人Latexin基因及蛋白质的生物信息学分析_王兆松

第 20 卷 第 2 期生命科学研究Vol20 No22016 年 4 月Life Science ResearchApr. 2016DOI:10.16605/ki.1007-7847.2016.02.006人 Latexin 基因及蛋白质的生物信息学分析王兆松，赵文铖，周蒙，魏梅，董秋萍，许世磊*（天津医科大学肿瘤医院 国家肿瘤临床医学研究中心 天津市肿瘤防治重点实验室，中国天津 300060）摘 要: Latexin（Lxn）是人的羧肽酶抑制剂, 并有肿瘤抑制因子的作用。 利用生物信息学分析 Lxn 基因的启动子和 CpG 岛以及 Lxn 蛋白质的理化性质、结构特点、功能特征后发现, Lxn 基因存在两个启动子和 CpG 岛, 且一个 CpG 岛与启动子重合; Lxn 是全长 222 个氨基酸, 等电点 5.52, 无信号肽、 无跨膜结构的亲水不稳定蛋白质; 蛋白质二级结构有 4个 螺旋和 9 个 折叠, 三级预测结构可信度为 99.55%, 拉曼图表明结构稳定; 与Lxn 相互作用的蛋白质主要是羧肽酶, 另外 Lxn还参与炎症反应和温度引起的痛觉反应等生物过程; 启动子和氨基酸在灵长类间的同源性极高。 对 Lxn 的表达、结构及功能的预测分析可以为研究 Lxn 在生命过程中的作用提供重要的信息。关键词: Latexin; 羧肽酶抑制剂; 肿瘤抑制因子; 生物信息学中图分类号：Q811.4文献标识码：A文章编号：1007-7847(2016)02-0125-06Bioinformatic Analysis of Human Latexin Gene and ProteinWANG Zhao-song, ZHAO Wen-cheng, ZHOU Meng, WEI Mei,DONG Qiu-ping, XU Shi-lei*(Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy, National Clinical Research Center for Cancer, Tianjin MedicalUniversity Cancer Institute and Hospital, Tianjin 300060, China)Abstract: Latexin (Lxn) is a carboxypeptidase inhibitor in human and acts as a tumor -inhibiting factor. Through bioinformatic analysis, predictions on the promoter and CpG island of Lxn gene, as well as physico chemical properties, structural and functional characteristics of Lxn protein were performed. It was found that there are two promoters and two CpG islands in the gene and one CpG island is located in one promoter region. Lxn protein is composed of 222 amino acids, with isoelectric point of 5.52. It is a hydrophilic and unstable protein without a signal peptide and transmembrane domain. As for the advanced structure, four -helices and 9 -sheets were predicted in the secondary structure. The reliability of predicted tertiary struc ture reached up to 99.55% and the structure was proven to be stable by Ramachandran plot. The advanced structure influenced the function of protein. Lxn not only interacted with carboxypeptidase but also took part in inflammatory response and pain sense stimulated by temperature and so on. Whats more, the homologies of promoters and amino acids in primates were very high. The analysis results provide important messages for further studies on function of Lxn in human life activities.Key words: Latexin; carboxypeptidase inhibitor; tumor-inhibiting factor; bioinformatics（Life Science Research，2016，20（2）：125130）Latexin（Lxn）是目前已知的哺乳类动物中唯且调控了干细胞中蛋白质表达的丰度3。Liang 等4一的羧肽酶抑制剂1, 具有 222 个氨基酸残基, 相发现小鼠 Lxn 的表达影响其体内造血干细胞的数对分子质量为 29 kD。