《蛋白质的分离纯化》PPT课件.ppt

蛋白质的理化性质及分离纯化,第一节 蛋白质的理化性质,第二节 蛋白质的分离纯化,第三节 蛋白质的分子量测定,第四节 蛋白质的含量测定与纯度鉴定,第一节 蛋白质的理化性质,一、蛋白质的酸碱性质,二、蛋白质的紫外吸收性质,四、蛋白质的变性和复性,五、蛋白质的呈色反应,三、蛋白质的胶体性质和沉淀,一、蛋白质的酸碱性质,在某pH时蛋白质所带正电荷与负电荷恰好相等，即蛋白质的净电荷为零时的pH称等电点（pI）。,没有其他盐类干扰时, 蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等离子点。,蛋白质等电点：,蛋白质等离子点：,二、蛋白质的紫外吸收性质,蛋白质溶液能吸收一定波长的紫外光，主要是由带芳香环的氨基酸决定的。其在280nm处对紫外吸收能力的强弱顺序为：,色（ Trp ） 酪（ Tyr ） 苯丙（ Phe ）,三、蛋白质的胶体性质和沉淀,蛋白质的分子大小属于胶体质点的范围。蛋白质溶液是一种稳定的亲水胶体（具有水化层和双电子层）。,蛋白质溶液具有胶体的一般性质：布朗运动、丁达尔效应以及不能通过半透膜。,半透膜：多是由用赛咯吩（cellophane）制造，赛咯吩膜是半通透的膜，蛋白质等大分子不能透过膜，但小分子可以透过。,（一）蛋白质的胶体性质,（二）蛋白质的沉淀,蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。如果条件发生改变,破坏了蛋白质的稳定性,蛋白质就会从溶液中沉淀出来。 蛋白质溶液的稳定性与质点大小、电荷和水化作用有关,那么任何影响这些条件的因素都会影响蛋白质的稳定性。,沉淀蛋白质的方法有以下几种: 中性盐沉淀法、有机溶剂沉淀法、重金属盐沉淀法、生物碱试剂和某些酸类沉淀法、加热变性沉淀法.,盐析：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐(如：硫酸铵,硫酸钠或氯化钠等),使蛋白质表面的电荷被中和，蛋白质分子脱去水化层而聚集沉淀。,1.中性盐沉淀法（盐析法）,注意： 盐析一般不引起蛋白质变性。当除去盐后,蛋白质又可溶解。,2. 有机溶剂沉淀法,向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂(如甲醇,乙醇或丙酮等) 引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀。,3. 重金属盐沉淀法,当溶液pH大于等电点（pI）时,蛋白质颗粒带负电荷，这样它就容易与重金属离子(Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等)结合成不溶性盐而沉淀。,应用 ：误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋白质进行解救,然后再服用催吐剂排出体外。,4. 生物碱试剂和某些酸类沉淀法,生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂： 如：鞣酸（单宁酸,tannic acid) 钨酸(tungstic acid，H2WO4)、苦味酸(picric acid)即2,4,6-三硝基酚, 碘化钾等。 某些酸类: 三氯醋酸, 磺基水杨酸（sulfosalicylic acid）和硝酸等.,5. 加热变性沉淀法,几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。 当蛋白质处于等电点时,加热凝固最完全和最迅速。,加热变性引起蛋白质凝固的原因： 可能是由于热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点也破坏了带电状态。,四、蛋白质的变性和复性,蛋白质变性的定义： 环境的变化或是化学处理都会引起蛋白质天然构象的破坏，并伴随着生物活性的丧失、溶解度的降低以及其它理化常数的改变，这一过程称为蛋白质变性。,蛋白质的复性： 蛋白质的复性当变性因素除去后，变性蛋白质又重新回复到天然构象的现象成为蛋白质的复性。,五、蛋白质的呈色反应,蛋白质的呈色反应,第二节 蛋白质的分离纯化,一、蛋白质分离纯化的一般步骤,二、蛋白质的分离纯化方法,主要是根据蛋白质在溶液中的性质不同对蛋白质进行分离。,（一）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法,主要方法： 1：透析（dialysis）和超过滤（ultrafiltration） 2：密度梯度（区带）离心 3：凝胶过滤法,1：透析和超过滤（利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质）,透析流程,透析装置,超过滤装置,使用压力或者离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜（半透膜），达到浓缩蛋白质溶液的目的。,装好具备密度梯度的介质溶液,离心,加入：混和蛋白质样品,离心装置,2：密度梯度（区带）离心,3：凝胶过滤法,凝胶过滤是按照蛋白质分子大小进行分离的技术，又称凝胶层析、分子筛层析或排阻层析。 