基于明胶微冰胶的注射型三维细胞支架对人间充质干细胞培养的实验研究

单位代码 10006 学 号 10101007 分类号 TP242 毕业设计(论文)基于明胶微冰胶的注射型三维细胞支架对人间充质干细胞培养的实验研究 院（系）名称生物与医学工程学院 专业名称生物工程 学生姓名冯丝雨 指导教师杜亚楠、李 舟2014年 6 月 北京航空航天大学毕业设计（论文） 第 页基于明胶微冰胶的注射型三维细胞支架对人间充质干细胞培养的实验研究 冯丝雨 北京航空航天大学 北京航空航天大学本科毕业设计（论文）任务书、毕业设计（论文）题目：基于明胶微冰胶的注射型三维细胞支架对人间充质干细胞培养的实验研究 、毕业设计（论文）使用的原始资料（数据）及设计技术要求：基于清华大学杜亚楠教授实验室创建的微型冰胶细胞治疗载体，探究人间充质干细胞在这种三维支架中的生长情况，并与传统的二维平板培养进行对比。着重于关注细胞在三维支架中的存活率以及干性基因和修复皮肤损伤相关基因的表达，同时对实验数据进行分析和整理。期望将这种微型冰胶载体运用于皮肤组织工程中。以下为开展本实验需要掌握的技术：1. 生物学：二维细胞培养，三维细胞培养，细胞冻存和复苏等；RNA及DNA的提取（Trizol）以及浓度测定，反转录PCR和实时定量PCR（Real-time quantitative PCR），酶联免疫吸附实验（ELISA）等。 2. 材料学：明胶微冰胶制备； 3. 仪器：定量PCR（Applied Biosystem: Stepone Plus），RNA的浓度测定（Bio-Rad Nanodrop），倒置荧光显微镜，电子显微镜。 、毕业设计（论文）工作内容：1)可注射明胶微冰胶的电子显微镜（SEM）照片，以及孔隙率（Porosity）和溶胀比（Swelling Ratio）数据； 2)三维中细胞接种时的接种效率（loading rate）统计； 3)二维平板培养和三维微冰胶培养中人间充质干细胞（hMSCs）的增值（Proliferation）情况比较； 4)从基因水平对比人间充质干细胞在二维或三维生长环境中干性相关基因（Oct4, Sox2, Nanog）表达差别； 5)从基因水平对比人间充质干细胞在二维或三维生长环境中某些功能基因（如VEGF、bFGF、EGF，PDGFbb）表达差别； 6)从蛋白水平（ELISA）对比人间充质干细胞在二维或三维生长环境中某些生长因子（如VEGF、bFGF、EGF、PDGFbb）表达差别。 、主要参考资料：1 Du, Y., Liu, W., Li, Y., Feng, S., Ning, J., Chen, H., & Xu, F. (2014). Magnetically Controllable 3D Microtissues Based on Magnetic Microcryogels. Lab on a Chip. 2 Liu, W., Li, Y., Zeng, Y., Zhang, X., Wang, J., Xie, L., Li, X., Du, Y., Microcryogels as injectable 3D cellular micro-niches for site-directed and augmented cell delivery, Acta Biomaterialia (2013). 3 Baker B M, etc. Deconstructing the third dimensionhow 3D culture microenvironments alter cellular cuesJ. Journal of cell science, 2012, 125(13): 3015-3024. 4 Nombela-Arrieta C, Ritz J, Silberstein L E. The elusive nature and function of mesenchymal stem cellsJ. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2011, 12(2): 126-131. 5 David J. Mooney, Herman Vandenburgh. Cell Delivery Mechanisms for Tissue Repair. Cell Stem Cell Volume 2, Issue 3, 6 March 2008. 生物与医学工程 院（系） 生物工程 专业类 101011 班学生 冯丝雨 毕业设计（论文）时间： 自 2014年 2 月 10日至 2014 年 5 月 26 日答辩时间： 年 月 日 成绩 指导教师： 兼职教师或答疑教师（并指出所负责部分）： 教研室主任 注：任务书应该附在已完成的毕业设计（论文）的首页。