《发酵过程控制》PPT课件.ppt

第八章,发酵过程控制,本章内容,一、概述 二、代谢调控在发酵过程控制中的应用 1. 初级代谢物的生产调节 2. 次级代谢物的生产调节 三、温度对发酵的影响及其控制 四、pH对发酵的影响及其控制 五、溶解氧对发酵的影响及其控制 六、CO2和呼吸商对发酵的影响及其控制 七、基质浓度对发酵的影响及补料控制 八、高密度发酵及过程控制 九、泡沫对发酵的影响及其控制 十、自动控制技术在发酵过程控制中的应用,1. 过程控制的重要性,菌株特性(营养要求、生长速率、 呼吸强度、产物合成速率) 传递性能 物理：n、T、Ws 化学：pH、DO、浓度 过程控制的意义：最佳工艺条件的优选（即最佳工艺参数 的确定）以及在发酵过程中通过过程调节达到最适水平的 控制。,决定发酵单位(水平)的因素,外部环境因素,工艺条件,生物因素：,设备性能：,2. 发酵过程控制的一般步骤,确定能反映过程变化的各种理化参数及其检测方法 研究这些参数的变化对发酵生产水平的影响及其机制， 获取最适水平或最佳范围 建立数学模型定量描述各参数之间随时间变化的关系 通过计算机实施在线自动检测和控制，验证各种控制 模型的可行性及其适用范围，实现发酵过程最优控制,3. 参数检测,代谢参数按性质可分为三类： 物理参数：温度、搅拌转速、罐压、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等 化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、 pH、产物浓度、核酸量等 生物参数：菌丝形态、菌体浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、摄氧率、关键酶活力等,3. 参数检测,参数按获取方式可分为两类： 如T、pH、罐压、空气流量、搅拌转速、溶氧浓度等 如摄氧率()、呼吸强度(QO2)、比生长速率（) 、体积溶氧系数(KLa)、呼吸商(RQ)等。,直接参数：,间接参数：将直接参数通过公式计算获得的,参数，,3. 参数检测,参数的测量形式 离线测量：基质（糖、脂类、无机盐等）、前体和代谢产物（抗生素、酶、有机酸、氨基酸等） 在线测量：如T 、pH、DO、溶解CO2、尾气CO2、黏度、搅拌转速等 优点：及时、省力，可从繁琐操作中解脱出来，便于计算机控制。 困难：传感器要求较高。,对传感器的要求 能经受高压蒸汽灭菌； 传感器及其二次仪表具有长期稳定性； 最好能在过程中随时校正，灵敏度好； 探头材料不易老化，使用寿命长； 安装使用和维修方便； 解决探头敏感部位被物料（反应液）粘住、堵塞 问题； 价格合理，便于推广。,3. 参数检测,3. 参数检测,参数检测方法 温度测量 感温元件：热电偶（温度信号 电信号） 二次仪表：将热电偶输出的电信号转换成 被测介质的温度,参数检测方法 搅拌转速和搅拌功率的测量 搅拌转速：磁感应式，光感应式， 测速电机； 搅拌功率：功率表，测定力矩求功率法。,3. 参数检测,3. 参数检测,参数检测方法 空气流量测定 体积流量型： 会引起流体能量损失，受温度和压力变化的影响； 同心孔板压差式流量计； 转子流量计。 质量流量型： 根据流体固有性质（质量、导电性、热传导性能）设计的流量计。,参数检测方法 罐压测量 压力表 压力传感器,3. 参数检测,参数检测方法 料液计量与液位控制 压差法：H=（P2/P1）H 直接重量测量法：直接称重 体积计量法：计算进出料液 流量计量法：计算流量和时间 液位探针,3. 参数检测,参数检测方法 发酵液粘度测定 毛细管粘度计 回转式粘度计 涡轮旋转粘度计,3. 