论分子生物学技术在中医药研究中的应用

论分子生物学技术在中医药研究中的应用The Application of Molecular Biology Technology in TCM Studies苗明三Miao Mingsan , 孙艳红Sun Yanhong , 方晓燕Fang Xiaoyan河南中医学院Henan College of Traditional Chinese Medicine摘要:将分子生物学技术引入到中医中药的研究上来,从基因和分子水平研究中医的基础理论、疾病的本质和中药的作用,既不脱离中医的整体观,又能使中医从客观化、定量化上与综合、演绎的方法联系在一起,填补中医缺乏微观还原分析的空白,不但有利于中医从朴素的方法论尽快地转到现代辨证的方法上来,也有利于利用基因组学这一纽带将传统的中医与现代医学紧密结合。关键词:分子生物学;阴阳学说;脏象学说;中医证的研究;中药品种培育分子生物学是从分子水平探讨生命现象及其规律的一门学科。近年来在农林、医药、环境监测与石油、化工等方面得以广泛应用,特别是基因工程药物的产生、转基因动物的研制成功、基因疗法的临床应用等已取得显著成就,分子生物学已渗透到现代生命科学的各个方面. 如何利用分子生物学的理论和技术来发展中医药,是摆在中医药工作者面前的一个严峻问题。近年来,在中医药界人士的共同努力下,已将分子生物学技术引入到中医中药的研究上来,从基因和分子水平研究中医的基础理论、疾病的本质和中药的作用,取得了可喜的成绩,具体体现在以下几方面。1 中医基础理论与分子生物学阴阳学说、五行学说是中医理论体系的高度抽象概括,“阴阳失调,百病丛生”“, 谨察阴阳所在而调之,以平为期”是中医临床诊断和治疗的一项基本原则,从分子水平对其本质进行深入探讨是中医基础理论研究的一个新的方向。中医认为肾为先天之本,决定人的生长、发育、体质、生理、疾病、衰老等,但先天受后天的充盈和调节;现代分子生物学则认为,一个人的基因是机体生存和发育的主导因素,在一定意义上,决定和影响人的生老病死等,但基因并不是所有,他受生活环境、习惯、锻炼等诸多因素的影响等,两者在论述和概念上有惊人的相似之处。李芳生1 从生物信息系统的活性物质如cAMP 和cGMP ,TXA2 和PGI2 在对生物功能调节中恰如相反的分子生物学效应,论述了中医阴阳理论与生物医学研究的重要意义。与此理论相一致,分子生物学研究发现2 ,癌的发生与正常细胞中的原癌基因和抑癌基因有关,如前者激活成为基因异常表达,或后者缺失不能发挥正常细胞生长调节和终止分化作用,就可导致肿瘤发生,这说明原癌基因与抑癌基因两者平衡失调对肿瘤发生起着重要作用。中医脏象学说认为肾为先天之本,主生长发育,生殖,肾生髓。杨金蓉3 运用“恐伤肾”原理恐吓母鼠,造成子鼠先天肾气亏虚的动物模型,然后检验子鼠胸腺核酸含量,发现恐吓各组DNA、RNA 含量及RNA/ DNA 值均有所降低,且恐吓程度越重降低越明显;王米渠4 观察受惊吓母鼠所生子鼠大脑皮层厚度变薄,尤以分子层明显变薄,说明围产期紧张情绪直接影响到下一代子鼠的生长发育;王宇5 等提示“恐伤肾”使子代小鼠IL - 2 活性处于亢进状态,而经典补肾方药“金匮肾气丸”对其有一定调节作用。收稿日期:2003 - 06 - 18作者简介:苗明三(1965 - ) ,男,河南新乡人,博士学位,研究生导师,从事中药药理研究。/ / 450008 ,河南省郑州市金水路1 号70 2003 年11 月第6 期No. 6 Nov. 2003河南中医学院学报JOURNAL OF HENAN UNIVERSITYOF CHINESE MEDICINE第18 卷总第109 期Vol. 18 Sum No. 109 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 这些研究都为中医肾为后天之本的理论提供了科学依据。引入分子生物学方法研究中医,既不会脱离中医的整体观,又能使中医从客观化、定量化上与综合演绎的方法联系在一起,填补中医缺乏微观还原分析的空白,而且有利于中医从朴素的方法论尽快地转到现代辨证的方法上来,利用基因组学这一纽带将传统的中医与现代医学紧密的结合起来。