现代生物技术概论课程要求.ppt

现代生物技术概论 课程要求,刘柱 生物系 2012.03.04,授课方式,授课方式以PowerPoint讲板为主；,1课堂教学,2课外教学,多种渠道的师生交流；,科学报告会；,1 平时成绩（20分）,1)考勤（10 分) 2) 课堂回答问题（10分）,考试分数的组成,2 科学报告会（30分）,3考查或考试（50分）,科学报告会参考题目,4人左右组成小组，讲解英文文献。,主要内容：,一、现代生物技术概述及应用 二、细胞工程概述 三、基因工程技术 四、基因克隆的一些方法,生物技术（Biotechnology）和生物工程 （bioengineering）这两个名词常可通用。当 “生物工程”不是指具体的工程项目，而是表示所用的技术系统时，它就等同于“生物技术”了。 然而，有时一种生物工程包含不只一种生 物技术，在具体概念上两者还是有区别的。,生物工程的概念、特点,生物工程的发展历程,生物工程的应用,一、生物工程,（一）生物工程的概念、组成及特点,概念：是以生命科学作为基础，应用自然科学及 工程学的原理，对生物资源（包括动物、植物和微生 物）进行利用、改造并为人类提供服务的一个综合性 技术体系。,运用现代生物学理论与科学技术改造细胞的遗 传物质，获得具有优良品质的动物、植物或微 生物品系； 工业规模地利用现有生物体系，制备生物产品； 模拟生物体系，以生物化学代替化学工程，制备 工业产品； 发展相应的科学理论与工程技术。,生物工程概念的内涵：,生物工程的概念、组成及特点,生物工程产品包括： 大宗化工产品，如乙醇、柠檬酸、葡萄糖酸等； 精细化工产品，如各种氨基酸、酶制剂； 医药产品，如各种抗生素、多种甾体激素和维生素、 常规菌苗、疫苗等； 其他产品，如生物农药、食用及药用酵母、饲料蛋白 (单细胞蛋白)、沼气等； 现代生物技术产品，即通过重组DNA技术和细胞融合 技术等方法生产的产品，如干扰素、单克隆抗体、新 型疫苗等。,生物工程的概念、组成及特点,发酵工程 酶工程,将常规菌(或动植物细胞株)作为特定遗传物质受体，使它们获得外来基因， 成为能表达超远缘性状的新物种.,为这有巨大潜在价值的新物种创造良好的生长与繁殖条件，进行大规模的培养,主要技术范畴：,基因工程 细胞工程,蛋白质工程 组织工程 生物医学工程等,1、基因工程：是以分子遗传学为理论基础，以分子生 物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因 （DNA分子），按照预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新品种的过程。 特征：1)外源核酸分子能在不同的寄主生物中进行繁殖，可以跨越天然物种屏障； 2)实现很少量DNA样品“拷贝”出大量的无污染其它DNA序列的DNA群。,获得目的基因 构建基因表达载体 将目的基因导入受体 细胞 检测基因是否稳定高效表达,基因工程的相关技术：,DNA体外重组技术：核心技术 克隆技术：通过细胞的无性繁殖,基因工程的应用：,转基因生物：超级细菌、转基因动物的“乳腺 制药厂”； 基因诊断与治疗； 基因工程药品：如用大肠杆菌生产人工胰岛素、 干扰素及疫苗等； 真核基因的表达调控；,2、发酵工程：指采用现代工程技术手段，在活细胞 催化剂（主要是微生物细胞）作用下，为人类生产 有用产品的过程。包括菌种的选育、培养基的配制、 灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提 纯等方面。 菌种的来源包括细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类,供菌体生长和产物形成所用培养基的制备； 培养基、发酵罐和附属设备的灭菌； 供发酵生产用的种子制备； 在发酵罐中提供最佳条件，以使菌体生长和产物形成； 产品的提炼和纯化； 生产中所产生的废物的处理。,发酵工程按获得的产品分为四个主要类型： 以获得微生物细胞为产品的过程； 以获得微生物酶为产品的过程； 以获得微生物代谢产物的过程； 以微生物进行生物转化的过程,3、酶工程：是指利用酶催化剂所具有的特异催化功能， 借助工艺学手段和生物反应器装置来生产所需的生物 化工产品的过程。