Lxn 在人的心脏、前列腺、卵量, Muthusamy 等5发现 Lxn 的表达与干细胞因子巢、肾脏、胰腺、结肠等多个器官中均有表达2, 并的表达呈现负相关的关系, 而 Liu 等6证明Lxn 具收稿日期：2015-08-08；修回日期：2015-09-28基金项目：国家自然科学基金资助项目（81301711）作者简介：王兆松(1989-)，男，山东泰安人，硕士研究生，主要从事分子生物学研究；*通讯作者：许世磊（1981-），男，天津人，助理研究员，博士，主要从事肿瘤细胞生物学研究，Tel:6009，E-mail：。126生命科学研究2016 年有抑制血液系统的恶性肿瘤的作用, 并且这种抗肿瘤的作用不依赖于其羧肽酶抑制剂的功能。随着对 Lxn 研究的深入, 它对肿瘤抑制作用的研究也在不断增加, 如通过促进细胞凋亡以抑制淋巴瘤的生长6, 使细胞停滞于 G0 期, 从而抑制肝癌细胞的增殖7。另外, 有临床研究证明 Lxn 能够有效抑制胃癌、乳腺癌、甲状腺癌等恶性疾病810。因此, 对 Lxn 的深入研究可为人类肿瘤的治疗、抗肿瘤药物的开发及愈后的检测提供大量可行的指导意见。本研究借助生物信息学的方法对人 Lxn 基因启动子及甲基化进行分析预测, 并对 Lxn 蛋白质的理化性质、亲疏水性、二级结构、三级结构以及蛋白质之间的相互作用等进行预测分析, 为 Lxn的后续研究奠定理论基础。1材料与方法1.1 材料Lxn 基因（Gene ID: 56925）相关序列来自 NCBI网站; Lxn 蛋白质的氨基酸序列（NP_064554.3）来自NCBI 网站。1.2 方法利用在线数据库及分析软件对 Lxn 基因相关序列及 Lxn 蛋白质氨基酸序列进行分析, 并得出相应的结果。2结果与分析2.1 人 Lxn 基因启动子及转录因子预测与分析使用 Promoter Scan（/molbio/proscan/）对 Lxn 基因起始密码子上游3 000 bp 和下游 1 000 bp 共 4 000 bp 的片段进行启动子的预测。通过预测发现 Lxn 基因存在两个启动子, 并且预测得到与相应启动子结合的所有转录因子, 启动子位置及序列如表 1 所示, 其中Promoter 1 横跨起始密码子。预测所得的与两个启动子相结合的转录因子分别如表 2 和表 3 所示。表 1人 Lxn 基因启动子预测Table 1 Promoter prediction of human Lxn genePromoterStartStopScoreSequencePromoter 13 2412 99159.40GCGGGGCCTCAGAAGCAGTCAGCCCAGGGCTCTCGGATGCAGGGAGCCTGGGCCCAAACAGCAGCTTCCGGAGTCGGAAGGAGCTGAGGAAGAAGACTGACTGAAGGAGCTTGCGACTTTTCCGCCTCGGCAACCGGACCCAGCAGCAAGCAGGACGGGCGGCGCTCTGCTACTGGTCCCGTTAAGCCAGAGTAGCCCAAGCCCTGAAGTCACTGCTCATCCGGAATGGAAATCCCGCC-GACCAACTACCCAPromoter 241916054.56AGATCAAATTCAGTTTTATATGAACTTGGAATATTTTATCATTATGTAATAAAACCTGGAAGACATATAATCAACTTTAAATAAATATTATTTTGTTACAGCTCACCCAAATTCATCTATTAATCAGAAATATTTTATACATTTTTAAAAATATAATTTATAAACTTTATATTCAAAAATCATTAAATCATGTTTAAGAGCTCCTCTTTTATCTTGAAAACTTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGA表 2Promoter 1 结合的转录因子表 3Promoter 2 结合的转录因子Table 2 Transcription factors combined with Promoter 1Table 3 Transcription factors combined with Promoter 2NameStrandLocationWeightNameStrandLocationWeightSp1-3 2293.191 000TFIID-3302.618 000NF-B-3 2262.869 000TFIID-3211.971 000NF-B-3 2261.080 000TFIID-2982.920 000Sp1+3 2243.119 000TFIID-1792.920 000AP-2+3 1861.091 000TFIID-1792.618 000GCF-3 1552.361 000TFIID-1791.971 000Sp1-3 1523.292 0002.2 人 Lxn 基因启动子区域 CpG 岛及甲基化区GCF+3 1492.284 000Sp1+3 1473.361 000域的预测与分析AP-1-3 0958.606 000使用在线 MethPrimer软件（http:/www.uroAP-2+3 0131.091 000/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi）对 LxnAPRT-mouse_US-2 9976.003 000EARLY-SEQ1-2 9966.322 000基因起始密码子上游 3 000 bp 和下游 1 000 bp 共AP-2-2 9961.108 0004 000 bp 片段进行甲基化预测, 得到如图 1 所示结(Sp1)-2 9968.117 000Sp1-2 9952.755 000果。在 4 000 bp 中存在两个 CpG 岛, 长度分别为Sp1-2 9943.292 000106 bp（491-596 bp）和 151bp（3060-3 210 bp）,GCF+2 9912.284 000第 2 期王兆松等：人 Latexin 基因及蛋白质的生物信息学分析127其中一个 CpG 岛完全落在 Promoter 1 中, CpG 岛的存在会抑制基因的转录, 因此 Promoter 1 及其甲基化对于 Lxn 的转录调控具有更重要的作用。