本人声明我声明，本论文及其研究工作是由本人在导师指导下独立完成的，在完成论文时所利用的一切资料均已在参考文献中列出。作者：冯丝雨签字：日期：2014年5月26日 北京航空航天大学毕业设计（论文） 第40页基于明胶微冰胶的注射型三维细胞支架对人间充质干细胞培养的实验研究 学 生：冯丝雨 指导教师：杜亚楠、李 舟摘 要皮肤组织工程是一门新兴的边缘学科，它利用生物学和工程学原理研究，构建出用于修复和再生损伤组织功能的替代物。细胞治疗是利用成体功能细胞或干细胞对组织、器官进行修复的治疗方法，也是皮肤组织工程中的一种新手段。目前针对创伤修复的基于细胞治疗的组织工程方法存在着细胞存活率低、细胞游离扩散（无法定点治疗）、手术创伤等问题。因此，亟需一种可注射型、高强机械性、多孔连通的三维细胞载体用于皮肤创伤修复。本毕业设计基于明胶微冰胶的注射型多孔连通三维支架具有较强的吸附膨胀能力，可自主将细胞及其微环境的各组分吸附于多孔空间内部，为细胞的粘附与增殖提供了良好的生存环境，同时在细胞的移植传输的过程中起到了保护和定点治疗的作用。本实验通过在传统二维平板和三维明胶微冰胶支架中培养人间充质干细胞（hMSCs），来比较在两种生长环境中细胞的存活、增殖情况，以及干性基因和某些皮肤损伤修复相关的生长因子基因的表达。本实验验证了三维明胶微冰胶支架不仅具有良好的生物相容性，也能促进hMSCs干性基因表达和生长因子的分泌。该课题对于探索三维培养环境对于干细胞功能的影响，并创造更实用高效的皮肤组织工程产品具有广阔的发展前景和应用价值。关键词：皮肤损伤修复，细胞治疗，明胶微冰胶，干性基因，生长因子Experimental Investigation of Human Mesenchymal Stem Cells Based on Three-dimensional Injectable Gelatin MicrocryogelsAuthor :FENG SiyuTutor :DU Yanan, LI ZhouAbstractSkin tissue engineering is a burgeoning interdisciplinary subject, constructing substitutes for repairing skin wound with the help of biological and engineering principles. Cell-based therapy is a treatment using mature functional cells or stem cells to repair unhealthy or damaged tissues and organs. And it is also a promising treatment in the area of skin tissue engineering. Nowadays, cell-based therapies for skin wound are facing these main problems of poor cell viability, cell diffusion, surgical trauma, etc. Therefore, an injectable, robust and macroporous 3D scaffold is critically-needed in skin wound healing treatment.This project was based on injectable gelatin microcryogels which are macroporous scaffolds with a good swelling ability. They can absorb cells as well as their microenvironment components, providing preferable niches for cells adhesion, survival and proliferation. In the meantime, they can protect fragile cells and achieve on-site delivery during the transplantation process. This project cultured human mesenchymal stem cells (hMSCs) on standard 2D culture dishes and 3D gelatin microcryogels respectively. We compared the cell survival, cell