参数检测,参数检测方法 pH测量 复合pH电极 pH测量仪器,3. 参数检测,参数检测方法 溶解氧的测量 化学法 极谱法 复膜氧电极法,3. 参数检测,复膜氧电极示意图 （a）极谱型 （b）原电池型,参数检测方法 溶解二氧化碳测量 复膜式电极法 渗透膜碳酸氢钠法 发酵尾气的在线分析 CO2分析 O2分析,3. 参数检测,参数检测方法 细胞浓度的测量 化学法：如DNA、RNA分析等 物理法：如重量分析、分光光度分析、 浊度分析等 新技术：以电容法为测量原理的在线 活细胞浓度测量传感器,3. 参数检测,原位活细胞在线检测仪,1. 初级代谢物的生产调节,初级代谢物：指一类低分子量的终点产物及这些终点产物的生物合成途径中的中间体。 (1) 避开固有的反馈调节 (2) 细胞通透性的变更,反馈调节包括 反馈抑制：某一生物合成途径的最终代谢物抑制该途径的第一或第二个酶的活性。 反馈阻遏：抑制酶的形成，是由途径终点产物或其衍生物施行的。,（1）避开固有的反馈调节,黄色短杆菌赖氨酸生物合成调节机制 1-天冬氨酸激酶；2-DDP合成酶；3-高丝氨酸脱氢酶； 4-琥珀酰高丝氨酸合成酶；5-苏氨酸脱氢酶,（1）避开固有的反馈调节,方法 限制菌在胞内积累终点产物的能力以解除负反馈调节作用 从遗传上改变酶的活性和酶的形成系统，筛选有抗反馈作用的基因突变型（对反馈作用不敏感）。 具体应用 积累中间产物 积累终点产物 耐反馈作用的突变株的筛选：抗结构类似物突变株,抗结构类似物突变株的筛选机制,末端产物类似物和末端产物结构类似，因而能够引起反馈作用，但是它们不能参与生物合成。在培养基中添加末端产物类似物后，未突变的细胞将由于代谢途径受阻而不能获得生物合成所需的该种末端产物，从而导致细胞死亡。那些对类似物不敏感的突变株仍能制造末端产物并长成菌落。 突变株耐结构类似物的原因： 酶的结构起了变化（指耐反馈抑制的突变株） 酶的合成系统起了变化（指耐反馈阻遏的突变株）,（1）避开固有的反馈调节,双突变株的概念：单一菌株内同时发生耐反馈抑制和耐反馈阻遏的突变作用。 思考题： 某一菌株对所要生产的产物的类似物有天然的耐受力，这种时候能否利用类似物筛选突变株呢？ 回复筛选：用突变除去反馈敏感的酶和用第二次突变置换它，常产生分泌终点产物的回复子。,细胞通透性的变更,细菌细胞膜通透性的增加是谷氨酸过量生产的原因之一。 能过量生产谷氨酸的细菌有两个共同特征： -酮戊二酸脱氢酶缺失：表明这类细菌的TCA上的酶受阻，保证了碳引向谷氨酸的合成歧路。 对生物素的营养需求：表明这类细菌的生物素的生物合成受阻，导致细胞膜通透性的改变，使细胞可以分泌出谷氨酸。,2. 次级代谢物的生产调节,(1) 次级代谢的特点及与初级代谢的关系 (2) 调节方法 诱导作用 避开固有的负反馈 操纵环境条件来控制次级代谢物的生物合成 耐负反馈调节的抗性突变株的筛选 初级代谢物的调节作用 能荷调节 e.g.磷酸盐影响金霉素的合成,（1）次级代谢的特点及与初级代谢的关系,次级代谢酶的特异性较初级代谢酶的特异性低，故受遗传及环境因素的影响大。 次级代谢物的合成途径比初级代谢的种类多，但大多数次级代谢物都是由少数关键中间代谢物组装的。 次级代谢产物的合成一般是在生长期后，即培养基中的养分快耗尽，菌的比生长速率降低时才合成。,操纵环境条件来控制次级代谢物的生物合成,改变培养基成分来避免分解阻遏作用 改变培养基成分来避免反馈抑制和阻遏作用 e.g.链霉素发酵中限制磷酸盐的加量，避免其对参与生物合成的磷酸酯酶的反馈抑制和阻遏作用 培养基中添加前体物来避免分支途径终产物对发酵产品的间接抑制作用,分解阻遏作用的解除主要是在多个碳源中选择慢碳源或者采用缓慢流加快碳源的工艺,在含有葡萄糖和乳糖的培养基中的青霉素发酵代谢曲线,耐负反馈调节的抗性突变株的筛选,筛选耐结构类似物的突变株 e.g. 