凝胶过滤法是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。,（1）凝胶过滤的介质,凝胶过滤所用的介质是装在凝胶柱里的凝胶珠（或称凝胶颗粒、凝胶球）。 其内部是多孔的网状结构，单个凝胶珠本身象个“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同 。,凝胶柱,凝胶过滤分离蛋白质的流程,这样大小不同的蛋白质就被分离开来了。,依次洗脱收集后，通过紫外吸收法测定吸收峰。,（二）根据蛋白质溶解度不同的纯化方法 （蛋白质的胶体和沉淀性质）,主要方法： 1：等电点沉淀和PH值控制 2：蛋白质的盐溶和盐析 3：有机溶剂分级分离法 4：改变温度,1.等电点沉淀和PH值控制,即在不改变其它条件的情况下，PH处于等电点时的蛋白质溶解度达到最低点。而位于等电点两侧的PH条件下蛋白质的溶解度迅速上升。,由于不同的蛋白质等电点不同，因此可以通过控制溶液的PH值来沉淀混合物中的某种蛋白成分。,通过这种办法沉淀出来的蛋白质可以保持天然构象，能重新溶解于一定浓度的溶液中。,2.蛋白质的盐溶和盐析,盐溶（salting-in） ：低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为蛋白质的盐溶现象。,同浓度二价中性盐对蛋白质溶解度的影响比单价中性盐大的多。,盐析（salting-out） ：当溶液中的离子强度达到一定的数值时（盐浓度高达一定数值时），蛋白质的溶解度开始下降，很多蛋白质可以从水溶液中析出，这种现象称为盐析。,3.有机溶剂分级分离法,与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇和丙酮等） 能使蛋白质在水中的溶解度显著降低，在室温下，这些有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。,这种沉淀的主要原因是有机溶剂的加入改变了介质的介电常数。,4.改变温度分离蛋白质,040oC之间：大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加， 例外：025oC，人的血红蛋白溶解度随温度上升而降低。 4050oC以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性。,一般蛋白质的分级分离操作一般都在04oC温度下进行。,（三）根据蛋白质电荷不同的纯化方法,主要方法： 电泳 离子交换层析,电泳概述,由于蛋白质在指定的PH溶液中所带电荷和分子量不同，形状不同，在电场中泳动速度不同。 因此根据这一原理就可以从蛋白质混合液中将各种蛋白质分离开来，所以电泳技术已成为分析、分离蛋白质的重要手段之一。,1.聚丙烯酰胺凝胶电泳,(polyacrylaminde gel electrophoresis) PAGE电泳,它以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，一般制成凝胶柱或凝胶板（不连续体系）。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),SDS-PAGE:是用SDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂（通常为巯基乙醇）先对待分离的蛋白质样品进行预处理（加热煮沸35分钟）。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳装置,点样,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳装置,2.毛细管电泳, 泛指高效毛细管电泳、毛细管区带电泳、自由溶液毛细管电泳和毛细管电泳。 用途：分离多种生物分子，包括氨基酸、肽、蛋白质、DNA片段（例如合成的寡核苷酸）和核酸以及多种小分子，如药物、甚至金属离子。用样量530l 1mg/ml溶液。,3.等电聚焦电泳,等电聚焦或称电聚焦，是一种高分辨率的蛋白质分离技术，它也可用于蛋白质等电点的测定。,蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质（如浓蔗糖溶液）中进行电泳的。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦（停留）在等于其等电点的pH梯度处，并形成一个很窄的区带。,等电聚焦可以把人的血清分成40多个条带。此技术特别适用于同功酶的鉴定。只要它们的pI有0.02（甚至0.02）pH单位的差别就能分开。,实际上是利用缓冲液在电场作用下在凝胶内沿电场方向制造一个pH梯度。所用的缓冲液是低分子量的有机酸和碱的混合物，该混合物称之两性电解质。,等电聚焦电泳装置,当蛋白质样品在这样的凝胶上电泳时，每种蛋白质都将迁移至与它的pI 相一致的pH处，具有不同pI的各种蛋白质最后都迁移至凝胶中相应的pH处，达到分离的目的。,4.蛋白质的双向电泳（two-dimensional electrophoresis）,将等电聚焦电泳与SDS-PAGE结合起来的电泳技术。