proliferation, gene expressions of stemness genes and growth factors related to skin wound healing using these two different culturing methods. This research not only proved the satisfactory biocompatibility of gelatin microcryogels, but also demonstrated that they could enhance the expression of stemness genes and secretion of several growth factors of hMSCs. This study has a broad development prospect and an important value for investigating the real effects of three-dimensional culture on cells and creating more effective products for skin tissue engineering.Key words：Skin wound healing, Cell therapy, Gelatin microcryogels, Stemness, Growth factors目 录1绪论11.1课题背景及目的11.1.1.组织工程11.1.2.皮肤组织工程21.1.3.细胞治疗31.1.4.三维细胞培养41.1.5.实验目的51.2国内外研究现状61.2.1.皮肤组织工程的研究61.2.2.细胞治疗的发展状况81.3本课题研究系统111.4论文构成及研究内容132实验材料和实验仪器142.1实验试剂与耗材142.1.1明胶微冰胶的制备142.1.2原代细胞及细胞系142.1.3原代hASC分离及细胞培养试剂与耗材142.1.4细胞死活染色及活性检测142.1.5RNA提取，cDNA合成及real-time PCR试剂与耗材152.1.6酶联免疫吸附152.2主要仪器153实验方法及步骤173.1可注射明胶微冰胶的制备173.2脂肪来源间充质干细胞（Adipose-derived hMSCs）的分离183.3hMSCs接种于明胶微冰胶183.4扫描电子显微镜（SEM）观察193.5三维细胞形态和细胞活性的测定193.6实时荧光定量PCR（qRT-PCR）223.7酶联免疫吸附实验(ELISA)234实验结果与讨论254.1明胶微冰胶的形态及其物理性质254.2细胞在明胶微冰胶中的存活情况264.3明胶微冰胶材料的细胞装载效率以及生物相容性274.4实时定量PCR检测干性基因的表达294.5实时定量PCR检测生长因子基因的表达314.6酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测生长因子蛋白水平的表达33结 论34致 谢35参考文献361 绪论1、1.1 课题背景及目的1.1.1. 组织工程组织及器官的结构损伤或功能障碍是我们面临的主要健康危害之一，也是引起人类疾病和死亡的最主要原因。随着生物医学的发展，疾病的治疗方式已得到了极大改进，但组织器官严重损伤后修复缓慢、或由于创伤过大而导致组织器官无法修复，使得组织工程和再生医学成为当今生物医学的研究热点1. 。研究人员试图通过获取患者自体细胞，经过体外培养，形成具有特定功能组织、器官并移植回患者体内，通过再生功能从根本上解决组织、器官的修复与重建。在这种背景下，组织工程学便逐渐发展起来的，它是一门利用工程学和医学科学的原理和方法来研究哺乳动物正常和病理组织的结构和功能关系，研制生物代用品，以恢复维持或改善其功能的一门边缘学科2. 。组织工程不仅具有独特的科学地位，而且还凭借其技术、治疗效果上的相对优势以及巨大的社会、经济价值，在国际学术界及世界各国政府中都受到高度重视与积极关注。图 1.1 组织工程的基本组成要素3. 1.1.2. 皮肤组织工程皮肤是人体最大的器官，是人体与外界环境相接触的屏障，具有排泄、调节体温、防止水分蒸发、感觉、免疫等重要的功能，皮肤对人体的重要性不言而喻4. 。在现实生活中，常会因为创伤、烧伤、慢性溃疡、糖尿病等原因造成皮肤的缺损。任何直径大于4cm的全层皮肤缺损人体将无法通过自身来完全愈合瓶5. 。皮肤损伤这种临床常见病通过自体皮片移植可减少体液丢失，防止创面感染，副作用是会导致创面收缩，疤痕形成。在这些情况下，就需要有一种合适的创面修复材料来促进伤口的愈合。皮肤组织工程是一门新兴的边缘学科，它是利用生物学和工程学原理研究，构建出用于修复、维持和改善损伤组织功能的组织替代物6. 