包括酶制剂的制备、酶的修饰与改造、 酶的固定化及酶反应器等方面。主要应用于食品工业、 轻工业以及医药工业中。 酶反应过程专一性强，转化率高，但成本较高；发酵过程应用面广，成本较低，但反应机理复杂，难以进行控制，产物中常含有杂质，给提取带来困难。,、,产酶的微生物发酵或动植物细胞培养过程。 胞内酶的微生物细胞破碎过程，胞外酶直接将发 酵液过滤除去菌体即可。 酶的分离纯化过程。根据酶分子与其他蛋白质之 间性质的差异，例如分子的大小、溶解度的不同，用盐 析法、有机溶媒沉淀法、电渗析法、离子交换层析和电 泳法等技术，将酶进行分离纯化。 酶的修饰：酶蛋白侧链基团的修饰、金属离子置 换等，以提高酶活力、稳定性，降低或消除抗原性。 酶固定在载体上的固定化过程。 酶反应器的设计和酶反应控制。对于游离酶反应， 通常采用分批搅拌槽反应器；对于固定化酶反应，则常 用连续柱式反应器。,酶工程的流程：,4、细胞工程：应用细胞生物学的方法，有计划地改变 细胞遗传物质并使之增殖，从而生产有用的产物或引向 成体化的综合科学技术。 细胞工程包括：细胞大量培养及控制生长、增殖并 引向成体化等一系列技术、细胞融合技术、细胞拆合 技术、向细胞内引入高分子物质等技术。,5蛋白质工程,在基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学，计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，对蛋白质进行修饰，改造和拼接以生产出能满足人类需要的新型蛋白质的技术。,5、组织工程：由美国国家科学基金委员 会于1987年正式提出和确定的，是应用 细胞生物学、生物材料和工程学的原理， 研究开发用于修复或改善人体病损组织或 器官的结构、功能的生物活性替代物的一 门科学。,1970康奈尔大学 化学工程学士 1974麻省理工学院化学工程博士 “Enzymatic regeneration of ATP ” 19741977 哈佛医学院博士后 癌症研究 1977麻省理工学院教授,研究领域：生物技术、药学、 化学、医学,Langer的成就,发表论文1050篇-药物控释; 申请专利750篇; 获得170多项奖励 其中包括2006年美国国家科学奖, Charles Stark Draper Prize ,相当于工程界的Nobel Prize; 2008 Millennium, 世界上最大的技术应用奖。,Lab Members MIT (2005),存在问题,在组织缺损修复治疗中，对器官组织移植有巨大需求。但在器官移植技术中，仍存在许多困难和问题，如自体组织器官移植，由于组织供区有限而存在较大局限性。严重的器官和组织短缺，使外源性器官移植难以实现。 外源性器官移植还存在着不能克服的短期和长期免疫排斥问题。,曾经的麦蒂,征战多年伤痕累累,按照现有医疗水平恢复的麦蒂,组织工程临床应用后麦蒂王者归来！,生物工程重点研究的内容： 新型生物反应器研究开发，特别是针对重组DNA技术、细胞融合技术所获得的新产品的投产； 新型分离方法及设备的开发； 各种描述生物反应过程的数学模型的建立，将有利于过程的控制和优化以及计算机的运用； 生产过程控制手段的改造，重点要解决的是各种能反映反应过程变化特性参数的传感器的研制和计算机控制系统的完善。,（二）生物工程的发展历程,生物工程是个古老而又年轻的科学，它的历史几乎与 人类文明的发展史一样源远流长，可以追溯到几千年以前。,第一代生物工程：古代以非纯种微生物发酵工艺为标志,8000年前苏米尔人已掌握制作啤酒技术； 6000年前埃及人已能制作面包； 5000年前我国已掌握了酿酒技术。,第二代生物工程：近代以纯种微生物发酵工艺为标志,从1857年Pasteur L 发现发酵过程是微生物作用的 结果，开始利用纯种微生物发酵工业大规模生产抗生素、 氨基酸、有机酸、酶制剂、核酸及单细胞蛋白等产品。,19世纪大规模生产乳酸、酒精、面包酵母、柠檬 酸和蛋白酶等初级代谢产物； 20世纪40年代，以获取微生物的次级代谢产物 抗生素工业成为生物工程的支柱产业； 20世纪50年代后，随着微生物代谢调控机制的阐 明，开始发展氨基酸、核苷酸、酶制剂等发酵工业。