,等电聚焦电泳,SDS-PAGE,双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。 所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开。,是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。,5.层析聚焦(P310),填充到层析柱中的树脂有阳离子交换型和阴离子交换型。,6.离子交换层析(P310),以阳离子交换型树脂为例,将带有耐酸性非常强的磺酸根SO3-Na（以盐的形式出现）的强阳离子交换树脂（固定相）填充到层析柱中。,结合到层析柱上的蛋白质的洗脱有不同的洗脱方式：,利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同而达到分离目的。,典型的吸附剂：硅胶,氧化铝和活性炭等. 主要用来分离非离子、水不溶性化合物,（四）利用选择性吸附的纯化方法(P312),亲和层析(affinity chromatography)：是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力, 即生物学亲和力，建立起来的一种有效的纯化方法。 经常只需一步处理即可将某种所需蛋白质从复杂混合物中分离出来，纯度相当高。,(五) 利用与配体的特异生物学亲和力的纯化方法(P313),亲和层析,把某一待纯化蛋白质的特异配体通过适当的化学反应共价地连接到像琼脂糖凝胶这一类的载体表面。,样品,层析柱,蛋白质的分离纯化方法,分子大小： 溶解度： 电荷： 吸附性质： 对配体分子的亲和力：,透析和超过滤、密度梯度（区带）离心、凝胶过滤法,等电点和PH值控制、盐溶盐析、有机溶剂分级分离、变温度,电泳、离子交换层析,亲和层析,第三节 蛋白质分子量的测定(P291-299),一、根据化学组成测定最低相对分子质量,用化学分析方法测定出蛋白质中某一微量元素的含量,可以计算出蛋白质的最低相对分子质量。 如Fe，并假设每个蛋白质分子中只有1个Fe原子，则由此可算出蛋白质的最低相对分子质量。,例如:某种蛋白含铁量为0.335%, 其最低相对分子质量(假设此蛋白只含有一个铁原子如肌红蛋白)可按下式计算出:,若此蛋白含4个铁原子（如血红蛋白） ，则： Mr = 16 700486 600,即某蛋白的真实 Mr = 16 700n （n为含有的铁原子的数目）,渗透现象：溶剂分子由纯溶剂（或稀溶液）向溶液（或浓溶液）单方向的净移动现象。,二、根据渗透压法测定相对分子质量,R: 气体常数； T：绝对温度； ：渗透压； c: 溶质的浓度。,注意事项：尽量采用等电点或者接近等电点的缓冲溶液做为半透膜内外的溶剂，以避免PH值对渗透压的影响。,渗透压法测定蛋白质分子量的优缺点： 优点：装置简单，准确度相对高。 缺点：不能区别所测蛋白质溶液中的蛋白质样品是否均一。如果溶液含多种蛋白质成分，那么测出的是几种蛋白质的平均分子量。,（三）蛋白质的扩散和扩散系数,扩散（平移扩散）：由于浓度差引起的溶质分子的净迁移。,扩散系数D：在数值上等于当浓度梯度为一个单位时，在一秒钟内通过1cm2面积所扩散的溶质量。,（四）沉降分析法测定相对分子质量,需转速为60,00080,000rpm的超速离心机,沉降：蛋白质分子在溶液中受到强大的离心力作用时，如果蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会发生沉降，沉降的速度与蛋白质的分子大小、形状、密度以及溶液的性质有关。,1. 沉降速度法测定相对分子质量,沉降系数(s):单位离心场的沉降速度。,界面移动的速度即沉降速度，溶质的相对分子量越大，则界面移动越快，若溶液中有几种溶质，则离心之后就会出现几个界面。界面移动的速度可以借助适当的光学系统来观察。,如人血红蛋白沉降系数s=4.46S，即4.461013秒。 为了比较起见，在不同温度和溶剂中测得的沉降系数需要换算成标准条件下的s值。沉降系数的标准条件定为20C,溶剂为水。校正后的沉降系数用s20，w表示。,大部分生物大分子的沉降系数介于110-13到20010-13秒的范围。因此：把10-13秒作为一个单位，称为斯维得贝格单位或称沉降系数单位，用S(大写)来表示。 即：1S10-13秒,蛋白质分子量与沉降系数的关系,2. 沉降平衡法测定相对分子质量,利用较低转速（800020000 r/min）进行。由于分子颗粒沉降造成浓度梯度，因而产生了扩散作用。,利用凝胶过滤可以把蛋白质混合物按分子的大小分离开来,（五）凝胶过滤法测定相对分子质量,洗脱过程,如果某种蛋白质与一理想的非水化球体具有相同的过柱速度即相同的洗脱体积（elution volume）,则认为这种蛋白质具有与此球体相同的半径,称蛋白质分子的斯托克半径。 因此,标准蛋白质(已知Mr和斯托克半径)和待测蛋白质必须具有相同的分子形状(接近球体),否则不能得到比较准确的Mr。,注意：分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用的蛋白质,则不能用此方法测定Mr。,Gel filtration column,1966年Andrews提出了一个经验公式,方法简便，仪器简单。 不纯样品亦可，只要找出活性峰位置（Ve）即可。,(六) SDS PAG