不需添加色氨酸的硝吡咯菌素的高产菌株 回复筛选 e.g. 高产金霉素产生菌 筛选耐药性菌株 e.g. 利用抗生素筛选耐药性菌株,(三)温度对发酵的影响及其控制,1. 影响发酵温度的因素 2. 温度对微生物生长的影响 3. 温度对基质消耗的影响 4. 温度对产物合成的影响 5. 最适温度的选择与控制,(1)发酵热,发酵过程中所产生的热量，叫做发酵热。 Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q辐射,(2)生物热,来源 ：微生物对营养物质的分解所释放的能量 影响因素： 菌株 培养基成分 发酵时期 生物热与其它参数的关系 呼吸强度QO2 糖利用速率,当产生的生物热达到高峰时，菌的呼吸强度最大，糖的利用速率也最大，可用耗氧量、糖耗来衡量生物热。,2. 温度对微生物生长的影响,当时，可忽略，微生物处于生长状态。、皆与T有关，其关系均可用阿累尼乌斯公式描述： EE 死亡速率比生长速率对温度变化更为敏感,嗜冷、嗜中温、嗜热菌的典型生长与温度关系,2. 温度对微生物生长的影响(续),在其最适温度范围内，生长速率随温度升高而增加，当温度超过最适生长温度，生长速率随温度增加而迅速下降。 不同生长阶段的微生物对温度的反应不同 处于延迟期的细菌对温度的影响十分敏感。 对于对数生长期的细菌，如果在略低于最适温度的条件下培养，即使在发酵过程中升温，则升温的破坏作用较弱。 处于生长后期的细菌，其生长速度一般主要取决于溶解氧，而不是温度。,(1) 糖比消耗速率qs,Righelato假定： m维持因子，即生长速率为零时的葡萄糖的消耗。m项与渗透压调节、代谢产物的生成、迁移性及除繁殖以外的其它生物转化等过程所需的能量有关。这些过程受温度的影响，所以m也和温度相关。 B生长系数，即同一生长速率下的糖耗，B值越大，说明同样比生长速率下，用于纯粹生长的糖耗越大。 改变温度可以控制qs和,（2）T对B、m和的影响,qs一定： 当TTm时， m ， , B 底物转化效率低 当T=Tm时，,温度对B、m和不同qs下对值的影响,4. 温度对产物合成的影响,影响发酵过程中各种反应速率，从而影响微生物的生长代谢与产物生成。 e.g. 青霉菌发酵生产青霉素 青霉菌生长活化能E1=34kJ/mol 青霉素合成活化能E2=112kJ/mol 青霉素合成速率对温度较敏感,改变发酵液的物理性质，间接影响菌的生物合成 。 影响生物合成方向。 e.g. 四环素发酵中金色链霉菌：T30，产生金霉素；T达35 ，产生四环素； 谷氨酸发酵中扩展短杆菌： 30培养后37 发酵，积累过量乳酸。 温度对菌的调节机制关系密切 。,4. 温度对产物合成的影响,4. 温度对产物合成的影响,影响酶系组成及酶的特性。 米曲霉制曲：温度控制在低限，有利于蛋白酶合成 凝结芽孢杆菌的-淀粉酶热稳定性：55培养90保持60min，剩留活性为88%99%；35培养经相同条件处理，剩余活性仅有6%10%。,5. 最适温度的选择与控制,定义：最适温度是指在该温度下最适于菌的生长或产物的生成，它是一种相对概念，是在一定条件下测得的结果。 二阶段发酵 e.g.青霉素发酵：菌体生长期,30 青霉素合成分泌期, 20 ,最适温度的选择还要参考其它发酵条件灵活掌握 通气条件较差情况下，最适发酵温度可能比正常良好通气条件下低一些。 培养基成分和浓度的影响,5. 最适温度的选择与控制,变温培养：在抗生素发酵过程中采用变温培养比用恒温培养所获得的产物有较大幅度的提高。 e.g. 