,生物工程的发展历程,第三代生物工程：以1973年建立的重组DNA技术基因 工程为标志,1973年后，细胞融合及单克隆抗体技术相继成功，并实现了动植物细胞的大规模培养技术，同时固定化生物催化剂也得到了广泛应用、 新型生物反应器不断涌现，且形成了相应的产业，使生物工程迅速完成了从传统生物技术向现代生物技术的飞跃转变，成为真正意义上的生物工程，代表着21世纪的发展方向。,生物工程的发展历程,（三）生物工程的应用,1、发酵工程：由微生物发酵大量生产各种氨基酸、抗 生素、酶、核酸、有机酸、醇类制品，提供了大量药物、 食品、饲料添加剂及化工原料。 如，在制药工业，筛选了低毒氨基酸糖苷抗生素、 抗肿瘤抗生素等；在农业，研制了一大批新型无公害、 高效、专一性强的杀虫剂、除莠剂、植物生长调节剂 等微生物新药。,2、酶工程： 发现和制备了更丰富的生物酶；对酶催化反应的机理、 工艺和应用研究达到新水平；固定化酶技术的发展使酶工 程效率更高、成本更低、产品更丰富；装有固相化酶或菌 体的化学传感器已被用来监测生成抗生素、维生素、氨基 酸及生物需氧量等。,生物工程的应用,生物工程的应用,3、基因工程： 转基因植物：抗病虫害的转基因作物如棉花、水稻、玉 米和马铃薯以及抗除草剂的高粱、小麦、大豆和玉米等 已形成产业规模 ；富含高色氨酸、高蛋白的转基因玉米、 含高不饱和脂肪酸的转基因油类等高营养和特殊功能的 食品已培育成功。但很多转基因植物富含争议。 转基因动物：将人体基因注入动物中，获得的子代动物 具有人体蛋白，可从中提取人体需要的药物蛋白；“乳腺 制药厂”；转基因猪、鱼生长加快，增加产量，转基因羊 增加产毛量。 转基因药品：疫苗、单克隆抗体、胰岛素、细胞因子等,生物工程的应用,4、细胞工程： 避免直接从动、植物整体提取产物所受到的资源限制 及环境条件的影响，为某些珍稀植物的快速繁殖、植物 的复壮等提供可行的办法。 通过不同植物或动物细胞之间的融合，可获得杂种细 胞，培育出新的动植物杂交种。如，在美国，采用胚胎 移植技术实现奶牛良种化，比传统的杂交改良方法至少 节省10年时间，已建立起高产奶牛的繁育体系和生产体系。,现代生物工程技术已在农业、医药、轻工业、 食品、环保、海洋和能源等许多领域得到广泛的 应用。,生物工程的应用,生物工程的发展趋势： 新技术交织应用，育种跨越生物“界”的鸿沟。 基因工程药物、疫苗研究与开发突飞猛进。 转基因植物与动物取得重大突破。 阐明生物体基因组及其编码蛋白质的结构与功能发展 迅速，如人、拟南芥、斑马鱼等全基因组测序已经完成。 基因治疗取得重大进展，可能革新整个疾病的预防和 治疗领域。 分子生物学、（蛋白质）结构生物学、计算机技术等 学科结合紧密，生物信息学发展迅速。,生物工程的应用,二、细胞工程简介,细胞工程的研究内容、 主要技术及其应用,细胞工程与基因工程的关系,细胞工程的主要成就,细胞工程的生物学基础,（一）细胞工程的研究内容、 主要技术及其应用,细胞工程是在细胞水平上研究、开发、利用各类细胞的工程。 细胞水平上的生命活动，是连接着分子水平上的各种生物大分子和个体水平上的各种器官系统的综合生命活动。 围绕着生命活动这个中心，分子水平上研究的是DNA的复制与转录、RNA的翻译、蛋白质执行各种生命活动；细胞水平的是细胞增殖、分化、死亡；而个体水平上则是遗传和发育。,研究内容：,细胞工程的发展建立在细胞融合的基础上，人们 可以根据需要，经过科学设计，在细胞水平上改造生 物的遗传物质。,细胞工程的研究内容、 主要技术及其应用,主要技术方法？,细胞培养：是将生物体内的某一组织分散成单个细胞， 接种在人工配制的培养基上，然后在适当的条件下 （如一定的光照、温度和pH值等）进行培养技术。,由于单个细胞的培养难度大一些，目前多采用组织培养技术。如通过植物器官（根尖、茎尖、花药等）的离体培养，生成新植株（试管苗）。从而快速、大量繁殖一些有价值的植物。,细胞融合：指在外力（诱导剂或促融剂）作用下，两个 或两个以上的异源（种、属间）细胞或原生质体相互接 触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细 胞的现象，也称为细胞杂交；如取材为体细胞则称为体 细胞杂交。