噬菌体展示技术在食品安全检测中的应用.doc

南 京 农 业 大 学硕士研究生课程（考试试卷）论文 课程名称 现代微生物技术 姓 名 学 号 学 院 食品科技学院 任课教师 南京农业大学研究生院培养处印制噬菌体展示技术在食品安全检测中的应用摘要：噬菌体展示技术(phage display technology，PDT)是一种新兴的现代分析技术，能够准确、灵敏、快速、简便的检测出各种微生物、毒素、农药分子等。利用噬菌体展示技术检测食品中的微生物是近年来兴起的一个热门课题。本文简单介绍了噬菌体展示技术的基本原理，综述了噬菌体展示技术在食品安全检测中应用的研究进展。关键词：噬菌体展示技术；食品安全；检测Application of phage display technology in Food Safety DeterminationAbstract：Phage display technology (PDT) is one of modern analytical technology and can be applied to detect microorganisms, toxins and chemical pesticides in an accurate, fast and convenient manner. Moreover, the detection of food microorganisms using phage display technology (PDT) has been attracted extensive attentions in recent years. Current progresses in food safety determination through PDT are reviewed in this paper.Key words：Phage display technology (PDT); food safety; determination噬菌体展示技术(phage display technology, PDT)作为揭示蛋白质相互作用的快捷、有效的工具，变革了我们选择特殊分子的能力，是一种已经很好地建立起来的方法。1985年，Smith1将RI核酸内切酶基因克隆到丝状噬菌体fd的外壳蛋白pIII基因中，并成功地得到了在外壳蛋白中融合表达了酶分子的噬菌体粒子。该噬菌体能够被EcoRI内切酶抗体有效中和，说明展示在噬菌体外壳表面的酶分子与天然酶分子有着相同或极为相近的构想和活性。基于这一实验的成功，提出了噬菌体展示技术2。1998年，Wilson and Finlay3将这项技术进行了详细的综述。而现在这项技术已经得到难以想象的扩展，涉及到科学的各个领域。人们已经获得了很多展示载体，发展了完善的体系，成功地展示了所有种类的多肽，并且具有多样的运用4。目前噬菌体展示技术已广泛应用于研究蛋白质的结构与功能、蛋白质间的识别与作用、分离体内特异蛋白质与基因以及试验进化等多个分子生物学领域，并且也逐步应用于某些小分子物质的检测5。这些成果为食品安全检测的研究提供了新的思路。本文介绍噬菌体展示技术的原理及其在食品安全检测研究中的应用。1 噬菌体展示技术基本原理噬菌体展示技术(phage display technology)是一种基因表达筛选技术，以改造的噬菌体为载体，把待选基因片段（例如蛋白或多肽片段的基因序列）定向插入噬菌体外壳蛋白质区，使外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面，进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，最终获得具有特异结合性质的多肽/蛋白质。噬菌体展示技术直接将可现的表达型与其基因型联系在一起，再利用其配体的特异性亲和力，将所感兴趣的蛋白质或多肽挑选出来。其优势首先在于噬菌体自我繁殖的性质，利用细菌培养生产单克隆抗体相对于哺乳动物细胞培养是比较简单和廉价的。另一个优势是在建立展示库的基础上，噬菌体抗体的生产是不涉及到使用动物的6。噬菌体展示系统可分为两大类：非裂解噬菌体展示和裂解噬菌体展示。非裂解噬菌体展示系统使用丝状噬菌体衍生载体7，最普遍的方法是将文库蛋白展示于噬菌体基因III编码的衣壳蛋白III(pIII)N末端，也可展示到pVI，pVII，pVIII和pIX中。裂解噬菌体展示包括噬菌体展示和T7噬菌体展示，不同于丝状噬菌体质粒，外源的cDNA文库直接插入噬菌体或T7噬菌体基因组中表达展示于衣壳蛋白。裂解噬菌体展示特点在于噬菌体和T7噬菌体的表面展示的蛋白质不需要在分泌到宿主细菌膜上。