四环素发酵：030h稍高温度30150h稍低温度 150h后升温发酵 青霉素发酵：30, 5h25 , 35h 20 , 85h 25 , 40h；产量提高14.7,5. 最适温度的选择与控制,（四）pH对发酵的影响及其控制,1. 发酵对pH的影响 2. pH值对发酵过程的影响 3. 最适pH的选择 4. 发酵过程中pH的调节与控制,1）发酵液中pH变化的基本原理,微生物代谢对pH影响主要在两种情况下发生：酸性或碱性代谢产物的生成或释放；菌体对培养基中生理酸性或碱性物质的利用。 引起发酵液中pH下降的因素 （1）C/N过高，或中间补糖过多，溶氧不足，致使有机酸积累，pH下降； （2）消泡剂加得过多：脂肪酸增加； （3）生理酸性盐的利用； （4）酸性产物形成：如有机酸发酵。,1）发酵液中pH变化的基本原理（续）,引起发酵液中pH上升的因素 （1）C/N过低（N源过多），氨基氮（NH4）释放； （2）中间补料中氨水或尿素等碱性物质加入过多； （3）生理碱性盐的利用； （4）碱性产物形成。,2）发酵过程中pH的变化规律,生长阶段：pH相对于起始pH有上升或下降的趋势 生产阶段：pH趋于稳定，维持在最适于产物合成的范围 自溶阶段：pH又上升,（1）pH对微生物生长的影响,每一类菌都有其最适pH和能耐受的pH范围 细菌: pH 6.37.5 ；霉菌和酵母菌：pH 36； 放线菌：pH 78 控制一定的pH值，不仅保证微生物生长，而且防止 杂菌感染 e.g.石油代腊酵母： pH3.55.0：生长良好且不易染菌 pH5.0：酵母形态变小，发酵液变黑，且污染大量细菌 pH3.0：酵母生长受抑制，细胞极不整齐，且出现自溶,pH对生长的影响机制 对E合成的影响 对E活性的影响 对ATP生产率影响： 影响菌体细胞膜电荷状况，引起膜的渗透性的变化，因而影响菌体对营养物质的吸收和代谢产物的分泌。 影响培养基某些重要营养物质和中间代谢产物的离解，从而影响微生物对这些物质的利用,（1）pH对微生物生长的影响,（2）pH对产物合成的影响,产物合成阶段的最适pH值和微生物生长阶段的最适pH往往不一定相同，这不仅与菌种特性有关，还取决于产物的化学特性。 e.g. 丙酮丁醇菌：生长 pH为5.57.0；合成pH为4.35.3 青霉素产生菌：生长pH为6.57.2，合成pH为6.26.8 链霉素产生菌：生长pH为6.36.9，合成pH为6.77.3,pH影响代谢方向： pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。 e.g. 黑曲霉发酵：pH23, 柠檬酸；pH接近中性，草酸 酵母菌发酵：pH4.55.0，酒精；pH8.0，酒精、醋酸 和甘油 谷氨酸发酵：pH7.08.0，谷氨酸；pH5.05.8, 谷酰胺 和N-乙酰谷酰胺,（2）pH对产物合成的影响,（2）pH对产物合成的影响（续）,pH对青霉素发酵的影响： 在不同pH范围内加糖，青霉素产量和糖耗不一样。 pH范围 糖耗 残糖 青霉素相对单位 pH6.06.3加糖 10% 0.5% 较高 pH6.66.9加糖 7% 0.2% 高 pH7.37.6 加糖 7% 0.5% 低 pH6.8控制加糖 7% 0.2% 最高 速率恒定(0.055%/h) *采用pH控制补糖速率的意义,3. 最适pH的选择,选择pH准则：获得最大比生产速率和合适的菌体量，以获得最高产量。