,细胞凝集,膜粘连，融 合成多核细胞,核融合成单 核的杂种细胞,细胞拆合：将完整细胞的细胞核和细胞质用特殊的方法 分离开来，如把细胞核从细胞质中吸取出来，或用紫外 线等-，然后再把分离的不同细胞的细 胞核和胞质重新组合起来，培育成新的细胞或新的生物体。 细胞重组：将细胞融合技术与细胞拆合技术结合，在融合 介质诱导下，使胞质体（去核的细胞结构）与完整细胞合 并，重新构成胞质杂种细胞的过程。,细胞重组的方式： 胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种； 微细胞（只含有少数染色体与薄层细胞质、细胞膜 的结构）与完整细胞重组形成微细胞异核体； 胞质体与核体重新组合形成重组细胞。,向细胞内引入高分子物质：把蛋白质、核酸等有生物活 性的高分子物质或细胞器，应用磷酸钙、脂质体、红细 胞血影、仙台病毒及直接的显微注射等方法引入细胞内， 观察该类物质进入细胞后所发生的变化及起的作用等。 不涉及应用DNA体外重组技术构建质粒来转移基因， 不属于基因工程。,细胞工程的兴起：,在植物学界，早在1902年德国的植物学家哈泊兰德就 预言植物细胞的全能性，之后得到了一系列实验的证实。 在动物学界，1907年美国哈里森采用盖玻璃片悬滴培养 蛙胚神经组织，存活了数周并观察到细胞的生长现象， 从而开创动物细胞培养的先河。,微生物繁殖快、世代时间短、单倍体期较长，在较短 时间内能生长出大量相对同源的种群，便于遗传育种。 1964-1967年，植物细胞“全能性”学说证实后，经离体 组织、细胞或花药、花粉培养获得单倍体植株，使得 高等植物像微生物一样在大发酵罐中生产各种植物的 代谢产物成为可能，如纤维素酶、果胶酶等酶制剂的 大量生产。 20世纪60年代初，Cocking 等用酶溶解植物细胞壁， 制备了大量有活力的原生质体，为原生质体实验系统 奠定了基础。,1958年，冈田善雄发现紫外线灭活的仙台病毒可引起 艾氏腹水瘤细胞彼此融合；1965年，Harris & Warkins 成功地将人细胞和鼠细胞融合在一起，证实动物界中 细胞融合没有种和属的界限。 20世界70年代，科学家尝试用各种化学诱变剂诱导原生 质体融合，自1974年发现用聚乙二醇（PEG）和Ca 2+ 能显著提高植物原生质体的融合效率，PEG现已扩展应 用到动物、真菌、酵母及细菌、放线菌、霉菌等多种微 生物种间、属间原生质体融合技术中。,20世纪70年代初，诞生了细胞拆合工程，去核细胞和核 移植实验长期依赖于显微外科手术进行。1967年，Carter 发现细胞松弛素B （CB）能诱发体外培养的小鼠L 细胞 的排核作用；1972年，Prescott 首次应用离心技术结合 CB 成功分离哺乳类细胞的胞质体，为研究细胞核、质 关系及细胞质基因的转移开创了新途径。 20世界80年代，细胞重组工程得到了发展。1982年， Perenczy 首先在真菌中使核与原生质体融合成重组细胞 取得成功，成为育种的一种新途径，,最近20年，细胞工程技术与基因工程技术紧密结合起来， 使动物胚胎移植技术进入实用化阶段；培育出抗病毒、 抗除草剂、抗虫害、高蛋白的各种农作物品种，培养出 携带人的生长激素基因的猪和鱼，得到了转基因鼠、兔、 绵羊、猪、牛等，并从这些动物的血液、乳汁中得到有 医用价值的蛋白质和各种细胞因子等。,最具代表性的游戏是美国耶鲁大学教授克莱白特L 马格特和罗伯特M彼德斯的杰作。 他们在黑毛鼠、白毛鼠、黄毛鼠的受精卵分裂成8个 细胞时用特制的吸管把8细胞胚吸出输卵管，然后用一种 酶将包裹在各个胚胎上的粘液溶解，再把这三种鼠的8细 胞胚放在同 一溶液中使之组装成一个具有24个细胞的“组 装胚”。马格特和彼德斯把“组装胚”移 植到一只老鼠的子 宫内。不久，一只奇怪的组装鼠问世了，这只组装鼠全身 披着黄、白、 黑三种不同颜色的皮毛。 英国和美国还“组装”了绵羊和山羊的嵌合体绵山羊。,1978年英国采用胚胎工程技术成功培育出世界首例试管婴儿 试管婴儿是“体外受精和胚胎移植”的简称。它通过手术将女性的成熟卵子取出，然后与精子于试管中受精，在培养4天后，再把这个受精卵移植到女子的子宫里安胎，发育为胎儿。 