重组鸡Igλ轻链真核细胞分泌表达及其单克隆抗体的制备与鉴定.doc

重组鸡Ig轻链真核细胞分泌表达及其单克隆抗体的制备与鉴定 作者：张红, 张改平, 章金刚, 杨艳艳, 易明林, 李姣, 韩鸿鹏【摘要】 目的: 构建重组载体pcDNA并在COS7细胞分泌表达鸡Ig轻链, 制备抗鸡Ig轻链的单克隆抗体（mAb）。方法: PCR扩增带有信号肽的鸡Ig轻链基因, 限制性酶切消化后, 定向克隆于真核表达载体pcDNA3, 构建具有6His标签、 分泌表达的重组载体pcDNA。重组载体转染COS7细胞后, SDSPAGE分析真核表达载体pcDNA在COS7细胞的分泌表达。用2106个雏鸡B淋巴细胞免疫BALB/c小鼠, 取脾细胞与骨髓瘤细胞融合, 分别采用细胞免疫荧光和间接ELISA筛选阳性杂交瘤克隆。结果: 成功构建分泌表达鸡Ig轻链的重组载体, SDSPAGE分析表明在COS7细胞上清有目的蛋白的分泌表达。杂交瘤细胞经筛选与鉴定, 获得2株分泌抗鸡Ig轻链mAb的杂交瘤细胞株, Western blot检测到该mAb对重组鸡Ig轻链的反应性。结论: 构建了重组表达载体pcDNA并在COS7细胞上清分泌表达了重组鸡Ig轻链。并用淋巴细胞杂交瘤技术成功筛选出抗鸡Ig轻链mAb。为深入研究鸡Ig轻链的结构与功能奠定了基础。 【关键词】 鸡Ig轻链 pcDNA COS7细胞 真核分泌表达 单克隆抗体Abstract AIM: To construct the eukaryotic expression vector for chicken Ig light chain, to express it on COS7 cells and to prepare the monoclonal antibodies against chicken Ig. METHODS: The cDNA of chicken Ig light chain with signal peptide sequence was amplified and then inserted into eukaryotic expression plasmid pcDNA3 after double enzyme cutting. The constructed recombinant vector was transfected into COS7 cells by lipofectamin and the secretable eukaryotic expression of chicken Ig light chain was verified by Western blot. The monoclonal antibodies (mAbs) against chicken Ig light chain were prepared by immunizing BALB/c mice with 2106 chicken B cells and by cell fusion technology. RESULTS: The eukaryotic expression vector was successfully constructed. Western blot demonstrated that chicken Ig light chain existed in the cultural supernatant. The hybridoma lines secreting antiIg mAbs were screened by indirect ELISA. The specific reactivity between antiIg mAbs and recombinant chicken Ig light chain was detected by Western blot. CONCLUSION: The secreted recombinant chicken Ig light chain and antiIg mAbs provide a basis for further study of the functions of chicken Ig.Keywordschicken Ig light chain; pcDNA; COS7 cell; secretable expression; monoclonal antibody禽类拥有特殊的抗体基因结构、 独有的免疫器官和相对保守的抗体基因类别, 已经成为研究抗体产生和免疫系统发生发育的重要模式生物1。法氏囊是鸡特有的中枢免疫器官, 鸡抗体基因数量少且结构简单, 抗体多样性机制与哺乳动物及人类有根本性差异2。轻链作为抗体和膜表面免疫球蛋白（mIg）的重要组分, 在抗原识别、 B细胞分化和免疫防御等方面发挥着重要作用3-5。已经发现约95%的鸡免疫球蛋白属于型。研究鸡Ig轻链对于全面认识鸡的抗体基因以及免疫系统发育和功能具有重要价值和意义。本研究中通过构建真核表达的重组载体pcDNA, 实现重组鸡Ig轻链在COS7细胞的分泌表达。利用杂交瘤技术制备了抗鸡Ig轻链mAb, 为进一步研究鸡抗体轻链的结构和功能奠定了基础。1 材料和方法1.1 材料 重组质粒pGEM由河南省动物免疫学重点实验室构建6。真核表达载体pcDNA3（Invitrogen公司）、 COS7细胞株（中科院上海细胞生物所）、 脂质体LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）、 质粒提取试剂盒（Qiagen公司）、 限制酶、 T4连接酶、 DNA聚合酶（购自TaKaRa公司）。DMEM培养基、 RPMI1640细胞培养基, HAT、 HT培养基, PEG4000, 胎牛血清均为Gibco产品。