图 1人 Lxn 启动子序列甲基化预测图谱Fig.1MethPrimer predication of human Lxn promoter2.3 人 Lxn 基因启动子及 CpG 岛同源性分析使 用 NCBI 的 nucleotide blast（http:/blast. /Blast.cgi）在线系统, 对人 Lxn 基因得分较高的启动子（启动子 1）和落在其中的CpG 岛共同进行同源性分析, 输出结果中覆盖度（query cover）达 100%的多为灵长目物种, 其中与黑猩猩、绿猴、狒狒、恒河猴的序列的相似性（identity）分别为 98%、92%、90%、92%, 这说明在灵长类动物中, 启动子序列具有高度的保守性, 因此 Lxn 基因可以被相同的转录因子所结合。通过ClustalX2.1 序列比对软件, 对人 Lxn 启动子与黑猩猩、绿猴、狒狒、恒河猴的序列进行多重比对,并构建系统进化树, 使用 NJplot 对进化树进行可视化分析（图 2）, 结果显示人与黑猩猩之间的进化距离小于 0.016, 与绿猴、狒狒、恒河猴之间的进化距离大于 0.035。Papio anubisChlorocebus sabaeusHomo sapiensMacaca mulattaPongo（ ）0.01A0.032Pongo0.016Homo sapiens1 0000.035Chlorocebus sabaeusMacaca mulatta6580.012Papio anubis（B）图 2不同物种间 Lxn 基因启动子及 CpG 岛同源性分析(A) 人、黑猩猩、绿猴、狒狒、恒河猴 Lxn 基因启动子及 CpG岛序列比对结果；(B)Lxn 基因启动子及 CpG 岛系统进化树。Fig.2 Homologous analysis of Lxn promoters and CpG islands in different species(A) Sequence alignment of promoters and CpG islands in hu-man, pongo, chlorocebus sabaeus, papio anubis, macaca mu-latta; (B) Phylogenetic tree of promoters and CpG islands.2.4 人 Lxn 蛋白质的理化性质分析将 Lxn 蛋白质序列（NP_064554.3）提交到ProtParam 在线分析软件（/ protparam）分析发现: Lxn 总共有 222 个氨基酸残基 ; 相对分子质量为 25 750.1; 理论等电点为5.52; 在 222 个氨基酸残基中负电荷氨基酸残基（Asp+Glu）总数为 28, 正电荷氨基酸残基（Arg+ Lys） 总数为 21; 蛋白质总分子式为 C1157H1779 - N307O344S8, 其原子总数为 3 595; 不稳定系数为 43.70, 属于不稳定蛋白质 ; 蛋白质的疏水值为78.11, 平均总亲水性值为-0.593。2.5 人 Lxn 蛋白质的同源性预测和分析使 用 NCBI 的 protein blast（http:/blast.ncbi. /Blast.cgi）在线系统, 对人 Lxn 蛋白质进行同源性分析, 输出结果中覆盖度达 100%的为哺乳动物, 其中与黑猩猩、恒河猴、牛、鼠的序列的相似性分别为 99%、97%、86%、85%, 这说明在哺乳动物中, Lxn 具有高度的同源性, 因此它在其他物种中的生理功能可能与在人体中的功能相同。通过ClustalX2.1 序列比对软件, 对人 Lxn 氨基酸序列与黑猩猩、恒河猴、牛、鼠的序列进行多重比对, 并构建系统进化树, 使用 NJplot 对进化树进行可视化分析(图 3), 结果显示人与黑猩猩、恒河猴之间的进化距离小于 0.014, 但与牛、鼠之间的进化距离大于0.06。蛋白质同源性分析的结果与启动子、CpG 岛分析的结果基本一致, 遗传进化越接近的物种之间, Lxn 的表达调控及作用机制越相似。2.6 人 Lxn 蛋白质的亲水性/疏水性预测与分析使 用 ProtScale 程 序（/tools/ protscale.html）, 按其默认算法, 得到 Lxn 蛋白质Homo sapiensPongoMacaca mulattaBos TaurusMouse（A）0.010.014Pongo7430.061Homo sapiens0.014Macaca mulatta1 0000.071mouse0.0090.064Bos Taurus（B）图 3不同物种间 Lxn 蛋白质的同源性分析（A）人 、黑猩猩 、恒河猴 、牛 、鼠 Lxn 序列比对结果 ；(B)Lxn蛋白质的系统进化树。Fig.3Homologous analysis of Lxn in different species(A) Sequence alignment of Lxn in human, pongo, macaca mulatta, bos taurus, mouse; (B) Phylogenetic tree of Lxn.128生命科学研究2016 年亲疏水性序列分析图谱（图 4）。该蛋白质存在两个高分值（score1.5）峰, 即 137-141 区和 143-145区, 其中最大值是第 139 位的 Leu 的 2.144。而 6个低分值（score0 区, 这说明 Lxn 存在大量的亲水域, 属于亲水性蛋白质。