。组织工程皮肤在临床上已经使用了25年，为大面积皮肤损伤患者的康复带来了诸多益处，可以从根本上解决皮肤修复的问题，因而具有良好的发展前景7. 。图 1.2 皮肤的解剖学结构图 1.3 皮肤创伤修复不同阶段示意图（多种细胞参与的过程）1.1.3. 细胞治疗细胞治疗作为再生医学的新兴手段，已经逐渐成为临床医学发展的重要方向。以细胞治疗为代表的再生医学逐渐成为临床医学发展的重要方向，为应对药物治疗难于见效的复杂重大疾病带来了新的希望。细胞治疗是利用成体功能细胞或干细胞对组织，器官进行修复的治疗方法8. 。目前利用细胞治疗心血管疾病9. 、角膜病变10. 、帕金森病11. 、糖尿病12. 、软骨组织损伤13. 以及肿瘤14. 等顽症的研究已有大量报道，并且在临床应用中取得了初步效果。特别是基于干细胞治疗的研究与应用取得了多项突破性进展。干细胞是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的细胞，经适当诱导，可分化为多种功能的细胞，例如心肌细胞，血管内皮细胞，肝细胞等。利用干细胞的多潜能特性，治疗临床上组织损伤、坏死性疾病，从而达到组织再生，替代等目的，实现了以干细胞治疗技术为基础的再生医学理念。图 1.4目前常用的两种细胞移植的形式：游离细胞直接注射和种植细胞的支架通过手术移植1.1.4. 三维细胞培养我们知道，体外建立适合细胞和组织生长的生理微环境对再生医学研究至关重要。而传统的单层平面培养（基于商业化的培养皿或多孔板）的细胞无论是在形态、结构和功能方面都与在体内自然生长的细胞相去甚远。由于无基质支持，细胞仅能贴壁生长，从而失去其原有的形态特征及生长分化能力。研究表明，相比于细胞的两维培养，体外三维微环境的模拟有利于细胞的增值和分化，保持细胞干性，使体外培养的细胞与体内环境状态下的细胞更加相近15. 。因此三维细胞培养技术在近年来备受关注，并得到了大幅度的发展16. 17. 。注：细胞所面对的环境在胞外基质包被的玻璃或者树脂基底上（二维）和典型的三维胞外基质如胶原中有非常显著的差异。二维环境中（上图）：缺乏可溶性因子梯度、底极性差异、连续单层的胞外基质、高硬度底板、受限于二维平面的黏着斑分布、不受限制的平面铺展和迁移；三维环境中（下图）：具备可溶性因子梯度、没有细胞极性差异、不连续的基地纤维、较低硬度基质、三维分布的黏着斑、受限的细胞铺展和迁移图 1.5 二维和三维环境中细胞所处的粘附的、表面拓扑结构的、力学的和可溶性因子的微环境18. 1.1.5. 实验目的本毕业设计基于明胶微冰胶的注射型多孔连通三维支架具有较强的吸附膨胀能力，可自主将细胞微环境的各组分吸附于多孔空间内部，为细胞的粘附与增殖提供了良好的生存环境。这种三维架构不仅可能增强细胞某些干性基因或者功能性基因的表达，同时对在细胞治疗细胞的移植和传输起到了支撑和保护的作用。本实验期望通过在二维和三维体系培养人间充质干细胞（hMSCs），来比较在两种生长环境中（传统二维平板与三维微冰胶）细胞的存活、增殖情况，以及干性基因和某些生长因子基因表达的动态变化，分析三维培养手段在可注射细胞治疗中（尤其是修复损伤皮肤方面）的可行性。该项目对于探索三维培养环境对于干细胞功能的影响，并创造更实用高效的皮肤组织工程产品具有广阔的发展前景和应用价值。1.2 国内外研究现状1.2.1. 皮肤组织工程的研究目前常用作组织工程皮肤支架材料5. 的天然高分子有海藻酸钠、胶原蛋白、甲壳素、壳聚糖、葡聚糖、透明质酸、明胶脂等，因为其本身有类似于细胞外基质的结构，具有促进细胞的黏附增殖和分化的优点。目前，天然材料来源较为广泛、制作简单、且价格低廉，但它也存在力学性能较差、降解速率不宜控制、引起免疫法反应等问题。目前较为成熟的胶原凝胶支架人工皮肤是美国公司研制的人工皮肤Apigraf19. 。它一种活性人皮肤替代物，是通过先在牛胶原凝胶中接种成纤维细胞形成细胞胶原凝胶，再接种表皮细胞培养而成。与传统凝胶相比，Apigraf对大疱性表皮松懈症的治愈速度较快且能减缓伤口带来的疼痛治愈过程中无副反应。海藻酸盐是一种从海带等褐藻中提取的天然多糖。海藻酸盐多孔膜支架一般也由冷冻干燥法制备。一些研究结果表明，冷冻干燥法制备的海藻酸钙多孔支架具有开放、贯通的多孔结构，孔径范围在100300um之间， 利于细胞生长和物质传输。另外，研究表明，用冷冻干燥法制备了海藻酸盐海绵状组织工程支架20. 的孔隙率和机械性能会受到海藻酸盐的类型、浓度、交联剂浓度等因素的影响，通过控制这些变量，可以制备出适合细胞培养的海绵状支架。图 1.6 Apigraf实物图除了天然材料之外，聚合物因其具有良好的生物相容性以及可控的降解速率、力学性能而被广泛用作制备皮肤组织工程支架材料。2000年，美国公司生产的另一种人真皮替代物Dermagraft22. 