2 中医“证”的研究与分子生物学中医认为“有诸于内必形诸于外”,证为有规律的疾病的外在病理表现,在内必然有其规律的物质支配机制,开展证候与相关易感基因型及其表达,寻找证候易感性差异的遗传学基础,从基因的多态性可为证候学的研究提供现代基因组的依据。如利用分子生物学技术手段,对人体疾病证候,亚健康状态,健康状态在生化相关基因表达谱上的差异进行差异性研究,可探索证候发生的分子生物学基础。从同一疾病不同证候和同一证候不同疾病的基因表达谱的差异比较研究,可以分析基因突变和异常表达与疾病的关系,为中医异病同治,同病异治及病证间的相互关系提供分子生物学的依据。另外真核细胞基因复杂的功能是通过表达为相应的蛋白质才影响生物功能,因此,分子生物学对于蛋白质研究在技术上的突破将为证候与蛋白质的结合研究奠定基础,在这一方面,有关蛋白质芯片的深入研究,纳米技术的使用将为蛋白质的研究,中医证候的研究提供发展的契机6 。近年来运用分子生物学技术对肾虚证、脾虚证、阳虚证等进行了研究,在一定程度上揭示了这些理论的分子生物学基础。如钟历勇等7 观察补肾、健脾、活血三类复方对下丘脑垂体肾上腺胸腺轴(HPAT) 受抑模型的下丘脑促肾上腺皮质激素释放因子(CRF) 基因表达的影响,从分子水平阐明药物对阳虚证的主要调节点,结果表明唯有补肾药可通过提高下丘脑CRFmRNA 表达来保护HPAT 轴免受外源性皮质酮的抑制。健脾药对免疫系统有直接的促进作用,而活血药对HPAT 轴无任何影响,其结论是药物对肾阳虚证的主要调节位点在下丘脑。王小明8 观察了脾气虚证大白鼠模型L PO 及其抗氧化酶的变化,结果提示中医认为“脾为后天之本”在生理上与分子生物学水平抗氧化酶活性和含量有关,对中医“脾”的本质认识有一定的学术意义。刘素梅9 等用放射免疫分析方法观察实验性脾虚证大鼠胃窦部的P 物质(SP) 、血管活性肠肽(VIP) 、降钙素相关肽(CGDP) 、免疫活性肽含量明显降低、提示脾虚证胃肠肽分泌异常与胃动力失调有一定关系。刘福春等10 通过3H - TDR 掺入细胞核DNA 的方法,发现“阳虚”动物骨髓细胞DNA 合成率下降,认为中医肾主骨生髓藏精理论与促进核酸蛋白质代谢有关。另外运用分子生物学手段对血瘀证和抗衰老机制也有研究,研究表明:活血化瘀类中药主要是通过干预血管壁血小板衍化生长因子(PDGFF - A) 、血管壁原癌基因(c myc)的mRNA 表达水平,以抑制血管平滑肌(VSMC) 增生,阻止动脉粥样硬化(AS) 形成。衰老是相互联系的多虚实因素综合作用的结果,中药通过提高DNA 修复能力、清除自由基、增强神经生长因子(NCF) 受体等作用来达到抗衰老之目的11 、12 。尽管这些研究只是从某一个角度或某一方面对中医“证”的认识,还存在着这样那样的问题,但已经开始将现代分子生物学技术与中医证的研究结合起来,并从微观角度阐明中医证的实质,为进一步的辨证施治提供了一条新的思路。3 中医临床与分子生物学第18 届国际遗传学大会的与会科学家认为人类不论是器质性疾病还是功能性疾病,都可以从基因上去探究病因,寻找防治方法,编制各种疾病的基因表达谱,从诊断上便于基因检测;对疾病的治疗,不管在现在还是在将来,都将从调控基因的功能着手,即从修饰或改变基因的表达与基因产物的功能着手,而不是以改变与纠正基因的结果为主要手段。目前中医临床主要通过中药对疾病相关基因的干预和调控作用来探讨中药的作用分子机理与作用靶点。吴志圭等13 发现补肾生血药(山茱萸、熟地黄、龟板胶、阿胶等) 能明显提高- 地中海贫血患者的血红蛋白(Hb) 和抗碱血红蛋白(HbF) ,其作用机理可能是补肾生血药能提高血红蛋白的珠蛋白链/+比值,促进- 珠蛋白的基因转录和表达,诱导HbF 合成,从而代偿了- 珠蛋白基因功能的缺陷。