ProtScale output for user sequence321Score0-1-2-3-450100150200Position图 4人 Lxn 亲水性/疏水性分析Fig.4 Hydrophilcity/hydrophobicity analysis of human Lxn2.7 人 Lxn 蛋白质的信号肽预测与分析将 Lxn 蛋白质的氨基酸序列提交到信号肽在线预测程序 SignalP 4.1 Server（http:/www.cbs.dtu. dk/services/SignalP/）, 得到如图 5 的预测结果, 其中 C、Y、S 的最大值分别为 0.126、0.111、0.128, S-mean、D 值分别为 0.102、0.106, 通过该数据得知人 Lxn 蛋白质无信号肽。SignalP-4.1 prediction(euk networks):LXN1.0C-scoreS-score0.8Y-scoreScore0010203040506070Position图 5人 Lxn 信号肽分析Fig.5Signal peptide analysis of human Lxn2.8 人 Lxn 蛋白质的跨膜区预测与分析使用 TMHMM 在线分析程序（http:/www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/）对人 Lxn 蛋白质氨基酸序列进行分析后得到如图 6 的预测结果, 发现Lxn 无跨膜区域, 说明 Lxn 蛋白质不是跨膜蛋白质。Lxn 可能分布于细胞质中, 当需要行使功能时, 在相应部位与靶蛋白质特异性结合, 因此它不存在跨膜区。TMHMM posterior probabilities for LXN1.2Probability1.00.2050100150200TransmembraneInsideOutside图 6人 Lxn 跨膜区预测Fig.6Transmembrane structure prediction of human Lxn2.9 人 Lxn 蛋白质二级机构的预测与分析Jpred 采用了 Jnnet 神经网络算法, 它对蛋白质二级结构的预测平均准确率大于 81%。将人 Lxn的氨基酸序列提交到 Jpred4.0（pbio. dundee.ac.uk/jpred/）进行二级结构的预测, 得到如图 7 所示的结果。人 Lxn 蛋白质含有 4 个 螺旋区和 9 个 折叠区, 螺旋占 26.58%（59/222），折叠片层占 32.88%（73/222）。这说明 Lxn 蛋白质中大部分氨基酸可以形成一定的结构域。图 7人 Lxn 二级结构预测H： 螺旋；E： 折叠。Fig.7Secondary structure prediction of human LxnH: -helix; E: -sheet.2.10 人 Lxn 蛋白质三级结构预测与分析蛋白质的高级结构与蛋白质的功能息息相关, 因此分析蛋白质的三级结构对于研究其功能必不可少。Swiss-Model 采用同源建模方法预测蛋白质的三级结构。将 Lxn 蛋白质序列提交到在线程序 Swiss-Model（/）中,得到 3 个预测结果。如图 8 所示，与模板相比, A的相似度为 99.55%, B 的相似度为 85.14%, C 的相似度为 16.09%。分析人 Lxn 蛋白质与同源蛋白质的相似性波形图显示, 结果 A 的预测值高且稳定, 因此预测得到的模型 A 更趋于其体内的真实高级结构。为了进一步验证预测模型 A 的可靠性, 将预测所得到的模型使用在线分析网站 The Structure Analysis and Verification Server（/SAVES/）进行拉曼图分析, 得到如图 9 所示的结果。预测所得蛋白质模型 A 中的所有氨基酸残基, 除甘氨酸（标示）外, 均位于黄色及红第 2 期王兆松等：人 Latexin 基因及蛋白质的生物信息学分析129totarget0.8Local quality estimate1.0similarity0.4local0.60.2Predicted050100150 200250(A) Residue numbertotargetLocal quality estimate1.0similarity0.80.6local0.40.2Predicted050100150200250(B) Residue numbertotargetLocal quality estimate1.0similarity0.80.6local0.40.2Predicted050100150200250(C) Residue number图 8 人 Lxn 三级结构预测(A) 蛋白质 A 模型三级结构及其与同源蛋白质相似性波形图；(B) 蛋白质 B 模型三级结构及其与同源蛋白质相似性波形图；(C) 蛋白质 C 模型三级结构及其与同源蛋白质相似性波形图。Fig.8Tertiary structure prediction of human Lxn(A) Tertiary structure of model A and its similarity waveform to the homologous protein; (B) Tertiary structure of model B and its similarity waveform to the homologous protein; (C) Tertiary structure of model C and its similarity waveform to the homologous protein.色区域内, 表明所有的氨基酸均形成了一种合理的二面角, 构成的蛋白质结构稳定, Swiss-Model预测得到的人 Lxn 蛋白质的模型稳定可靠。2.11 人 Lxn 相互作用蛋白质的预测及分析使用 String 蛋白质相互作用预测网站对人Ramachadran plot model-118013590Psi(degress)450-45-90-135-180 -135 -90 -45 0 45 90 135 180 Phi(degress)图 9人 Lxn 预