被FDA批准用于临床。Dermagraft是将成纤维细胞接种在可降解的聚乳酸纤维网上，形成由成纤维细胞、细胞外基质和可降解生物材料构成的人工真皮。研究表明，Dermagraft与传统疗法相比，能使溃疡面得到较快的治愈且相关并发症发生几率较小。其中所选用的聚乳酸就是美国FDA最早批准的一种可降解吸收的聚合物支架材料，无毒并且有较好的相容性。图 1.7 Dermagraft示意图复合支架材料在新兴材料中占据很大比例，而聚合物共混是一种为组织工程提供新型理想材料的有效方法，已成为目前组织工程生物材料研究的热点。近年来提出的复合材料有海藻酸钠-壳聚糖23. ，胶原-壳聚糖，壳聚糖-明胶，壳聚糖-聚己内酯，聚乳酸-聚乙二醇等体系。与单纯的海藻酸钠支架相比，海藻酸钠-壳聚糖复合支架24. 表现出更好的细胞粘附性及促进细胞增殖的能力，因此这种复合材料可以用于制备组织工程支架，引导细胞行为，是一种非常有潜力的复合材料。另外，胶原作为皮肤支架材料存在力学性能差等缺点，而壳聚糖从强度和降解速度上均难以满足组织工程细胞培养的需要。有研究者将壳聚糖与胶原复合以获得新型人工皮肤支架材料，希望此复合支架在综合性能上更符合皮肤组织工程的要求25. 。 注：（A）聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）支架；（B）胶原-壳聚糖支架；（C）PLAG-胶原-壳聚糖复合支架横截面图；PLAG-胶原-壳聚糖复合支架底面图图 1.8 复合支架材料的电子显微镜照片25. 尽管目前已经有皮肤组织工程产品应用于临床，并取得了不错的疗效，但由于存在着生相容性、免疫原性、形成瘢痕等问题，至今还没有一种完美的皮肤支架材料获得学术界的认可。因此设计一种既具备良好的生物相容性，适合细胞粘附、增殖、发挥功能的物理结构，同时可以满足柔韧性及机械强度等基本要求的三维细胞支架是皮肤组中工程中的关键难题。1.2.2. 细胞治疗的发展状况目前，细胞治疗已经走进了临床实验的新阶段。新技术不断涌现，主要有以下不同的方法：1)直接将分离出的具有生物功能的细胞直接注射于病患处。这是一种较常规有效的操作简便的临床细胞治疗手段。但是，注射后较低的细胞存活率以及细胞进入体内的不可控性，很大程度上制约着基于直接注射干细胞治疗在临床上的大规模应用。研究表明，采用直接注射法，注射后细胞体内存活率仅仅50%-60%，长期观察发现，仅少于3%的注射细胞在受损部位起到组织修复作用，其余大部分出现死亡和遗失现象。其中的原因可能是：（1）注射过程中，由于注射器内机械剪切力的影响，部分细胞出现破裂，降低了细胞的存活能力。（2）体外游离的干细胞进入体内受损组织区域内，细胞所处的微环境发生改变，而病灶区域的微环境不利于细胞存活与生长，从而降低了细胞的存活率。（3）直接注射干细胞于机体内于部分注射部位由于机械运动或组织部位内外压强差等原因，造成注射进靶点组织的细胞会随着注射器的拔出而从针孔处溢出（4）游离干细胞移植进体内后，细胞会随着体液向组织四周不定向游离，进而造成大量移植细胞流失，无法定点治疗。2)新的基于生物材料辅助细胞移植系统的构建可以解决直接移植细胞所产生的众多问题，为组织器官修复技术带来了新突破。这种生物材料辅助细胞移植的技术，一方面可运用组织工程技术，结合种子细胞、生物材料和生长因子的特性，在体外进行组织器官培养，将成熟的体外培养器官替换受损组织，从而维持、恢复甚至促进受损组织的功能。然而，大体积异物移植的免疫排斥性，手术过程的创伤性及术后伤口愈合等问题，制约着这种新技术的发展。3) 因此一种无创性，降低排异反应，操作简便的细胞治疗方法成为了研究者们关注的焦点。通过注射等无创或微创方式将具有一定功能特性的细胞传输到体内，实现受损组织器官修复的再生医学治疗理念逐渐显示出其优势和良好的应用前景。Byung-Soo Kim26. 为避免手术创伤性影响，制备出由大量人脂肪来源的干细胞（hADSCs）聚集而形成的细胞微球，将制备完成的细胞微球通过注射器注射到小鼠下肢缺血性部位，治疗效果明显。图 1.9 (a). 体外培养三天的hADSC细胞微球（H&E组织学染色图片和电镜图片）；(b). 体外培养三天后细胞微球大小分布统计26. PX Ma27. 设计了一种中空自组装式可注射型的细胞载体，通过注射方法将干细胞移植到受损组织内，进行组织修复与再生。图 1.10 不同放大倍数的中空可注射细胞载体电镜图27. K.L. Fujimoto28. 利用一种可降解的温敏性水凝胶作为细胞传输载体，在温度较低时，细胞悬于液态水凝胶溶液中，通过注射定点注射到受损组织后，悬有细胞的水凝胶溶液处于体内温度时立即形成水凝胶，并聚集于注射区域内，从而达到细胞定点治疗的效果。