谢金锦14 等进行了“补阳还五汤对球囊扩张主动脉后再狭窄其内皮血小板衍化生长因子受体和SOD - 1 基因表达的探讨”的研究,结果表明补阳还五汤增强动脉内皮SOD - 1的基因表达,改善缺血再灌注的供氧,同时抑制血小板衍化生长因子受体的mRNA 表达,以控制细胞的病理性增殖,提示补阳还五汤的主要治疗机理之一是调整机体平衡,并非专一的单因子作用。张国强15 研究了丹参对狼疮性肾炎的影响,结果表明丹参对人肾脏纤维细胞增殖有抑制作用,并通过使C - myc 蛋白高水平表达而诱导细胞凋亡。故在临床上丹参是治疗狼疮性肾炎及肝硬化、手术疤痕形成等纤维化病变的有效药物。王振义16 研究发现砷剂可促进急性促幼粒细胞白血病(APC) 细胞株NB4 细胞凋亡,进一步研究发现AS2O3 对bcl - 2 基因的表达,无论从mRNA 还是从蛋白水平,都具下调作用,而bax、bcl - x、c - myc 和P53基因的表达不受影响,因而认为砷剂主要是通过促进APC 凋亡而治疗早幼粒细胞白血病的。特别是陈竺院士对砷制剂和三氧化二砷的研究,使砷制剂得以在临床广泛的应用,对中医以毒71 2003 年11 月第6 期No. 6 Nov. 2003河南中医学院学报JOURNAL OF HENAN UNIVERSITYOF CHINESE MEDICINE论分子生物The Application 苗明三Miao Mingsan 第18 卷总第109 期Vol. 18 Sum No. 109 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 攻毒理论及毒性中药的在认识打下了基础,也为中药走向国际市场提供了可借鉴之处。4 中药与分子生物学4. 1 中药优良品种的培育我国采用的中药大多数为栽培品种,长期栽培出现品种品质老化、病毒寄生蔓延、种植费时费工、繁殖系数低等问题。运用分子生物学中基因工程技术和细胞工程技术,一方面可对药用植物品种实施遗传改造、构建新型的抗逆力强的优良品种,以加强中药高产、优质、多抗新品种的选育;另一方面,用基因工程技术培育出的抗病毒、抗虫害的新型中药能减少农药施用,杜绝农药和重金属污染,保证中药的安全性。同时,利用转基因生物作为反应器,也可生产外源基因编码的产物如水蛭素、干扰素和胰岛素等12 。4. 2 中药的鉴定我国药材资源丰富,药用动植物约1 万余种,但目前使用的药材来源复杂,时有互混、互代、以假充真现象存在,尤其是动物药及破碎中药的鉴定是中药质控的难点,蛋白电泳法和和核酸分析法作为新的分子生物学技术正在中药鉴定工作中广泛应用。目前常用的核酸分析方法主要有限制性内切酶片段长度多态性分析(RFL P) 、随机扩增多态性DNA(PAPD) 、高特异性PCR 扩增(PCR - RFL P) 的特定片段的限制性位点分析、DNA 序列分析、扩增片段长度多态性法(AFL P) 、基因芯片技术,这几种技术鉴定中药,可以不受药物的形状、剂型等外界因素和生物发育阶段及器官组织差异的影响,直接、便捷、准确的鉴定中药材17 。任冰如等用RAPD 技术对南北苍术不同居群间的亲缘关系做了鉴定,从DNA 水平上证实了南、北苍术亲缘关系很近,差异很小,从而证实了北苍术是南苍术的变种,而非不同种18 。罗志勇等运用AFL P 技术成功的构建出多态性丰富和重复性好的人参、西洋参指纹图谱,并运用计算机软件对结果进行二维图象处理,计算出不同样品间相似度指数,并从相似度指数发现西洋参与引种到我国吉林的西洋参的遗传物质基础基因组DNA 发生一定的变异,但变异程度小于人参与西洋参间的差异19 。国外学者运用RAPD、RFLD、AFLD 等分子标记法对淫羊藿属Epimedium、黄芪属Astragalus、木兰属Liriope、贝母属Fritillaria、栝楼属Trichosanthes、铁线莲属Cli2matis、香茶菜属Isodon、姜黄属Curcuma、苍术属Trichosan2thes、沙参属Adenophora、紫苏属Perilla、天南星属Arisaema、百合属Lillium 等药用植物进行了较为系统的研究20 。