9的生物信息学分析

Kruppel-like factor 9的生物信息学分析 2006级本硕四班 林珊娜 指导老师：吴炳礼，许丽艳，李恩民 Kruppel-like factor 9，简称KLF-9,又称为basic transcription element binding protein 1(BTEB1)；BTE-binding protein 或 GC box-binding protein 1. 最初，人们以大鼠细胞色素P-4501A1(CYP1A1)基因启动子，BTE 序列为探针,从大鼠肝脏cDNA文库中克隆了BTEB 基因1。随后, Ohe 等人用大鼠BTEB cDNA 扫描人胎盘文库从而得到了人KLF-9 基因。人KLF-9基因的染色体定位在chr9q13(图1），含有两个外显子和一个内含子（图2）。其CDS 编码区长735 bp, 编码244 个氨基酸残基组成的多肽链,在细胞中的定位是在核内，属于Sp1 C2H2-type zinc-finger protein family成员，参与真核细胞基因转录调控。图1为KLF-9的染色体定位图2为KLF-9的基因结构图所谓的C2H2型锌指蛋白，是一种经典的锌指结构。它由1个-螺旋和2个反平衡的-折叠三个肽段组成，其N端有一组半胱氨酸残基，C端有一组组氨酸残基，四个残基在空间上形成一个洞穴，恰好容纳一个Zn，形似手指。锌离子能够稳固模体中的-螺旋结构，使其能够镶嵌于DNA的大沟上2(图3)。KLF-9含有三个锌指结构（图4），而且都属于C2H2型（143167，173197，203225，图5涂红色部分）。 图3为C2H2锌指蛋白的三维结构图 图4为KLF-9的三个锌指结构域 MSAAAYMDFVAAQCLVSISNRAAVPEHGVAPDAERLRLPEREVTKEHGDPGDTWKDYCTLVTIAKSLLDcchhhhhhhhhhhhhhhhcccccccccccccchhhcccccchhhhccccccccccchhehhhhhhhhhhLNKYRPIQTPSVCSDSLESPDEDMGSDSDVTTESGSSPSHSPEERQDPGSAPSPLSLLHPGVAAKGKHAhccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccchhhccccccccccccSEKRHKCPYSGCGKVYGKSSHLKAHYRVHTGERPFPCTWPDCLKKFSRSDELTRHYRTHTGEKQFRCPLccccccccccccccecccccccccceeeecccccccccchhhhhcccccchhhhhhcccccccccccccCEKRFMRSDHLTKHARRHTEFHPSMIKRSKKALANALCcccccccchhhhhhhhhhhcchhhhhhhhhhhhhcc图5为KLF-9蛋白的二级结构预测及其143-167，173-197，203-225三个锌指结构。所谓O型糖基化修饰主要发生在高尔基体中，是指单糖构成的聚糖链连接到蛋白质分子中的丝氨酸、苏氨酸或在羟赖氨酸或羟脯氨酸的羟基上。通过http:/www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/ 对KLF-9的O型糖基化修饰进行预测发现:KLF-9的O型糖基化修饰位点有十处（95，97，100，101，103，105，106，108，110，119）如图6：图6为预测的KLF-9的O型糖基化修饰位点而N型糖基化修饰主要发生在内质网中,通过http:/www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ 对KLF-9的N型糖基化修饰发现：该基因没有 N型糖基化修饰位点（图7）。图7为预测的KLF-9的N型糖基化修饰位点通过在http:/www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/这个网站对KLF-9的磷酸化修饰位点进行预测发现，该基因有丝氨酸的磷酸化位点16个，苏氨酸5个，酪氨酸1个（如图8）。 图8为预测的KLF-9的磷酸化修饰位点然后在/calc_mw_pi.html上对以上所预测的磷酸化位点以及其相应的分子量和等电点的分析，我们得到图9所示结果 表1 为KLF-9的磷酸化位点以及其相应的分子量和等电点的分析# PhosphatesMolecular WeightIsoelectric Point027255.60358.80127333.56758.53227411.53158.12327489.49557.60427567.45957.22527645.42356.98627723.38756.79727801.35156.64827879.31556.51927957.27956.391028035.24356.291128113.20756.191228191.17156.101328269.13556.011428347.09955.921528425.06355.831628503.02755.741728580.99155.651828658.95555.561928736.91955.472028814.88355.382128892.84755.292228970.81155.21我们知道要使锌指结构域镶嵌在DNA的大沟上，则该结构域上的蛋白质应该呈碱性，这样才能与呈酸性的DNA牢固地结合在一起。