注：(a) 冷的凝胶溶液; (b) 37 C 孵育30秒之后的水凝胶; (c) 37 C 孵育10分钟之后的水凝胶; (d) 10分钟之后拉扯水凝胶有很好的延展性图 1.11温敏性水凝胶(NIPAAm-co-AAc-co-HEMAPTMC)实物图28. 但是在这些设计中都有不同的缺点，第一种方法制备的细胞微球形态大小不均一，可塑性较差，注射过程中对表层细胞的损伤依然无法避免。第二种自组装载体在合成制作上较为复杂，制成的大量细胞载体形态均一性较差，载体的自主吸附细胞的能力较弱，从而影响细胞传输与治疗的效率。第三种设计中，一方面水凝胶的三维系统存在着传质问题，影响细胞存活，另一方面此方法无法避免注射机械力对细胞的损伤，降低细胞的存活率，且在注射过程中，细胞将参与成胶的过程，也会对细胞造成一定的损害，从而严重影响了细胞移植的临床治疗效果。综上所述，面对细胞治疗的复杂性及遇到的种种困难，亟需一种可注射型，微尺度级，高强机械性、可塑性强，多孔连通的细胞三维微环境载体，不须改变传统细胞治疗的操作方法和条件即可方便实现。1.3 本课题研究系统明胶（gelatin）是一种来源于胶原的天然蛋白，它本身含有可以促进细胞粘附和酶降解过程肽序列。除此之外，其低成本、低免疫原型以及较好的医用安全性等特点使明胶成为一个很理想的可移植入体内的生物材料29. 30. 。冰胶（cryogel）作为一种新型的细胞载体在细胞载体方面也备受关注。与传统室温成胶的水凝胶不同的是，冰胶是在零度以下的低温中利用冰晶致孔的原理形成的31. 。制备成冰胶的生物材料既可以是合成材料如聚乙二醇双丙烯酰酯（PEGDA）等，也可以是天然材料如胶原，明胶，海藻酸钠透明质酸等。冰胶的优点包括良好的生物相容性，低免疫源性，较强的机械性能，以及良好的多孔连通性与气液传递性等。为了实现可注射的目的，本实验没有选取常用的只能靠手术植入的大尺度冰胶（毫米甚至厘米级别），而是将冰胶微型化，做成了直径在微米级别的明胶微冰胶。这种微冰胶具有很强的伸缩性能，能够在顺利通过注射器针头之后快速恢复原来的形状，这在注射过程中起到了很好的保护内部装载细胞的效果。图 1.12 海藻酸钠制成的冰胶在注射前后保持体积和形状不变31. 人间充质干细胞（hMSCs）是在体外仍然具有成骨、成脂肪、成软骨、成血管等多向分化潜能的从哺乳动物骨髓或其他组织中（脂肪、骨骼肌、滑膜等）分离的间充质基质细胞。MSCs能保持多向分化潜能，遗传背景稳定，无免疫排斥反应，易于临床应用，是组织工程中理想的种子细胞18. 。今年在在临床前的实验模型和初期的临床试验中都验证了MSCs对于创伤愈合、促进血管新生和疤痕修复方面都有重要作用32. 33. 。MSCs不仅可分泌多种造血相关因子，如VEGF、EGF、IL-6、IL-7和GM-CSF等，同时也是成纤维细胞、内皮细胞、脂肪细胞等多种基质细胞的前体细胞。因此我们认为注入体内具有活性的MSCs，可利用其强大的旁分泌功能、自我更新以及增殖分化成相应基质细胞的能力，修复皮肤损伤，利于血管重建、组织再生。图 1.13 间充质干细胞和多能间充质基质细胞：可分化为成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞等多种不同细胞类型18. 。本课题采用的是一种基于明胶的微型冰胶三维支架，人间充质干细胞在其中能够贴附，并且正常生长繁殖。本实验室中之前的工作已经证明了这种小胶对于下肢缺血的治疗有较好的效果，不仅能防止肢体溃烂截肢，还能新生血管防止肌肉萎缩，醋精运动功能的恢复。本次研究旨在探索这种微冰胶对于皮肤组织工程的应用潜力，通过对比二维平板培养和三维微冰胶培养中细胞干性基因和生长因子基因表达的变化，企图证明明胶微冰胶培养体系能够促进hMSCs对于皮肤损伤组织修复的功能。除此之外，这种柔韧性和机械性都很强的微型小胶能够方便的注射到体内，在未来的临床应用中将有非常广阔的前景。1.4 论文构成及研究内容本论文的构成包括：第一章绪论，主要介绍本实验研究的课题背景及目的，以及国内外相关实验研究进展，并且介绍了皮肤组织工程和细胞治疗的发展历程和现状，同时解释了本课题选用的研究系统；第二章实验材料和实验仪器，第三章是实验方法及简要操作步骤。这两章主要是对整个课题所用到的实验材料和仪器的来源有详细的描述，同时对重要实验技术的原理、操作步骤、反应条件选择给出了详细的解释。第四章是实验结果与讨论，包括明胶微冰胶的形态及其物理性质、细胞在明胶微冰胶中的存活情况、明胶微冰胶材料的细胞装载效率以及生物相容性、实时定量PCR检测干性基因和生长因子基因的表达、酶联免疫吸附测定法检测生长因子蛋白水平的表达这些部分。该章节详细叙述了某些实验条件、实验方法的选择依据，并且对实验数据进行了统计分析，对实验结果进行了讨论和深入思考，奠定了实验结论的基础。