此外,DNA 分子标记方法还可用于中成药质量分析,如台北医学院利用RAPD 标记技术成功检出玉屏风散中的白术、黄芪和防风3 味药材21 。台湾药物食品检测局利用PCR 技术成功鉴别出四物汤中当归和中降汤中大和当归成分22 。大陆也有用分子免疫学技术检出金龙牡蛎胶囊,龙牡壮骨冲剂中级微量牡蛎蛋白23 ,为中药复方的质量控制提供了一个全新的思路。4. 3 利用分子生物学技术探讨中药作用机理中药进入体内发挥作用的基本环节是药物分子与生命分子之间的直接或间接相互作用。中药发挥作用必然会引起从遗传信息到整体功能实现中多个层面的结构与功能状态的改变,而决定这些层面的结构与功能的基础是基因。近年来国内有不少学者开展了中药及复方干预基因表达的调控研究,初步证明中药作用与其生物活性成分调控基因的表达有关。我国学者曾对人参、黄芪、青蒿、淫羊藿、银耳、灵芝等药对体内重要的细胞因子( IL - 1 、IL - 2 、IL - 3 、IL - 6 、TNF等) 的基因表达调控机体的免疫反应做了探讨24 ,如曹颖英等应用斑点杂交法研究表明淫羊藿苷( ICA) 可促进刀豆蛋白(ConA) 诱导的淋巴细胞IL - 3mRNA , IL - 6mRNA 的表达,其促进作用具有一定的剂量依赖性,且它对IL - 6mRNA 表达的作用大于对IL - 3mRNA 表达的促进作用,初步阐明ICA 促进某些细胞因子产生的分子机制25 。郑欣岳等观察了四物汤对小鼠脾淋巴细胞产生IL - 6 的影响,结果发现四物汤可显著提高IL - 6mRNA 的表达水平,从而使IL - 6 的分泌量增加,推测这是四物汤增强机体免疫和补血作用的机制之一26 。史大卓等认为川芎嗪注射液可促进缺氧缺糖心肌细胞蛋白质RNA 的合成,同时诱导NOSmRNA 的表达,认为川芎嗪增强NOS 基因的表达是其防治心肌细胞缺氧缺糖的主要机制27 。中药的抗癌机制可能是通过调控c fos和P53 、PC1 - 2 、c myc 等基因的表达来诱导肿瘤细胞凋亡24 。绿茶抗氧化剂复合儿茶素对促癌剂12 - 氧- 14 - 烷佛波醇- 13 - 乙酸酯( TPA) 的影响有明显拮抗作用,即复合儿茶素能抑制促癌剂引起的c fos、c myc 的基因表达,而对抑癌基因Rb 表达有调控作用28 。陈记藩等认为通痹灵可使RA 大鼠滑膜细胞TNF - mRNA 表达水平降低,提示通痹灵治疗RA 作用机理之一是通过抑制滑膜细胞异常表达的TNF -mRNA ,从而下调TNF -的产生29 。4. 4 利用基因芯片技术筛选和开发新药在后基因时代,随着基因结构和功能研究的突破,致病基因的发现,药物的研究的目标之一是在基因水平上寻找要用的靶标,通过比较药物处理前后细胞基因表达的差异来推测筛选药物作用的靶,从而找到“导向药物”。目标之二是用基因芯片技术检测药物的毒性或副作用,进行毒理研究。生物芯片技术所具有的高集成与组合化学相结合,为新药研究的初筛提供超高通量筛选。目前,Gene logic inc 公司用美国橡树岭研究所技术制作的流过芯片( Gene logic READS) 已成功用于药物开发、靶标寻找。这将有利于确定中药的有效活72 2003 年11 月第6 期No. 6 Nov. 2003河南中医学院学报JOURNAL OF HENAN UNIVERSITYOF CHINESE MEDICINE论分子生物The Application 苗明三Miao Mingsan 第18 卷总第109 期Vol. 18 Sum No. 109 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 性成分和有效活性部位,为开发中药新药提供一个简便、快捷的新途径。5 存在问题与展望综上所述,中医药学界已经开始将分子生物学技术运用到中医中药的研究中来,也取得了一定的成绩。但仍处于起步阶段,对中医证的认识还不十分清楚,对中药作用机理的研究还有待于进一步深入,对中药优良品种的培育、质量标准的控制、药物的有效部位有效成分的筛选还有待于进一步深入和完善。