上无异常菌落，则说明细胞生长状况良 好。轻轻混匀，使上下层混合，继续培养。 东南大学 生物科学与医学工程学院 实习报告 第 10 页 共 36 页 装 订 线 Step 3: 在 70h 后加秋水仙碱，0.6ug/ml5ml=3ug，原液秋水仙碱是 2mg/ml，则每瓶添加 1.5ul， 为了保证加入的量足够，将枪调至 1.7ul。 （此时无菌要求不如前面的那么严格，还有两个 小时培养终止，细胞生长已过对数期。 ） Step 4: 1、将培养瓶中的液体全部转至 10ml 离心管中，离心沉淀血细胞（3000rpm 5min） 2、配制固定液：甲醇 120ml 冰醋酸 40ml 3、在离心管中加入 0.075M KCl 直至 10ml，静置 15min ，离心（2200rpm 5min）因 为细胞已经融入 KCl 中，不必将所有的均离心下来，所以转速略低于前面的转速。 4、去上清，留下底部的两层沉淀。加固定液，每管 2ml 预固定，立即混匀。后两管并未 一管，加固定液至 10ml 后混匀，室温下静置 30min。2500rpm 离心 5min。 5、弃上清，加入固定液至 10ml，固定 20min，2200rpm 离心 5min。 6、弃上清，开始滴片（从冰箱中取出预先制好的冰片置于冰盘上，滴两滴新鲜固定液后 混匀，将混合液滴到冰片上，经火烘烤，注意烘烤速度要快，因为玻片上的甲醇是可燃液 体，而且烘烤时间过长会考焦。 ）斜至晾干。 7、PH=6.8 Srensen 缓冲液与 Giemsa 染液 1：10 新鲜配制，待玻片晾干后用染料染色， 悬空放置一段时间。 8、蒸馏水冲去多余的染料，10 倍镜下找到分裂相，换用 100 倍油镜仔细观察。 9、进行染色体分析，分析结果如附录附录2。 本次试验分裂相不多，效果不是很理想。所以改变了一些参数重新进行实验。本次试验分裂相不多，效果不是很理想。所以改变了一些参数重新进行实验。 改变的条件有： 小牛血清的量从 15%改成 20%，PHA 改为 30ug/ml，血样改成 0.5ml 每份。 秋水仙碱改为 0.8ug/ml。 离心沉淀的时候 2000rpm 5min。 其他离心步骤均改为 1200rpm 8min。 改善后得到的分裂相比较多。细胞分散效果也比较好。失误之处是低渗的时间不够导致细 胞破裂的效果不够理想。 瘤组织制备染色体标本的成功率约为瘤组织制备染色体标本的成功率约为 50，以人肿瘤细胞株为对象制备染色体标本：，以人肿瘤细胞株为对象制备染色体标本： 短期培养： 1 瘤组织在 5mL 生长培养基中被剁碎 2 置 37水浴中温育约 21 小时 3 加入 0.5mL 0.02的秋水仙胺，于 37再次温育 3 小时。 4 进一步使组织剁碎弄细成悬液。 5 将已经剁碎的组织和培养基转入离心管，使在重力的作用下，大的组织碎片沉降下来。 6 吸出上浮的细胞悬液。 7 （同皮肤培养）吸出培养基，用 5mL 的 Dulbecco A 液冲洗； 加 2mL 预热的胰蛋 白酶Versene 液；立即吸去胰蛋白酶Versene,只留下约 0.5mL 在皿内。在 37大约温育 1015mins；看到细胞从盖玻片剥离后，加入 5mL 生长培养基，以吸管 东南大学 生物科学与医学工程学院 实习报告 第 11 页 共 36 页 装 订 线 吹吸使细胞悬浮。 2009810 （东大样本（东大样本 Vo1228） 1、 离心沉淀； 2、 在两管中分别加入 4uL 的 2mg/mL 的秋水仙碱,静置两小时； 3、 离心沉淀（2000rpm5min） ； 4、 加入 0.075M KCl，37条件下放置 20min 后再离心（1000rpm8min） ； 5、 加入固定液平衡至 10mL，静置 30min，离心（1000rpm8min） ； 6、 加入固定液平衡至 10mL，静置 20min，离心（1000rpm8min） 。 实验结果见附录附录3 4、试剂盒提取实验试剂盒提取实验 总体了解：总体了解： 纯化 方式 试剂盒名称一次处理 量 样品来源优点 l Blood DNA Kit30KB) 3、血液处理量无限制 盐酸 胍 (溶液 型) l SQ Blood DNA Kit II无限制 抗凝血液， 凝血，培养 细胞 1、单管式操作，减少交 互污染 2、经济型 3、大分子量 DNA(30kb) 东南大学 生物科学与医学工程学院 实习报告 第 12 页 共 36 页 装 订 线 4、血液处理量无限制 实验学习（QlAamp DNA Mini handbook 的翻译，学习了 Blood Mini 和 Tissue Mini 两种 试剂盒提取实验）： 预备工作： 1、样品平衡至室温（1525） 。 