2 实验材料和实验仪器2.1 实验试剂与耗材2.1.1 明胶微冰胶的制备明胶粉末（Sigma Aldrich公司）戊二醛溶液（Sigma Aldrich公司）聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)板 (Sunjin Electronics Co)特制顶板（由聚二甲基硅氧烷即PDMS制成）70m细胞筛网（BD Biosciences, USA）硼氢化钠粉末（Sigma Aldrich公司）2.1.2 原代细胞及细胞系人脂肪源间充质干细胞（hMSCs）：成人脂肪样品取自医科院整形医院。所有样品均签订知情同意书。2.1.3 原代脂肪来源hMSCs分离及细胞培养试剂与耗材Ficoll-Paque 分离液：比重1.077g/ml（PHarmacia 公司）MCDB和DF12（GibcoBRL公司）培养基：H-DMEMOpti-MEM培养液（Gibco/BRL公司）进口胎牛血清（Gibco公司，BD公司）国产胎牛血清（天津血液研究所）表皮细胞生长因子：epidermal growth factor, EGF（ Gibco/BRL公司）血小板衍生生长因子：platelet-derived growth factor BB（Sigma Aldrich公司）胶原酶、胰蛋白酶和谷氨酰胺（GibcoBRL公司）青霉素和链霉素（华北制药厂）培养板：T75、T25培养瓶，6孔板、24孔板、48孔板、96孔培养板（Costar公司）其它：分析纯级二甲基亚砜（北京益利化学公司）；NaCl、KCl、CaCl2、NaOH、Na2HPO412H2O、EDTA （天津市化学试剂二厂）2.1.4 细胞死活染色及活性检测活细胞染料：钙黄绿素-AM （Dojindo公司，Japan）死细胞染料：碘化丙啶（Sigma Aldrich公司）细胞活性检测试剂（CellTiter-Blue，Promega公司）2.1.5 RNA提取，cDNA合成及real-time PCR试剂与耗材TRIZOLTM Reagent核酸分离试剂盒（Gibco/BRL 公司）75乙醇: DEPC 处理过的ddH2O配制氯仿：无任何添加剂DEPC (焦碳酸二乙酯)水（天根生化公司）无菌无酶Eppendorf Tube（Ep管）和Tip（牛牛基因公司）cDNA合成试剂盒（天根生化公司）2PCR master Mix（天根生化公司）Real Time PCR试剂盒（Takara公司）引物：所有引物均由上海Sangon公司合成，经过PAGE 纯化2.1.6 酶联免疫吸附Na2Co3-NaHCO3缓冲液（天津市化学试剂二厂）0.05%Tween-20的PBS洗液（Sigma Aldrich公司）VEGF，EGF，bFGF 和PDGF-BB四种生长因子的抗体TMB底物液、过氧化氢液、硫酸、酶标板2.2 主要仪器激光雕刻机（Rayjet laser system,Australia）等离子体清洗机（Mycro Technologies, USA）冷冻干燥机（Boyikang, China）冰箱（海尔）超低温冰箱 电子天平（Denver，USA）纯水仪（Millipore，USA）扫描电子显微镜（FEI Quanta 200, USA）超净工作台（苏州净化设备厂）37恒温、5% CO2细胞培养箱（Thermo, USA）；倒置光学显微镜（Nikon Eclispse Ti-S）；调温低速离心机（日本，KUBOTA KR）；常温台式离心机（Heraeus sepatech）；微量可调移液器（Eppendorf 公司）恒温水浴箱（北京长安仪器厂）NanoDrop 2000超微量分光光度计PCR 扩增仪（Bio Rad刘老师那个）Model-550型酶联仪（BioRad）实时定量PCR扩增仪（BioRad CFX96）3 实验方法及步骤3.1 可注射明胶微冰胶的制备本部分为清华大学医学院生物医学工程系杜亚楠研究员实验室原创的核心技术（已申请国家专利，发明创造名称“基于微冰胶构建注射型三维细胞微环境的系统和方法”201210553882.5）。本人在毕设期间详细学习了该项技术，并根据本实验具体情况予以适当优化，优化后的实验步骤简述如下：1) 明胶微冰胶预聚物溶液的制备:将明胶粉末配置成质量体积比为6%的溶液，在冰上（保证低温环境，防止室温成胶）加入0.3%戊二醛溶液使其充分混合后即配成微冰胶预聚物溶液。2) 微加工模具基于聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)板的制备: 利用AutoCAD软件绘图，设计模具。本实验先绘制出长75cm，宽25cm的长方形，并于此长方形内设计直径为400um的圆形，按照45x14的阵列分布排列，故每版可以容纳约600个微冰胶。用激光雕刻机，在300m的PMMA板上雕刻切割出所需的模具。3) 微加工模具的亲水处理：雕刻切割完毕后，清洗并烘干模板。