分子生物学的迅速发展,带动了各学科的发展,后基因组时代作为21 世纪生命科学发展的主要特征,已成为科学界的共识,面对这样的时代,中医药研究应把握好时机,在继承祖国医学特长的基础上,大胆的借鉴新的观念、新的技术,以基因组学为突破口,宏观结合微观、综合结合分析,将中医与现代医学结合起来,迎接中医药发展的新时期。参考文献:1 李芳生. 中医阴阳学说的分子基础J . 辽宁中医杂志,1998 ,25(4) :156 - 157. 2 李贺. 中医基础理论与现代医学进步J . 辽宁中医杂志,1998 ,24(7) :294 - 295. 3 杨金蓉. 孕鼠“恐伤肾”对子代胸腺核算含量的影响J . 成都中医药大学学报,1998 ,21 (2) :3 - 40.4 王米渠. 试论“肾通于脑”的信息神经观J . 成都中医药大学学报,1997 ,13 (622) :1 - 2.5 王宇. 惊恐孕鼠对子代小鼠IL - 2 活性的影响J . 成都中医药大学学报,1998 ,21 (1) :29 - 30. 6 赵燕平,赵燕琴. 分子生物学在中医药学中的应用情况及前景探讨J . 浙江中西医结合杂志,2001 ,11 (9) :529 - 531.7 王明艳,周昆福,徐力,等. 分子生物学与中医药研究M . 上海:上海中医药大学出版社,2000. 39. 8 王晓明.“脾为后天之本”的分子生物学基础J . 辽宁中医杂志,1994 ,21 (3) :139 - 141. 9 刘素梅. 实验性脾虚证大鼠胃窦部SP、VIP、CGRP 含量的研究J . 首都医科大学学报,1998 ,19 (2) :105 - 108.10 刘福春. 淫羊藿对羟基脲所致“阳虚”动物骨髓细胞DNA 合成率的影响J . 中国中药杂志,1991 ,16 (10) :626. 11 刘亚梅,陈群. 分子生物学与现代中医药学的研究进展J . 安徽中医学院学报,2000 ,19 (1) :57 - 60. 12 周坤福. 分子生物学与中药开发M . 北京:人民卫生出版社,2000. 184.13 吴志奎,蔡辉国,陈佩真,等. 补肾生血方对- 地中海贫血基因水平的影响J . 中医杂志,1997 ,38 (2) :91.14 谢金锦,侯灿,吴伟康,等. 补阳还五汤对球囊扩张主动脉后再狭窄内皮PDGFR 和SOD - 1 基因表达的探讨J . 中国中西医结合杂志,1997 ,17 (10) :611.15 张国强,叶任高,孔庆瑜. 丹参对狼疮性肾炎成纤维细胞增殖,凋亡及C - myc 蛋白表达的影响J . 中国中西医杂志,1997 ,17 (8) :473. 16 王振义. 开展砷剂治疗白血病的临床和机制研究J . 中华血液学杂志,1996 ,17 (2) :57. 17 詹秀琴,王明艳. 分子生物学技术在中药鉴定中的应用及探讨J . 生物学通报,2001 ,36 (11) :3 - 4. 18 任冰如,贺善安,於虹,等. 用RAPD 技术评估苍术居群间的亲缘关系J . 中草药,2000 ,31 (6) :458.19 罗志勇,周钢,周肆清,等. AFLP 法构建人参、西洋参基因DNA指纹图谱J . 药学学报,2000 ,35 (8) :626. 20 肖小河,刘峰群,袁海龙,等. 中药DNA 标识鉴定研究进展J .中草药,2000 ,31 (8) :561.21 Cheng HF , Tsuy ,HS chen et al , Determination of the compo2nents in a Chinese prescription. Yu - Ping - Feng - San by RAPD analy2sis , plant Med ,1998 ,64 :563. 22 Cheng HF , Lai B , Liao CH , et al . Molecular identification of Chi2nese herbs by polymerase chain reaction methods 1997 ,nterratipna sym2posium on Chinese