目前比较流行的噬菌体展示技术方法是亲和选择或利用固定于板或珠的表面的诱饵分子进行噬菌体平移8,9。刘芳芳10等，为获得丰富的特异识别分子和实现无标记、高灵敏度检测，利用噬菌体展示技术，选择在pIII蛋白上展示12肽的噬菌体M13作为探针，采用羧基-氨基共价耦联法制备噬菌体展示蛋白质芯片。在此基础上，与表面等离子体共振传感技术结合，使用Biacor-e3000仪器，检测噬菌体展示蛋白质芯片与特异性抗体的反应，测定反应动力学常数。研究发现，不同浓度的抗体与芯片反应的数据较好地与S型曲线吻合。所制得的噬菌体展示蛋白质芯片可行，且SPR传感法适合于无标记检测噬菌体展示蛋白质芯片。2 噬菌体展示技术在食品安全检测中的应用噬菌体展示技术用于食品安全检测的方法有：随机多肽噬菌体展示、单链F可变区抗体库(scFv)噬菌体展示、单域抗体(sdAbs)和域抗体(dAbs)噬菌体展示。当前，在食品检测方面多用于细菌病原体、病毒、支原体、毒素等方面。2.1 细菌病原体检测细菌病原体需要明确引发感染的细菌的细胞表面配基，随机多肽噬菌体展示技术可以用于鉴定与宿主蛋白相互作用的细菌蛋白的编码基因。用细菌基因组DNA构建噬菌体随机肽库（如鸟枪噬菌体展示肽库），这些基因组片段插入到噬菌体外壳蛋白质区，其编码的外源蛋白展示于噬菌体表面，然后用宿主成分进行筛选（如胞外基质中的蛋白、宿主血清或细胞质），这样就能鉴定出编码细菌细胞表面配基的基因。很多参与宿主与病原体（各个种属的细菌）相互作用的基因都是通过噬菌体展示系统发现的2。2006年，Gasanov等11采用了英格兰BioLabs公司随机12-Mer库检测李斯特菌细胞。李斯特菌是一种革兰氏阳性食物传染的细菌病原体能导致免疫功能低下者和孕妇、胎儿致命的疾病。Berger等12从M.副结核病引起的Johne氏病症的羊的身上，克隆出的DNA序列，创造更丰富的融合到噬菌体基因的M13gIII的单链抗体库。Balasubr amanian等13以溶源性噬菌体作探针，利用基于该方法的SPREETATM传感器，检测葡萄状链球菌，检测极限可达104cfu/mL。同样，Nanduri等14用pIII蛋白上展示有单抗scFv的噬菌体LmP4:A8为探针，检测了单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria.monocytohenes)，检测极限可达到2106cfu/mL;他们还检测了肌动纤维聚集因子actA蛋白，检测极限为4.5nmol/L。2.2 病毒利用噬菌体展示技术检测病毒分子首先用亲和层析加酶切的方法纯化病毒蛋白，用得到病毒蛋白分子筛选噬菌体12-Mer库，通过夹心ELASA法分析噬菌体克隆与病毒蛋白的亲和力，再利用硝酸纤维膜斑点印迹法进行阳性克隆鉴定，并对阳性克隆进行测序和序列分析15。从而得到能与病毒蛋白相互作用的短肽，这些短肽可以用于此类病毒的快速检测。2010年，Lei Song等16在一个杆状病毒基因工程中，用His6标记氧化锌结合肽被融合入AcNPV的病毒衣壳蛋白(vp39蛋白)的N-端。2011年，En-Cheng Sun等17研制出了西尼罗病毒C蛋白特异性单克隆抗体，利用噬菌体显示技术筛选12-Mer库得到的单克隆抗体识别确定了病毒的线性表位。2011年，Yongzhong Yu等18生产得到了血清型口蹄疫病的在相关单克隆抗体，4B2。通过筛选噬菌体展示随机12-Mer库，发现活跃的噬菌体展示出一致的基序ETTXLE(X为任何氨基酸(AA)，这是高度同源的在VP2(VP2是口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白)蛋白N-末端的6ETTLLE11高度同源。2.3 支原体2009年，Miltiadou等19构建能够展示MmmSC基因组片段表达的一种多肽的丝状噬菌体库，通过使用噬菌体展示鉴定支原体丝状亚种小群体(MmmSC)的B细胞抗原编码基因。支原体丝状亚种能够引起牛传染性胸膜肺炎(CBPP)。2.4 寄生虫Aijiang Guo等20通过筛选含有单克隆抗体和一个TSOL18模拟表位的噬菌体展示多肽库，使得抗原表位被映射出来，这可以为诊断和研究猪带绦虫疫苗提供一个替代的方法。猪带绦虫是导致人类和猪囊尾蚴病的一种寄生虫，TSOL18已被确定为一个宿主保护六钩蚴抗原。获得对TSOL18鼠标单克隆抗体和映射的抗原表位对猪带绦虫感染的预防和疫苗的研发具有深远的作用。在这项研究中，单克隆抗体是以纯化的毕赤酵母中产生糖基化的TSOL18作为免疫原通过杂交瘤细胞技术生产的。