仙鱼汤对Lewis肺癌荷瘤小鼠免疫功能的影响.doc

仙鱼汤对Lewis肺癌荷瘤小鼠免疫功能的影响作者：胡艳，曹洋，易华，谭开基，陈锐深【摘要】 【目的】观察仙鱼汤对Lewis肺癌荷瘤小鼠免疫功能的影响。【方法】选用C57BL/6J小鼠50只，腋窝皮下接种Lewis肺癌细胞株复制肺癌模型，接种24 h后随机分为5组：模型组，环磷酰胺（CTX）组（剂量为20 mgkg-1d-1），仙鱼汤高、中、低剂量组（剂量分别为1.65、0.85、0.44 gkg-1d-1）；14 d后检测各组小鼠瘤体质量、抑瘤率、脾脏与胸腺指数、血清肿瘤坏死因子（TNF）和白细胞介素6（IL6）水平。【结果】仙鱼汤中、高剂量组可减轻瘤体质量，升高脾脏与胸腺指数，降低血清TNF、IL6含量，与模型组比较均有显著性差异（P0.05或P0.01）；仙鱼汤低剂量组可降低血清IL6含量（P0.05）；抑瘤率随着剂量的增加而逐渐增高。【结论】仙鱼汤的抗肿瘤作用可能与其能提高自身免疫功能从而抑制肿瘤生长有关。 【关键词】 仙鱼汤/药理学； 肺肿瘤/中药疗法； 肺肿瘤/免疫学； 疾病模型，动物； 小鼠仙鱼汤是广州中医药大学第一附属医院肿瘤科陈锐深教授多年治疗肺癌的临床经验总结，临床观察发现具有提高患者的生存质量、稳定瘤体的作用1。本研究观察了仙鱼汤对荷瘤小鼠免疫系统的影响，以进一步探讨仙鱼汤治疗肺癌的作用机理及途径，现报道如下。 1 材料与方法 1.1 动物 C57BL/6J小鼠，雌雄各半，体质量1822g，SPF级，由广州中医药大学实验动物中心提供（合格证号：0020535）。 1.2 瘤株 小鼠Lewis肺癌细胞株由中国医科大学肿瘤研究所提供，广州中医药大学第一附属医院中医肿瘤研究所长期移植传代。 1.3 药物及制备 中药仙鱼汤方组成：仙鹤草15g，鱼腥草30g,猫爪草30g,山海螺30g，党参15g,三七片10g，山慈菇10g，浙贝母15g，守宫5g，天冬15g，黄芪30g，炙甘草5g。由广州中医药大学第一附属医院加工，实验时用蒸馏水配制成所需浓度，制备后于4冰箱中贮存备用；环磷酰胺（CTX）注射用粉针剂为山西普德药业有限公司产品，批号：20060206，临用前用生理盐水溶解稀释浓度为2mg/mL。 1.4 试剂与仪器 肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素6（IL6）检测试剂盒采用晶美公司提供的美国进口试剂盒；NK3型自动分析酶标仪购自热电（上海）仪器有限公司。 1.5 Lewis肺癌荷瘤小鼠模型建立 于液氮罐中取出Lewis肺癌细胞株1支，置于37电热恒温水浴箱内，轻轻摇动令其尽快融化。取出冻存管，用酒精消毒后开启，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并滴加体积分数10%小牛血清RPMI1640培养基，常规离心，制成瘤细胞混悬液，台盼蓝计数约1107个 /mL。消毒小鼠右前腋，取0.2mL（约11062106瘤细胞）接种于皮下。传代3次，在无菌条件下剥离Lewis肺癌小鼠皮下瘤块，选取生长良好的瘤组织，剪碎、称质量，用细胞匀浆，按体积比13加生理盐水制成细胞混悬液，接种于C57BL/6J小鼠右前肢腋窝皮下，每只0.2mL。 1.6 分组及给药 接种24h后随机分为5组：仙鱼汤高、中、低剂量组，CTX组，模型组。仙鱼汤高、中、低剂量组分别予以0.4mL中药灌胃（剂量分别为1.65、0.85、0.44gkg-1d-1），CTX组予以0.2mL（剂量为20mgkg-1d-1）腹腔注射，模型组予以0.4mL生理盐水灌胃，均每天1次，给药14d。 1.7 肿瘤抑瘤率及脾脏、胸腺指数测定 末次给药24h后，处死小鼠，分离剥取肿瘤，电子天平称质量，记录结果，计算各组小鼠平均瘤体质量及肿瘤生长抑制率：p抑瘤=（mmodel-mtreatment）/mmodel100%。取脾及胸腺组织，电子天平称质量并计算脾脏指数：w脾=m脾（mg）/mbody(g)100%;w胸腺=m胸腺（mg）/mbody(g)100%。 1.8 血清TNF、IL6水平检测 给药后第15天，小鼠眼球后静脉取血，离心，取血清。酶联免疫吸附（ELISA）法检测血清中TNF、IL6的含量。严格按照试剂盒操作说明进行操作。 1.9 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理。 2 结果 2.1 仙鱼汤对Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用 表1结果表明，仙鱼汤中、高剂量组及CTX组均可减轻瘤体质量，与模型组比较差异有显著性意义（P0.05或P0.01）。仙鱼汤组随着药物剂量的增加，瘤体质量逐渐减轻，抑瘤率随着剂量的增加而逐渐增高。表1 各组对Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑制作用统计方法：方差分析；.