将干净的模具置于等离子体清洗器内，进行表面活性处理 1分钟以促进微冰胶水溶液的进入。4) 取200ul配制好的预聚物溶液均匀的滴加在PMMA模具上，用盖玻片将模具表面上的反应液缓慢均匀的刮进模具内的孔隙中。将填充好预聚物溶液的模具在-20条件下冷冻16小时成胶。5) 反应结束后用冷冻干燥机（-50，20Pa）干燥30分钟，得到多孔明胶微冰胶。6) 用特制顶板（PDMS制成）将微冰胶自PMMA模具上定出，并通过70m细胞筛网收集。7) 使用0.1mol/L NaBH4清洗微冰胶，中和未交联的戊二醛。再用去离子水冲洗3次，置于小皿中铺成单层。再放入-20条件下冷冻1小时，取出后冷冻干燥机内干燥30分钟，得到游离存在的明胶微冰胶，真空储存备用。图 3.1明胶微冰胶制备示意图（上）以及实物图（下）3.2 脂肪来源间充质干细胞（Adipose-derived hMSCs）的分离成人脂肪组织取自吸脂手术患者（中国医学科学院整形医院），与供者签订知情同意书，供者均为2535岁的健康女性。从脂肪组织中分离hMSCs细胞的方法简述如下：采用吸脂术采集出来的脂肪组织用D-Hanks洗去血细胞和麻醉药，0.2% II型胶原酶消化30min，之后用D-Hanks洗涤2遍以除去胶原酶。离心收集细胞，细胞以2106/ml的密度接种于T75，培养液含58% DMEM/F12 + 40%MCDB-201、2%胎牛血清（FCS）、10ng/ml EGF、10ng/ml PDGF，1胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸（Insulin-Transferrin-Selenium，ITS）、1亚油酸-牛血清白蛋白（linoleic acid-bovine serum albumin，LA-BSA）、50M 巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、100g/ml青霉素和100U/ml硫酸链霉素（传代培养时不用双抗），置于37、5%CO2、95%湿度的培养箱培养。24h后将培养液及其中未贴壁的细胞吸出，重新种到新的T75中，原瓶更换新鲜培养液，以后每3d换液。当细胞达70%80%汇合时，用0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA常规消化，细胞按照1：3进行传代。3.3 hMSCs接种于明胶微冰胶1) 明胶微冰胶消毒：细胞接种实验前，采用环氧乙烷（浓度800mg/L，温度30湿度30RH）进行消毒。2)消化细胞：hMSCs经胰酶消化后, 制备单细胞悬液，转移至15mL离心管中，计数，然后15200转/分钟，离心4min，去除上清液。3)计数并调整细胞悬液浓度：取20mL上述准备细胞悬液加入到完全培养基中,10倍稀释后进行计数,并根据计数结果，制备为浓度1107的细胞悬液。4)上述每60ul的hMSCs细胞悬液滴于600个明胶微冰胶（薄层平摊于一个小皿中），37，5C02培养箱中，使细胞贴壁1.5h。5)用平镊小心将明胶微冰胶转移至新的6孔板中上，并加入2ml培养基，37C培养箱进行培养。3.4 扫描电子显微镜（SEM）观察1)将hMSCs接种于明胶微冰胶中，两天后取样，用PBS液冲洗3次，每次5-10分钟。将明胶微冰胶置于2.5%戊二醛（4）中固定2h，然后再用 PBS冲洗3次，每次5-10分钟。 2)样本脱水：将明胶微冰胶依次置于30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇梯度和叔丁醇中脱水。3)由于明胶微冰胶为不导电材料，需要喷镀后才能观察。溅射喷金约60s，使明胶微冰胶表面均匀覆盖一层导电金膜。用双面胶将小胶固定在导电基底上后即完成样品制备工作。4)使用扫描电子显微镜 (FEI Quanta 200, USA) 观察明胶微冰胶结构形态和细胞在明胶微冰胶铺展情况和呈现的形态，并拍照。5)使用Image J（NIH）软件分析对明胶微冰胶的孔隙大小和孔隙率进行统计分析。3.5 三维细胞形态和细胞活性的测定1）细胞死活荧光染色观察三维中细胞的存活及其形态钙黄绿素-AM (Calcein-AM) 和碘化丙啶 (PI) 溶液可以分别对活细胞和死细胞染色，可用于同时对活细胞和死细胞进行荧光染色。染色原理是：Calcein-AM亲脂性很高，可透过细胞膜。但通过活细胞内的酯酶作用，Calcein-AM能脱去AM基，产生的Calcein能发出强绿色荧光 (激发: 490 nm，发射: 515 nm)。因此Calcein-AM仅对活细胞染色。另外， PI溶液只能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产