2、准备 56和 70两个水浴锅。 3、Buffer AE 或者蒸馏水平衡至室温。 4、准备好 Buffer AW2 和 Buffer AW1。 5、如果在 Buffer ATL 或者 Buffer AT 中有沉淀生成，则需要在 56下进行孵育。 步骤：步骤： 实验材料选取： 肝癌外周血 实验前准备： 1、 取出 13 份病人血样，在室温下冻融一个小时，使其平衡到室温； 2、 水浴锅调至 56； 3、 Buffer AE（或者蒸馏水）平衡至室温； 4、 保证 Buffer AW1 和 Buffer AW2 以及胰酶按照规定准备好； 5、 若 Buffer AL 中有沉淀生成，则需要放入 56水浴中孵育。 实验步骤： 1、分别吸取 10uL 的胰酶，加到 1.5mL 的离心管中；（13 组） 2、 在每支离心管中分别加入 200uL 的样品； 3、 在每支离心管中加入 200uL 的 Buffer AL,振荡 15s 来混匀； 4、56下孵育 10min； 5、简单离心以使离心管盖子上附着的液滴滴下； 6、每管中加入 200uL 的无水乙醇 实验记录： 流水号编号姓名性别年龄病区床位临床印象 H67 高男3511315肝癌 H68195614朱男571137 H69196456郑女58 H70195614朱男5711313 东南大学 生物科学与医学工程学院 实习报告 第 13 页 共 36 页 装 订 线 H71196482徐男5611315 H72197482金男46 肝 Ca H73197551陈男45 肝 Ca H74 顾男4820232 H75 20837肝 Ca H76195614朱男5711313 H77 仇男6811316胰腺 Ca 肝癌 H78195614朱男571137 H79 徐男 113 实验结果及分析： 注：从左到右依次为 H67H79，以及 24kbps 的 MARKER 2 DNA 甲基化实验 背景： DNA 甲基化是哺乳类动物一个重要的基因外遗传信号。有研究表明,DNA 甲基化与大 多数肿瘤的发生相关,抑癌基因启动子 CpG 岛的高甲基化可引起抑癌基因表达沉默, 细胞 出现无节制生长,导致肿瘤的发生1。目前,甲基化特异性 PCR(methylation2specific PCR, MS2PCR)是研究 DNA 甲基化最为常用且准确度较高的方法之一,而理想的引物设计则是其 成功的关键因素之一。国外互联网上有 1 个提供免费在线引物设计程序“MethPrimer”,它能 够预测 CpG 岛,根据实验者要求设计硫化测序 PCR ( bisulfate2sequencing PCR, BSP)和甲基 化特异性 PCR (methylation2specific PCR,MSP)引物。 原理： 1 未甲基化的 DNA ggg gcg gac cgc g 东南大学 生物科学与医学工程学院 实习报告 第 14 页 共 36 页 装 订 线 ggg gug gau ugu g 2 甲基化了的 DNA ggg gcmg gac cmgcm g ggg gcmg gau cmgcm g DNA 经亚硫酸氢盐硫化处理后,DNA 双链中的“C”转化为“U”,通过随后的 PCR,将“U” 转化为“T”,但亚硫酸氢盐不能使已发生了甲基化的 DNA 的“C”发生上述转化,因此,根据经 亚硫酸氢盐处理的 DNA 模板设计引物时,先输入感兴趣的 DNA 序列,程序将会显示 2 种序 列:一种是输入的源 DNA 序列；另一种是硫化处理后的 DNA 序列,除了 CpG 岛上的 5 甲 基胞嘧啶(5mC)之外,所有非甲基化的“C”都转换成了“T”,根据转化后的序列设计引物,进行 BSP 和 MSP。 对比此二图可以看出，未甲基化的 DNA 的序列中的 C 经过璜化脱氨基等过程变成了 U，而甲基化以后的 C 则不再改变。所以，处理后的 DNA 序列根据原来是否被甲基化说 出现的结果是不同的。并且，原本的互补的 DNA 序列在 C 转化之后将不再互补。在 MSP 实验中，用到的引物根据其化学诱导的不同，可以设计成对于重亚硫酸盐敏感，未甲基化 的链，或者是对于重亚硫酸盐不敏感但是甲基化的链。 