,pH对产海藻酸裂解酶的影响,配制不同初始pH的 培养基，摇瓶考察 发酵情况,（1）pH调节方法,配制合适的培养基，有很好的缓冲能力； 发酵过程中加入非营养基质的酸碱调节剂 (NaOH、HCl、CaCO3)； 发酵过程中加入生理酸性或碱性基质，通过代谢调节pH； 酸性基质：铵盐、糖、油脂、玉米浆(脱NH4) 碱性基质：NO3盐、有机酸盐、有机氮、氨水、尿素 原则: 残糖高时，不用糖调pH 残N高时，不用生理盐调pH pH控制与代谢调节结合起来，通过补料来控制pH,（2）pH控制方法比较,以青霉素发酵为例，最适pH为6.66.9 控制方案： 方案一：培养基中供应充足的糖，并配用pH缓冲剂 方案二：培养基中供应充足的糖，以非基质NaOH调节pH 方案三：在发酵过程中恒速补糖，以NaOH、H2SO4调节pH 方案四：改变补糖速率来控制pH为6.66.9,（3）pH控制系统,给定值,补料,pH电极,mA,420mA,（五）溶解氧对发酵的影响及其控制,1. 引起溶解氧变化的因素 2. 溶解氧对发酵的影响 3. 溶解氧在发酵过程控制中的重要作用 4. 发酵液中溶解氧的控制 5. 溶解氧控制实例,（1）影响溶解氧（DO）的因素,供氧 耗氧,两大类,以关系式表示： 影响供氧的因素： 影响耗氧的因素：,C*- CL,温度、溶质、溶剂、氧分压,KLa,设备参数、操作参数、发酵液特性,菌种特性、培养基成分和浓度、菌龄、培养条件（T、pH）、代谢类型,（2）发酵过程中溶氧变化规律,批式发酵无DO控制情况下，溶氧变化规律为“波谷现象”,溶氧、x、QO2、 随时间变化的关系,平衡点分析： 当CL，即 ，OTR ， OTR逐渐至OTR=，即 ，高位平衡 当处于高位平衡时，表明供氧性能好。高位平衡通常发生在正常情况的前、后期。,平衡点分析： 当CL（如对数生长期很大）， ，OTR ， ， ，称低位平衡。 低位平衡通常发生在正常情况下的对数期。,值得注意的几点,自然“波谷现象”，一般可以自适应调节（ ） 当 ，则需要控制，增加OTR，防止需氧受阻。 补料与“波谷现象”对应：即补料时间、剂量选择与溶氧变化有关。 a. 不能在波谷时补料，加重缺氧 b. 一次补料不能过量，防止 ， 菌体停止呼吸、死亡 c.每次补料都会引起一次大的溶氧下降。,（1）溶解氧对生长的影响,临界氧浓度（CCr）： 当 时, 当 时, 对生长应满足 , 但并不是越高越好,呼吸抑制,呼吸不受抑制,指不影响菌体呼吸所允许的最低 氧浓度。,（2）溶解氧对产物合成的影响,最适氧浓度（Cm）：溶氧浓度对产物合成有一个最适范围，CL过高或过低，对合成都不利。 e.g.卷须霉素：1270h之间，维持CL 在10%比在0或45%的产量要高。,（3）CCr与Cm比较：通常Cm与CCr不一致,对于某些菌株 CcrCm, 卷须霉素: 而有些菌株 Ccr Cm, 头孢菌素C：,Cm 8%,生长阶段要求CL CCr，生产阶段满足CLCm。,（1）发酵异常指标,发酵中污染杂菌，溶解氧发生异常变化。 对于好气性杂菌，溶解氧会一反往常在较短时间内跌到零附近，跌零后长时间不回升。 对于厌气性杂菌，溶解氧升高。 污染噬菌体或其它不明原因引起 发酵液变稀，此时溶解氧迅速上升。 操作故障或事故分析,谷氨酸正常发酵和异常发酵的溶解氧曲线 正常发酵溶解氧曲线 -异常发酵溶解氧曲线 异常发酵光密度曲线,（2）补料控制指标,中间补料是否得当可以从溶解氧的变化看出。 发酵过程中出现“发酸”现象，此时溶解氧很快下降。,（3）代谢方向控制指标,测量溶解氧可以确定CCr、Cm值 通过溶氧测量可以掌握由好气转为厌气培养的关键时机 e.g.天门冬酰胺酶发酵：45%饱和度 在酵母以及其他微生物菌体的生产中，溶氧值是控制其代谢方向的最好的指标之一 。