而当其被磷酸化而导致其呈酸性时，该锌指结构域必将从DNA上掉下来。图10为KLF-9的信号肽序列预测结果此外，通过http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/对KLF-9进行信号肽序列预测得出图10所示的结果：由图可知，该基因到目前为止还未找到信号肽序列。 通过/predictNLS/对KLF-9的核定位信号序列进行预测发现：到目前为止还未找到该基因的核定位信号序列。而通过http:/npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html对该基因的二级结构进行预测发现：进行螺旋的氨基酸残基有74个，进行无规卷曲的有164个，而剩下的6个则是以extended strand的形式存在（图11）。图11为KLF-9的二级结构分析图 通过 http:/www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan 我们进行蛋白功能域的分析和预测得到图12所示的结果： KLF-9的基因是一种蛋白质转录因子，主要通过羧基末端锌指与靶基因启动子区的GC 或GT/CACC box 结合调节靶基因的转录。它能选择性地结合并启动含有多个GC box（GC box是一个转录调节区，有激活转录的功能）的基因的转录，但抑制只含有一个GC box 的基因的转录。 利用NCBI 在线数据库我们寻找到包括人、猕猴、家猪、褐家鼠、小家鼠、狗、灰色短尾负鼠、鸭嘴兽、非洲爪蟾、热带爪蟾、黑青斑河豚、斑马鱼、黑头软口鲦、海胆、红原鸡以及黑腹果蝇等不同种属的KLF-9的表达。应用序列比对软件 Clustal X对不同种属的KLF-9进行进化树分析,结果见图13。我们观察到在大猩猩等某些高级灵长类动物中未能查询到KLF-9，怀疑该基因在这些物种中发生了丢失;此外，该基因在Gallus物种中变异较大，以致于与果蝇低等生物聚类在一起。人猕猴家猪 褐家鼠小家鼠狗灰色短尾负鼠鸭嘴兽非洲爪蟾 热带爪蟾黑青斑河豚斑马鱼 黑头软口鲦 海胆红原鸡黑腹果蝇 图13 为不同种属的KLF-9的进化树分析图查阅OMIM发现，KLF-9与疾病的关系未明。但Velarde. Michael 等人在Gene deletion of KLF9 in mice results in aberrant endometrial proliferation and myometrial function 中提到KLF-9参与孕酮受体和雌激素受体的细胞信号转导通路，影响细胞增殖。孕酮，也叫黄体激素，能使子宫维持在受孕或怀孕状态；雌激素则能促使子宫内膜发育，使肌肉变厚，血液循环增加，并使子宫收缩力增强，增加子宫平滑肌对催产素的敏感性；两者都是由母体内的黄体分泌。KLF-9是一种与孕酮受体和雌激素受体相互作用的蛋白，主要在子宫内膜基质和肌层进行表达。实验显示,缺乏KLF-9的小鼠能够正常生长, 其外部生长表型与野生型无明显差异。但缺乏KLF-9的雌性小鼠生殖系统结构和功能明显受影响, 表现为子宫发育不良和生殖能力低下(胚胎植入数目和产仔数下降、子代还将有发育不全以及在幼儿时期死亡率增加的现象)。此外缺乏KLF-9的雌性小鼠在交配后至胚胎植入前这段时期, 子宫上皮细胞和间质细胞增殖减少、凋亡增加导致胚胎植入前小鼠子宫生长改变可能也影响了胚胎的植入3。到目前为止，对KLF-9影响细胞增殖、分化的研究都仅限于动物实验的水平。虽然动物的生理机能与人非常相似，但其对人的细胞的增殖分化的影响是否也是如此还有待进一步的研究。参考文献：1 Imataka H, Sogawa K, Yasumoto K, Kikuchi Y, Sasano K, Kobayashi A, Hayami M, Fujii-Kuriyama Y. Two regulatory proteins that bind to the basic transcription element (BTE), a GC box sequence in the promoter region of the rat P-4501A1 gene. EMBO J, 1992, 11(10): 36633671.2 贾弘禔.生物化学,人民卫生出版社。3 康玲, 来茂德. BTEB/KLF9与基因转录调控. 遗传, 2007, 29(5): 涉及网站与软件1. N