，.1,与模型组比较 2.2 仙鱼汤对Lewis肺癌荷瘤小鼠免疫器官的影响 仙鱼汤高、中剂量组的脾脏指数、胸腺指数与CTX组和模型组比较均显著性升高（P0.05）。提示药物CTX对Lewis肺癌荷瘤小鼠具有一定的免疫抑制作用，而仙鱼汤则对Lewis肺癌荷瘤小鼠的免疫器官（脾、胸腺）具有一定的保护作用。结果见表2。 2.3 仙鱼汤对Lewis肺癌荷瘤小鼠血清细胞因子的影响 与模型组比较，仙鱼汤高、中剂量组及CTX组均能显著降低外周血中TNF、IL6含量（P0.05或P0.01）。结果见表3。表2 各组对Lewis肺癌荷瘤小鼠的脾脏指数及胸腺指数的影响统计方法：方差分析；.5，与模型组比较；.5，与CTX组比较表3 各组Lewis肺癌荷瘤小鼠血清细胞因子测定值比较统计方法：方差分析；.，.1，与模型组比较 3 讨论 近年来，我国肺癌发病率和死亡率呈持续上升趋势，许多地区特别是在城市肺癌已成为第一位死亡原因2。早期肺癌治疗可获得痊愈，但90%的患者发现时已属晚期，失去根治机会。目前采用中西医多学科综合治疗对提高患者的生存质量和延长生存时间有明显的疗效3。 仙鱼汤方是陈锐深教授多年治疗肺癌的临床经验总结，根据肺癌“痰、瘀、虚”病因病机特点，以健脾清肺、化痰祛瘀为法，选择党参、黄芪、浙贝母、猫爪草、三七、山海螺、仙鹤草、鱼腥草、守宫、炙甘草等组成，全方扶正祛邪，攻补兼施，临床应用多年，已证实具有较好的疗效1。 本研究结果显示仙鱼汤高、中剂量组可减轻瘤体质量，与模型组比较差异有显著性意义（P0.05），而且随着药物剂量的增加，体质量逐渐减轻，抑瘤率随着剂量的增加而逐渐增高，表明仙鱼汤具有一定的抑瘤作用，其抑瘤作用随着剂量的增加而增强。 免疫系统在控制肿瘤恶变中起着重要的作用，脾脏是机体最大的免疫器官，占全身淋巴组织总量的25%，含有大量的淋巴细胞和巨嗜细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心，通过多种机制发挥抗肿瘤作用。胸腺为机体免疫的主要调节者，是人类主要的中枢免疫器官，是T细胞分化、发育、成熟的场所，通过分泌胸腺激素，影响并调节T细胞的分化、发育和功能4。脾脏和胸腺结构的正常与否直接影响机体的免疫功能。胸腺指数和脾脏指数是反映机体胸腺和脾脏免疫功能的重要指征之一，其数值的变化可以反映机体免疫功能的状态。本实验结果表明：仙鱼汤高、中剂量组的脾脏指数、胸腺指数与模型组比较均有一定提高，表明仙鱼汤对Lewis肺癌荷瘤小鼠的免疫器官具有一定的保护作用。 肿瘤坏死因子和白细胞介素6等多种细胞因子对肿瘤的发生、发展转移等具有重要的意义，尤其是对肿瘤患者机体免疫应答的调节起着重要的作用5。TNF是一种主要由单核吞噬细胞产生的单核因子，TNF受体广泛地分布于多种肿瘤细胞和血细胞，不仅能选择性地杀伤某些肿瘤细胞，而且具有多种免疫调节作用6，其生物学作用与体内的水平高低密切相关，许多肿瘤患者血清TNF水平异常升高7-8。IL6是造血细胞、淋巴细胞、内皮细胞等增殖、分化的调节因子，其作用包括诱导B细胞增生和分化，促进T细胞的增生和激活T细胞的细胞毒作用，促进单核细胞的分化，促进或抑制某些肿瘤细胞的生长9，有关研究发现IL6及其受体的平衡失调会影响机体整个内环境的稳定，进而导致免疫功能的紊乱，直至诱导肿瘤的发生、发展10。本研究发现仙鱼汤能降低荷瘤小鼠外周血清TNF、IL6细胞因子水平，其中高、中剂量组血清TNF、IL6含量与模型组比较，差异有显著性意义（P0.05），表明仙鱼汤具有抑制荷瘤机体TNF、IL6水平异常升高的作用，使其维持在一定水平而发挥抗肿瘤及调节机体免疫功能的作用。 骨髓抑制及免疫功能降低是化学抗肿瘤药物的主要副作用之一，从本研究中可发现仙鱼汤方与环磷酰胺等免疫抑制剂的作用机理不同，仙鱼汤既能提高机体自身免疫，又具有抑制肿瘤生长的作用，表明通过调节和增强机体自身免疫功能可能是仙鱼汤方抗肿瘤的作用机制之一，充分体现了中医药扶正与袪邪兼顾、标本兼治的特点。【参考文献】 1李穗晖，陈锐深，吴玉生，等.仙鱼汤治疗中晚期原发性支气管肺癌40例疗效观察J.新中医，2006，38（9）：26.2沈洪兵，俞顺章.我国肺癌流行现状及其预防对策J.中国肿瘤，2004，13（5）：283.3刘嘉湘.中医药维护癌症患者生存质量的作用J.中华肿瘤杂志，2002，24（5）：309.4章育正.医学微生物学与免疫学M.上海：上海科技出版社，2006：2.5范维珂.现代肿瘤学基础M.北京：人民卫生出版社，2005：8.6窦肇华，张远强，郭顺根.免疫细胞学与疾病M.北京：中国医药科技出版社，2004：9.7Shimony J S,Mckinstry R C,Akbudak E,et al.Quantitative diffusiontensor anisotropy brain MR imaging:normative human data and anatomic analysisJ.Radiology,1999,213(3):770.8Le Bihan D,Mangin J F,Poupon C,et al.Di