试管婴儿是由英国医生帕特里克斯特普托发明的，主要用来治疗有排卵功能而输卵管堵塞引起的女性不育症。 世界上第一个试管婴儿路易斯布朗（女）于1978年7月25日诞生在英国的曼彻斯特。目前全世界已有几千名试管婴儿诞生，我国第一个试管婴儿于1988年3月10日诞生。,克隆即无性繁殖系，是指从一个共同的祖先，通过无性繁殖的方法产生出来的一群遗传特性相同的分子、细胞或个体。克隆动物一般是指通过无性繁殖形成动物后代。,克隆动物：,动物细胞的全能性： 低等动物的鱼、两栖类等，从2细胞到囊胚期的细胞 都具有全能性，高等动物从胚胎2细胞到64细胞以及 内细胞团的胚胎细胞也具有发育的全能性,细胞工程的研究内容、 主要技术及其应用,1997年 “多莉羊” 多莉羊是由多塞特母绵羊成体提供乳腺细胞的细胞核，由黑面母绵羊排出未受精的卵细胞，并摘去细胞核，在电脉冲作用下进行二者细胞融合，由此形成的胚胎细胞植入到另一只黑面母绵羊子宫中发育，最后产下多莉羊。 它存活了8年，表形特征同核供体多塞特母绵羊完全一样，并能够繁殖，可能具有早衰现象。 多莉羊克隆成功，表明动物体细胞克隆获得成功，将为医学界带来巨大机遇，同时，也在伦理界引来道德的谴责声。, 2001年英国克隆猪： 总部设在苏格兰的英国PPL医疗公司称，已经克隆出了5头幼猪，它们身上没有人体会排斥的基因，从而解决了猪器官移植时常常出现的排异现象。 2005年10月意大利媒体报道，几周前14只克隆小猪仔降生于意大利著名的克雷莫纳繁殖技术研究中心，目前的健康状态良好。为动物-人类的异种器官移植的早日实现带来了更大的希望。,细胞工程的研究内容、 主要技术及其应用,细胞工程的主要技术及其应用：,细胞融合技术、细胞拆合技术、胚胎移植技术和 细胞组织培养技术,（二）细胞工程与基因工程的关系,细胞工程与基因工程相互渗透,（三）细胞工程的主要成就,细胞工程所要求的技术条件、实验设备及试剂、经费等均比基因工程要求的低一些。利用细胞工程技术，可以大量培养细胞组织乃至完整个体。,1、植物细胞工程方面,植物细胞培养：理论基础为植物细胞全能性,（1）试管苗的快速繁殖：如从一个嫩枝茎尖可育出 10万株苹果苗，仅需1年零4个月便可开花结果。,离体的植物器官、组织或细胞,愈伤组织,根、芽,植物体,外植体,脱分化,植物激素：细胞分裂 素、生长素,再分化,植物组织培养：,植物组织培养条件：,含有全部营养成分的培养基、一定的温度、空气、无菌环境、适合的PH、适时光照等。,区分几个概念：,分化：在个体发育中，相同细胞的后代在形态、结构和生理功能上发生差异的过程，具有普遍性、持久性、稳定性和不可逆性。分化的结果是形成不同的组织器官，帮助个体完成正常的生长发育。 脱分化（去分化）：由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程。脱分化有利于细胞全能性的表达。动物细胞的卵细胞有帮助动物细胞核脱分化的作用。 再分化：愈伤组织经过培养，又重新分化成根或芽等器官的过程。由于愈伤组织是由已经分化的植物器官、组织或细胞脱分化产生的，所以把这次分化叫再分化。,植物体细胞杂交： 运用远缘杂交与染色体工程技术培育成具优良性状的 新品种，如“小偃六号”小麦新品种具抗病、抗旱、抗 干热风等特性，目前已推广到全国。,不足：在粮食作物、经济作物上开展较少。,打破了不同种生物间的生殖隔离限制，大大扩展了可用于杂交的亲本组合范围。,植物体细胞杂交的过程：,融合体,杂种细胞,去壁的常用方法：,原生质体融合方法：,植物体细胞杂交和多倍体育种：,染色体,方法,原理,不同点,原生质体融合和 组织培养,染色体数目变异,获得杂种植株,秋水仙素,加倍，同种,不一定加倍，不同种,植物体细胞杂交与杂交育种：,不同点,植物体细胞杂交,杂交育种,原理,杂交性质,染色体变化,亲本来源,育种年限,基因重组,原生质体融合和 组织培养,有性杂交,无性杂交,与亲代相同,与亲代不同,不一定同种，种间杂种,同种，种内杂种,1-2年,4-5年,通过改变细胞内遗传物质，达到改变植物体性状的目的，培育出符合人们要求的新品种,细胞工程的主要成就,2、动物细胞工程方面,最突出成就就是胚胎移植，使牲