Fu等21用夏氏鼠疟原虫DS顶端膜蛋白(AMA-1)免疫小鼠构建了单链可变区抗体(scFv)的展示肽文库，用折叠的AMA-1筛选肽文库富集了一群特异结合抗原的scFv，测序获得了至少4个不同的scFv基因序列，为进一步研究AMA-1的结构和功能奠定了基础。2.5 过敏原目前，运用不同的噬菌体库，可以筛选过敏原的线性表位和构象性表位的模拟肽，然后通过生物信息学的方法把模拟肽转变成相应的表位22。2010年，Crameri等23通报利用噬菌体展示技术，通过高通量筛选烟曲霉过敏原的cDNA文库发现至少有81种编码结构的不同序列，这些序列编码的结构能够与患烟曲霉有关并发症的患者致敏血清中的lgE特异性结合。李欣等24以兔抗水牛乳-乳球蛋白的抗体IgG为固相筛选分子，免疫筛选噬菌体随机7 肽库，通过与-乳球蛋白的氨基酸序列比对，确定了六个IgG识别表位。牛乳-乳球蛋白由162个氨基酸残基组成，分子量约为18.4kDa，是牛乳中的主要过敏原之一。2.6 毒素2007年，邓省亮等25利用噬菌体展示技术，以抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体为靶分子，从随机七肽库中进行生物亲和淘选，ELISA鉴定阳性克隆，通过DNA测序对每个阳性克隆进行定性分析。通过4轮结合/扩增循环，获得了能与抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体结合的肽，采用间接竞争ELISA，筛选到了4株能抑制黄曲霉毒素B1的阳性克隆子，经DNA测序得到HXXDPXH共有序列，其中X为任意氨基酸。以其中P10噬菌体阳性克隆建立竞争ELISA方法，线性范围为5002000pg/ml，检测下限为50pg/ml。成功应用噬菌体展示技术筛选出AFB1的模拟抗原表位，建立了无需人工抗原的免疫学分析方法。2007年，陈琳等26利用噬菌体展示技术，以幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori, HP)空泡毒素(VacA)基因片段作为固相筛选分子，筛选幽门螺杆菌VacA基因结合蛋白，探索VacA致病机制，研究VacA致病机制，为HP疫苗的研制和治疗等提供依据。近年来，有许多运用噬菌体展示技术将模拟表位成功的展示于噬菌体表面的报道27,28。2011年29，陈兴龙等通过噬菌体展示技术展示赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)模拟表位。将带有OTA模拟表位序列的寡核苷酸双链克隆至载体pC89-COTA。利用噬菌体展示技术，通过优化辅助噬菌体感染复数、IPTG加入的时间与剂量等培养条件获得表达有高密度OTA模拟表位的噬菌体。再通过酶联免疫吸附检测(ELISA)方法比较不同的条件下的表达效果，探索最优表达条件。成功获得高密度表达OTA模拟表位的噬菌体，并发现辅助噬菌体感染复数与IPTG加入量对模拟表位表达量影响不大，IPTG加入时间对模拟表位表达量有较大影响。同时，通过在噬菌体表面展示OTA模拟表位，可以生产大量廉价无毒的OTA模拟表位噬菌体，为以后建立OTA的无毒ELISA分析方法提供稳定可靠的材料来源。2.7 化学农药2003年，Bricheta等30从构建的天然抗体库中筛出除草剂2,4-D的抗体。2011年，贺江等31将甲氧基有机磷农药通用半抗原(S-羧甲基-O, O-二甲基二硫代磷酸酯，CMP)连接至琼脂糖凝胶，进而对甲氧基有机磷农药广谱特异性抗体进行纯化，以纯化抗体为固相抗原，以人源scFv抗体库(Tomlinson I + J)为抗体源，进行抗独特型抗体的筛选；利用所筛选到的抗独特型抗体建立非竞争免疫检测技术。经过鉴定，成功制备了甲氧基有机磷农药的型和型抗独特型抗体，并以此为基础建立了非竞争检测技术体系。3 展望噬菌体展示技术经过20多年的发展，已成为生化分析中备受关注的研究分析工具。同时由此而发展出的一些其他方法也被广泛应用于各个领域。近几年，随着分子生物学和分子免疫学的不断突破和噬菌体展示技术的不断改进，其在食品微生物安全检测的应用前景将更为广阔。各种单克隆抗体的不断问世，大大提高了噬菌体展示文库的多样性。通过利用不同的噬菌体抗体库和噬菌体肽库，食品中各种微生物、毒素、农药等的快速鉴定及其含量的测定等都将成为现实。然而在未来的一段时间内，噬菌体展示技术的发展主要依赖于建立高度复杂性的展示文库、提高展示效率、改善筛选方法提高筛选效率、展示更多顽抗蛋白以及拓宽噬菌体展示文库的化学空间等方面。参考文献 Smith G P. 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