实验需要额外准备的配备：实验需要额外准备的配备： 设备： a 37和 50的水浴； b 离心机（to 12000g） c 带有螺旋盖的离心管，规格：1.5-2.0ml d PH=06 3indicator/strip 或者 PH=47 1indicator/strip 的 PH 试纸或者是提供一台 PH 测试仪。 试剂： a NaOH 小球（pellets） b 70%,90%和 100% 的 EtOH； c -mercaptoethanol(-巯基乙醇) d TE Buffer(10mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, PH=7.5) 实验方法： 东南大学 生物科学与医学工程学院 实习报告 第 15 页 共 36 页 装 订 线 100 碱基对梯度（第 1 行） 。 1.0ug DNA , 0.1ug DNA, 0.01ug DNA, 0.001ug DNA,未添加 DNA 修饰试剂 IV(第 25 行） 。 1.0ug DNA , 0.1ug DNA, 0.01ug DNA, 0.001ug DNA,添加 DNA 修饰试剂 IV(第 69 行)。 Step 1:溶液准备 1、3M NaOH 原液配制（现配现用） ；1g 干燥的 NaOH 固体加 8.3mL 的水混合。 2、20mM NaOH/90%的酒精。1mL 的溶液：900uL 的 100%酒精，93.4uL 水，以及 6.6uL 的 3M NaOH。 3、溶解溶液 I（现配现用，开启瓶子之前使其至室温）：0.227g DNA 修饰 I，0.571mL 水。 振荡充分混合。使用大约 20uL 的 3M NaOH 将 PH 值平衡到 5.0。 4、溶解溶液 II(开启瓶子之前使其至室温):1uL-巯基乙醇加上 20mL 去离子水，然后取 750uL 加入 1.35gDNA 修饰 II。用于每一份样品的修饰，放置于箔纸包裹的容器中，黑暗 下 2-8保存，有效期 6 周。 Step 2:DNA 修饰步骤 1、在 1.5-2.0mL 的螺旋盖离心管中:在 1.0ugDNA/100uL 水，加入 7.0uL 的 3M NaOH,混合。 (注意：如果样品中含有的 DNA 不足 1.0ug，则先在其中加入 2uL 的 DNA 修饰溶液 IV， 然后加水使总体积至 100uL,然后加入 7.0uL 的 3M NaOH 混合) 2、50水浴 10min 孵育 DNA 3、加入 550uL 新鲜配制的 DNA 修饰溶液 I 振荡混合。 4、50水浴孵育 4-16 个小时 Step 3:首次除盐 1、强力振荡悬浮 DNA 修饰 III。用 1mL 塑料移液管（tip 10） ，吹打悬浮液从而保证剩 下的凝块也被打散。 2、在试管的 DNA 溶液中加入 5uL 悬浮好的 DNA 修饰试剂。 3、再加 750uL DNA 修饰溶液，简单混合。 4、室温孵育 5-10 分钟。 5、5000g 旋转 10s 使 DNA 溶剂形成小球，弃上清。 6、加入 1.0mL 70%酒精，振荡，5000g 离心 10s 弃上清。进行 3 次。 7、弃上清以后，高速离心 2min，吸液管吸去上清。 东南大学 生物科学与医学工程学院 实习报告 第 16 页 共 36 页 装 订 线 Step 4:DNA 的完全修饰（去磺化） ，二次除盐，洗脱 1、在适量样品加入 50uL 配制好的 20mM NaOH/90%酒精。 2、简单振荡悬浮小球，室温下孵育 5min。 3、5000g 旋转 10s 来移出试管尖端的全部内容物。加入 1.0mL90%酒精并振荡来洗这个 小球。再次旋转去上清。重复 1 次此步骤。 4、去上清高速离心 3min。 5、吸去上清。让试管，在室温下，干燥 10-20min（乙醇气味应该减少） 6、加入 TE 缓冲液。 7、样品在 50-60下孵育 15min，从而洗提 DNA。 8、高速离心 2-3min 将上清移到一个新的管子中。 9、进行 MSP 或测序，或放置于-15-25保存至 2 个月，-80保存 6 个月。不可反复 解冻和冰冻。 10、将解冻 DNA 从试管中转移出来备用时，不可将溶剂转至 PCR 感应的试管中。通常 先将试管离心，使残留的溶剂固体形成小球。 