,（4）设备性能、工艺合理性指标,评价设备性能、工艺合理性的最终指标：发酵单位 设备反映供氧性能： 搅拌桨形式 叶片形式 搅拌器直径d 搅拌档数m和搅拌器间距s 档板宽度w和档板数z 通气：空气分布器的类型和位置 n，P/V 设备操作参数 罐压 WS或VVM,（4）设备性能、工艺合理性指标,工艺条件反映耗氧和供氧特征 菌种性能：耗O2 培养基性能：耗O2、供O2 温度：耗O2、供O2 RQ（O2与CO2水平比较）：耗O2 表面活性剂：耗O2、供O2,改进工艺：控制补料速度、T 的调节、中间补水、 添加表面活性剂等等,工艺的改进是否有效可通过溶解氧水平进行评价： P/V的改变对溶解氧和产量的影响 e.g.利福霉素发酵：5080h波谷阶段，P/V，KLa，供氧；3W/L比1 W/L批号的发酵单位增加约900u/ml 搅拌转数n 对溶解氧和产量的影响 e.g.赤霉素发酵：15 50h期间，n从155 提高至180r/min， 赤霉素单位,（1）溶解氧控制的一般原则,生长阶段： 即可 产物合成阶段： 即可 过高的溶氧水平反而对菌体代谢有不可逆的抑制作用,（2）溶解氧控制作为发酵中间控制的手段之一,控制原理 发酵过程中， 糖量 x , QO2 CL 糖量 QO2 CL 补糖使CL下降，而CL回升的快慢取决于供氧效率。 对于一个具体的发酵，存在一个最适氧浓度（Cm）水平，补糖速率应与其相适应。,，加大补糖速率,，减小补糖速率,实现用溶解氧水平控制补料速率,补糖速率控制在正好使生产菌处于所谓“半饥饿状态”，使其仅能维持正常的生长代谢，即把更多的糖用于产物合成，并永远不超过罐设计时的KLa水平所能提供的最大供氧速率。,控制原则,（2）溶氧控制作为发酵中间控制的手段之一,控制方法 溶氧和补糖控制系统 溶氧和pH控制的系统,（2）溶氧控制作为发酵中间控制的手段之一,溶氧在加糖控制上的应用,溶氧与pH协同控制系统,（3）溶解氧控制的工艺方法：从供氧、需氧两方面考虑,供氧方面： 提高氧分压（氧分含量），即 ，提高供氧能力 改变搅拌转速：通过改变KLa来提高供氧能力 通气速率Ws ：Ws增加有上限，引起“过载”、泡沫 提高罐压： ，但同时会增加CO2的溶解度，影响pH及可能会影响菌的代谢，另外还会增加对设备的强度要求。,改变发酵液理化性质（， ，Ii） 加消泡剂，补加无菌水，改变培养基成分改变KL 改变温度： ，提高推动力（C*CL）,（3）溶解氧控制的工艺方法（续）,供氧方面：,（3）溶解氧控制的工艺方法（续）,耗氧方面 限制性基质的流加控制（补料控制）：在OTR一定情况下，控制基质浓度限制、x 限制 控制溶解氧,（4）溶解氧自动控制系统,改变通气速率的溶氧控制系统 改变搅拌转速的溶氧控制系统 改变通气量、转速、罐压所组成的多参数溶氧控制系统,溶解氧对被孢霉合成花生四烯酸 (AA) 的影响,溶氧量对AA产量的影响 注：摇床转速150r/min, 25,KLa越大，培养基中溶解氧越多, AA合成速度越快,溶解氧控制对鸟苷产量的影响,不同的DO控制条件下鸟苷积累的比较,DO()：5，l0，20，30,发酵过程 DO 变化与鸟苷 积累的关系,DO 控制在1020，产物积累，鸟苷含量最高。DO在5和30，前期产物积累，但后期基本不增加. DO水平的超高阶段(发酵周期28h44h)，鸟苷积累量基本不增加；调整DO 在适当水平上，鸟苷积累量继续上升。,（六）CO2和呼吸商对发酵的影响及其控制,1. 定义 2. 发酵过程中CO2释放率的变化 3. CO2对发酵的影响,1. 定义,呼吸商（RQ）：指菌体呼吸过程中，CO2释放率和菌的耗 氧速率之比，RQ反映菌的代谢情况。 菌体耗氧速率 OUR，molO2/Lh 菌体CO2释放率CER，molCO2/Lh,（1）影响尾气中CO2浓度的因素,通入空气量： 呼吸强度： CO2溶解度： 菌体量：,（2）CER变化规律,CO2积累量渐增，与x曲线对应，基本类似S型曲线变化； 当工艺和设备参数一定的情况下，CER与x有比例关系（CER菌体生长速率）； CO2浓度变化与O2浓度变化成反向同步关系。