实验结果记录：实验结果记录： （这个是一次实验的结果，由于温度未设置正确，（这个是一次实验的结果，由于温度未设置正确，M 组的条带未显示出来）组的条带未显示出来） 后经过调整得到以下结果（条件：后经过调整得到以下结果（条件：ddH2O 16.8 buffer 2.5 dNTP 2 PF 0.5 PR 0.5 Tq 0.2 DNA 2.5 M 57 U 53） 东南大学 生物科学与医学工程学院 实习报告 第 17 页 共 36 页 装 订 线 sample CDH1 M CDH1 U GSTP 1M GSTP 1U RASS1FA M RASS 1FAU c28 + + + + n28 - + + - - + c29 - + + + n29 + + + - + c30 - + + + + n30 - + - + c31 - + + - + n31 + + + - + c32 - + + + 实验中可能遇到的各种问题以及其解决方式：实验中可能遇到的各种问题以及其解决方式： 1 泳道都没有条带产生泳道都没有条带产生 Potential Problem1: PCR 扩增未开始 Recommendation: a 保证 PCR 所需的内容物全部加入了反应管中； b 保证时间和温度设置正确； c 若使用 AmpliTaq Gold 进行 hot start PCR，证实初始的变性/激活过程中的温度是 95； d 其他所有的 hot start 步骤均需保证试剂使用正确； e 保证 PCR 聚合酶的活性。 Potential Problem2: 实验用 DNA 样品在化学修饰之前已经降解 Recommendation: 再次纯化基因组 DNA 重做化学修饰。从 Chemicon 得到的甲基化的 DNA（未修饰）可以 作为一个现成的对照物。 Potential Problem3: DNA 样品在修饰后降解 Recommendation: 如果化学修饰的实验 DNA 样品在进行 PCR 之前20下保存超过了两个月，则需用新的 基因组 DNA 样品重做化学修饰。 2 只有用只有用 W 引物系操作的泳道中有条带出现引物系操作的泳道中有条带出现 Potential Problem1: 实验所用的 DNA 样品化学修饰不成功 Recommendation: a DNA Modification 和 3M NaOH 原液必须是现配现用的。 b NaHSO3只修饰单链的 DNA,双链的 DNA 必须先用 200mM NaOH 变性。如果在变性之 东南大学 生物科学与医学工程学院 实习报告 第 18 页 共 36 页 装 订 线 前插入限制消化的步骤的话，切口需要小心地定位于延伸模板链之外。 （CpG WIZTM MSP Primer Kits 无需此步骤。 ） Potential Problem2: DNA 没有被修复 Recommendation: a 保证在第一次离心含有 Reagent 的悬浮物时出现了一个小白球，大约为 1mm2mm 大小。若没有就加入更多的 Reagent ，振荡，重新温育 10min 后重新离心； b 洗提 DNA 之间去除所有的酒精； c 确保洗提前小球就充分悬浮。 Potential Problem3: 修饰过程中 DNA 降解 Recommendation: PH=5 时孵育 DNA 将会不可避免地引起一些损害。50下 Reagent I 孵育超过 16 小时可能 引起一些甲基化的 C 转变成 T。 Potential Problem4: 一些 DNA 序列形成杜绝化学修饰的结构，一些 DNA 样品部分或者随机地甲基化，在修 饰之后，于推荐的 PCR 条件下，不能与 MSP 引物结合。 Recommendation: 这些可能性通过对修饰后的 DNA 进行克隆、扩增和测序来探究。 Potential Problem5: 残余的 Reagent III 悬浮物随 DNA 转入的 PCR 管 Recommendation: 先离心！ 3、除了、除了 U 或者或者 M 引物系的扩增引物之外，引物系的扩增引物之外，W 引物系在所有的实验样品中均可产生扩增引物系在所有的实验样品中均可产生扩增 引物。引物。 Potential Problem:化学修饰不充分。 Recommendation:只要 U 或者 M 引物系产生产物，将不危害实验的有效性。 