,CERdt，菌体干重的时间曲线 1- CERdt；2-菌量,（3）CER的测量与计算,测量方法：热导、红外分析仪、质谱仪 计算,（1）研究参数CO2的意义,作为代谢产物或中间前体，尾气中CO2积累与生物量 成正比，通过C质量平衡估算生长速率和细胞量。 高浓度CO2对发酵多表现为抑制作用，应实施测量与 控制； 尾气CO2不仅直接反映代谢情况，而且和其它参数及补料操作密切相关，可作为工艺优化的指标。,（2）CO2对细胞的作用机制,“麻醉”作用 CO2及HCO3-都会影响细胞膜的结构，使膜的流动性及表面电荷密度发生变化，导致许多基质的跨膜运输受阻，影响了细胞膜的运输效率，使细胞处于“麻醉”状态，细胞生长受到抑制，形态发生改变。,（3）CO2对菌体生长及产物形成的影响,CO2, 基质分解速率，ATP ，中间产物或形态变异导致产量 高浓度CO2抑制作用的独立性: 只要CO2在培养液中浓度过量，即使供氧充足（CLCCr），CO2的抑制作用不能解除，这种负作用在放大过程更明显。 正确评价通气的作用： 供氧： 排废气： 水分及挥发性组分的散失,（4）CO2释放与发酵过程参数pH及操作参数补糖速率的关系,在青霉素发酵中补糖将引起排气CO2增加，同时pH下降。 糖、CO2、pH三者的相关性，被青霉素工业生产上用于补料控制的参数，并认为排气CO2的变化比pH变化更为敏感，所以测定排气CO2释放率 （CER）来控制补糖速率。 补糖与溶氧及pH协同控制 补糖速率与CER控制,补糖对排气CO2和pH的影响,（4）尾气CO2与O2的相关性,相关程度表示： 尾气CO2与O2相关性：反向同步关系 呼吸商（RQ）与发酵的关系 不同菌株、同一菌株不同代谢途径、同一菌株利用不同基质、同一菌株在不同发酵阶段，RQ值不相同。 RQ值可以表征发酵状况。,青霉素发酵不同阶段： 菌体生长阶段：RQ0.909 维持阶段：RQ=1 生产阶段：RQ=4 如果产物的还原性比基质大时，其RQ值就增加；反之，当产物的氧化性比基质大时，RQ值就要减少，其偏离程度决定于单位菌体利用基质形成产物的量。,产物形成对RQ影响最大,（七）基质浓度对发酵过程的影响及补料控制,1. 基质浓度对发酵的影响 2. 补料控制,（1） 基质浓度对微生物生长的影响,sKS情况下，比生长速率与基质浓度呈直线关系： 一般情况下符合Monod方程式 基质浓度高时,(2) 基质浓度对产物合成的影响,低浓度限制 低水平诱导 高浓度抑制及分解阻遏作用 e.g.葡萄糖氧化酶发酵：葡萄糖用量从8%降至6%，补入2%氨基乙酸或甘油，使酶活力分别提高26%或6.7%。 谷氨酸发酵（乙醇为碳源）：当乙醇浓度为2.5g/L和35g/L时，可延长谷氨酸生产时间，但在更高浓度下，菌体生长受到抑制，谷氨酸产量降低。,（1）补料的目的,解除基质过浓的抑制 解除产物的反馈抑制 解除分解代谢物阻遏作用 避免因一次性投糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多而造成波谷现象。 在生产上，补料还经常作为纠正异常发酵的一个重要手段。,（2）补料的内容,补充微生物能源和碳源 补充菌体所需要的氮源 补充微量元素或无机盐 添加前体、诱导剂等,（3）补料的原则,中间补料的数量为基础料的13倍 。 补料的原则就在于控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的方向发展。 现有的各种补料措施都是通过实验方法确定的。