4、U 和和 M 引物系都在某些引物系都在某些 DNA 样品中都可以产生产物样品中都可以产生产物 Potential Problem:样品不均一。 Recommendation:DNA 样品可能从不纯的原始细胞型中提取，包含有甲基化及未甲基化 DNA。 5、U 或者或者 M 引物系在所有的样品中都有条带产生，包括引物系在所有的样品中都有条带产生，包括“无无 DNA“的对照组。的对照组。 Potential Problem:PCR 试剂沾染了扩增产物。 Recommendation: a 使用新鲜的 PCR 内容物 b 扩增前后的液体分配使用分开的吸液装置 c 设置扩增前后过程中的专用工作区 d 一直使用抵抗浮质的移液管 e 一直使用干净的实验服及手套 高压液相色谱分析仪高压液相色谱分析仪： 主要是对于高压液相色谱分析仪的日常维护以及基本操作进行了学习。将其说明书由 东南大学 生物科学与医学工程学院 实习报告 第 19 页 共 36 页 装 订 线 英文版本翻译成为中文版本，并且经由马老师进行了一定的修改以及指导。 3总结 3.1实习总结实习总结 1、流式细胞术总结：流式细胞术总结： 流式细胞术最早的临床应用就是在肿瘤学方面，通过对 DNA 含量的检测，不仅可对 恶性肿瘤 DNA 含量进行分析，还可根据化疗过程中肿瘤 DNA 分布直方图的变化去评估 疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤化疗具有重要的意义。 FCM 通过荧光抗原抗体检测技术对细胞表面抗原分析，进行细胞分类和亚群分析。 这一技术对于人体细胞免疫功能的评估以及各种血液病及肿瘤的诊断和治疗有重要作用。 临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况，依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论， 设计最佳的治疗方案，从 DNA 直方图直接地看到瘤细胞的杀伤变化，及时选用有效的药 物，对瘤细胞达到最大的杀伤效果。流式细胞术是一种应用范围极广、灵活性很强、技术 含量较高、具有众多开发潜能、富有挑战性的技术，需要掌握很多交叉学科知识，我们的 宗旨是将这项高新技术灵活运用于临床、科研等领域，报告最科学、最真实的客观数据， 以服务于全社会。流式细胞术检测范围是：在细胞结构方面细胞大小、细胞粒度、细 胞表面面积、核浆比例、DNA 含量与细胞周期、RNA 含量、蛋白质含量。在细胞功能方 面特异性抗原（细胞表面/胞浆/核） 、细胞内细胞因子、细胞活性、酶活性、激素结合 位点、细胞受体。 2、第一期实验：核型分析（细胞水平的基础实验，研究亚分子水平的形第一期实验：核型分析（细胞水平的基础实验，研究亚分子水平的形 态学变化）总结态学变化）总结 核型分析已经向自动化发展，但是从加秋水仙素到染色这个过程仍然需要采用手工操 作。虽然现在可以用探针（根据基因序列来确定）来标记各染色体从而用仪器自动分组， 但是其价格昂贵且实用价值不高（紧紧能够将染色体分成七个组而已） ，且初学过程有必 要对于人体的 46 条染色体有一个感性的认识，所以练习了染色体的分组，基本掌握了这 个分析方法。 在看过正常人体染色体情况以后用分析了一位肿瘤（卵巢癌）病人的染色体情况，二 者对比，得出明显差异。从而实际地看到了人体癌变的一个本质上的变化过程，受益匪浅。 到目前来说，和 PCR 技术相比，核型分析的结果更加受到国家以及科学界的承认， 是一个从事这方面工作和学习的人必需要掌握的一个必要的知识。 3、第二期实验：、第二期实验：MSP（分之水平的基础实验）（分之水平的基础实验） 原来认为的肿瘤的产生是由基因本身的遗传信息畸变而导致的，后来研究发现基因修 饰的改变也会引起肿瘤的生成，从而出现了当前越来越受到生物医学方面重视的表遗传学。 东南大学 生物科学与医学工程学院 实习报告 第 20 页 共 36 页 装 订 线 本实验就是在表遗传学的水平来进行的。 东南大学 生物科学与医学工程学院 实习报告 第 21 页 共 36 页 装 订 线 3.2实习实习体会体会 1、工作单位管理方面：工作单位管理方面： 7 月 20 日的早会，领导提出了高温期间应该注意的一些问题，包括要顾及到高温会 引起病人的情绪波动，作为医院工作人员，要及时做好思想准备，不能有一丝懈怠；要防 火防电；要注意实验室的标本试剂的管理，将每块工作落实到个人。同时还讲到了