,大多数补料分批发酵均补加生长限制性基质 以经验数据或预测数据控制流加； 用传感器直接测定限制性基质的浓度，直接控制流加； 以溶氧、pH、RQ、排气中CO2分压及代谢物质浓度等参数间接控制流加； 以物料平衡方程，通过传感器在线测定的一些参数计算限制性基质的浓度，间接控制流加。,（4）补料控制的策略,（5）反馈控制参数的确定,为了有效地进行中间补料，必须选择恰当的反馈控制参数，以及了解这些参数与微生物代谢、菌体生长、基质利用以及产物形成之间的关系。 e.g. 谷氨酸发酵 在谷氨酸发酵过程中的某阶段，生产菌的摄氧率和基质消耗速率之间存在着线性关系。,（6）补料速率的确定,优化补料速率是补料控制中十分重要的一环，补料速率要根据微生物对营养等的消耗速率及所设定的培养液中最低维持浓度而定。 补糖速率最佳点与设备的供氧能力有关。 e.g.青霉素发酵：KLa大的设备补料速率相应大些；供氧低的设备，补料速率相应减少，产量比供氧能力好的设备降低23。,（7）实例：四环素发酵中的补糖控制,补糖时间对四环素发酵单位的影响,补糖时间适当 （ 45h后加） 补糖时间过晚 （62h开始加） 补糖时间过早 （20h后加）,维持不同还原糖水平的四环素发酵中流加补糖的作用,补糖对四环素发酵的影响,在最适补加葡萄糖的条件下，能正确控制菌丝量的增加、糖的消耗与发酵单位增长三者之间的关系，就可获得比采用丰富培养基时更长的生物合成期。,维持不同还原糖水平的四环素发酵中流加补糖的作用,（八）高密度发酵及过程控制,1. 高密度发酵 2.高密度发酵策略 3.高密度发酵技术 4.高密度发酵存在的问题,1. 高密度发酵,代谢产物的合成是靠菌体作为生产者来完成的。 高细胞密度发酵就是为了适应这一要求而得到广泛的重视。 高密度发酵：在发酵过程中保持较高的细胞密度，同时细胞或菌体的生产能力保持在较佳的状态。,高细胞密度发酵成功的实例,2.高密度发酵策略,使用最低合成培养基以便进行准确的培养基设计和计算生长得率。 优化细胞生长速率，使得碳源能被充分利用和获得较高的产率，用养分流加来限制菌的生长速率还能控制培养物对氧的需求和产热速率。 可用碳源作为限制性养分，且采用补料分批发酵来实现高密度发酵。,3.高密度发酵技术,用于高密度发酵的生物反应器类型： 搅拌罐，透析膜反应器， 气升式反应器，气旋式反应器 在工业化生产中，通常采用的是搅拌罐与补料工艺来进行高细胞密度发酵。 重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键技术是补料策略，限制性基质（葡萄糖）的流加模式有3种：恒速流加补料、变速流加补料和指数流加补料。,4. 高密度发酵存在的问题,水溶液中的固体与气体物质的溶解度，基质对生长的限制或抑制作用，基质与产物的不稳定性和挥发性，产物或副产物的积累达到抑制生长的水平，高浓度的CO2与热的释放速率，高的氧需求以及培养基的粘度不断增加等 。,1. 泡沫的产生及其影响,泡沫的产生 通气和搅拌 代谢气体的逸出 存在稳定泡沫的表面活性物质,1. 泡沫的产生及其影响,泡沫的类型 一类存在于发酵液的液面上。这类泡沫气相所占比例特别大，并且泡沫与它下面的液体之间有能分辨的界线。如在某些稀薄的前期发酵液或种子培养液中所见的泡沫。 另一类出现在粘稠的菌丝发酵液当中。这种泡沫分散很细，而且很均匀，也较稳定。泡沫与液体间没有明显的波面界限，在鼓泡的发酵液中气体分散相占的比例由下而上地逐渐增加。,泡沫的不利影响 降低了发酵罐的装料系数 增加了菌群的非均一性 增加了染菌机会 大量起泡引起“逃液”，导致产物的损失 泡沫严重时会影响通气搅拌的正常进行 消泡剂的加入将给提取工序带来困难,1. 泡沫的产生及其影响,2.发酵过程中泡沫的消长规律,影响因素 通气搅拌的强度 培养基的配比及原材料组成 培养基的灭菌方法和操作条件 微生物代谢活动造