NS0瘤细胞由英国国家动物健康研究院惠赠。BALB/c纯系雄性小鼠购自郑州大学医学院实验动物中心, 鼠龄68周, 体质量1822 g用于动物免疫和制备饲养细胞。1.2 方法1.2.1 分泌型真核表达重组载体pcDNA的构建 以已构建的重组质粒pGEM为模板, PCR扩增鸡Ig cDNA并引入Hind III和Xhol I酶切位点。用于扩增的引物: A1 5CAGAAGCTTAGCTGCTGGGATTC3, A2 5TCTCTCGAGTTAATGATGATGGTGGTGATGGCACTCGGACCT3。PCR扩增反应体系为: cDNA 1 L、 Premix Ex TaqTM 25 L、 上游引物1 L、 下游引物1 L、 ddw 22 L。PCR反应参数: 94, 预变性2 min; 94 30 s, 60 30 s, 72 90 s, 30个循环, 72保持10 min。10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物。Hind III和Xhol I酶切cDNA和pcDNA3质粒, 将cDNA定向克隆于表达载体, 构建重组表达载体pcDNA, 转化感受态大肠杆菌JM109, 转移至含有氨苄的固体平板培养基上培养, 37条件下培养1216 h后挑取单个菌落PCR扩增, 并进一步经酶切鉴定和测序验证后提取超纯质粒用于真核细胞转染。1.2.2 转染COS7细胞 COS7细胞用含100 mL/L FBS的DMEM培养基培养于细胞培养板上, 转染前24 h细胞传代, 培养至细胞单层达80%时, 用脂质体LipofectamineTM2000（Invitrogen）介导转染（按操作说明进行）。1.2.3 分泌蛋白的纯化和SDSPAGE 电泳分析 转染后72 h收集COS7细胞培养上清用NiNAT Spin Column亲和层析柱纯化。纯化的重组蛋白用120 g/L分离胶进行SDSPAGE电泳分析。1.2.4 抗鸡Ig轻链mAb制备 免疫小鼠: 取3周龄雏鸡法氏囊组织, 研磨, 无菌获取B淋巴细胞, 用2106个细胞免疫8周龄BALB/c小鼠, 每只剂量0.3 mL颈背部皮下多点注射。共免疫3次, 每次间隔12周。最后一次免疫后10 d断尾采血分离血清, 用间接ELISA检测血清效价。最后一次加强免疫后4周, 尾静脉和腹腔注射5106 B淋巴细胞超强免疫, 3 d后进行细胞融合。细胞融合: 无菌取免疫鼠脾脏, 将分离的脾细胞与NS0骨髓瘤细胞按101的比例在预热的500 mL/L PEG2000作用下融合。融合细胞加到含饲养细胞的96孔细胞培养板上, 置于HAT选择培养基中, 37 50 mL/L CO2培养箱中培养。阳性杂交瘤的筛选与克隆: 融合后第8天分别用间接ELISA和细胞免疫荧光法对细胞生长孔上清进行抗体检测。用重组鸡Ig轻链包被ELISA反应板, 与细胞培养上清作用后再加入羊抗鼠IgG, TMB显色。酶联免疫检测仪记录450 nm读值。细胞免疫荧光法（IFA） 制备B淋巴细胞悬液并调整细胞密度为1109个细胞/L。细胞与待测上清及灭活兔血清作用, 充分洗涤, 加入FITC 抗鼠IgG二抗, 荧光显微镜观察。分别以未免疫小鼠血清、 免疫小鼠血清为阴性、 阳性对照。检测的抗体阳性孔进行连续3次有限稀释克隆化,阳性克隆的检测值高且细胞状态良好者即为筛选的单克隆细胞株。Western blot检测mAb与重组鸡Ig轻链反应的特异性: 将纯化的鸡Ig蛋白经SDSPAGE分离, 转移到硝酸纤维素膜上, 用筛选的mAb对Ig蛋白进行杂交试验, 鉴定mAb与Ig蛋白反应的特异性。2 结果2.1 重组表达载体pcDNA3的构建 PCR扩增cDNA并引入Hind III和Xhol I酶切位点。Hind III和Xhol I双酶切的cDNA和pcDNA3载体经连接转化后, 提取质粒进行双酶切鉴定, 切出约700 bp DNA条带, 证明目的基因已经插入该载体中（图1）, DNA测序结果表明插入片段为插入方向正确的目的基因, 且读码框正确。图1 表达载体pcDNA的酶切鉴定（略）Fig 1 Restriction enzyme analysis of expression vector pcDNA1: pcDNA was digested by Hind III; 2: pcDNA was digested by Hind III and Xhol I; 3: DNA marker.2.2 细胞转染及重组蛋白的SDSPAGE电泳分析 COS7细胞培养达到80%融合时, 用脂质体LipofectamineTM2000将表达载体pcDNA和空质粒pcDNA3转染COS7细胞, 37、 50 mL/L CO2孵育箱内培养72 h。收集细胞培养上清用NiNTA spin column亲合柱层析纯化分泌蛋白, 纯化的重组蛋白用120 g/L分离胶进行SDSPAGE 电泳。pcDNA转染的COS7细胞培养上清有重组蛋白Ig分泌表达, 在Mr约23000位置有明显的蛋白表达条带（图2）。图2 分泌型重组鸡Ig的SDSPAGE电泳分析（略）Fig 2 SDSPAGE analysis of the secreted chicken Ig1: Supernatant of COS7 cells transfected with pcDNA; 2: Recombinant chicken Ig after purification by NiNTA spin column; 3: Protein molecular weigh marker.2.3 mAb与B细胞反应的特异性 IFA鉴定mAb与B细胞反应的特异性。mAb作用后, B细胞有明显的荧光, 阴性对照则没有荧光出现（图3）。图3 IFA检测mAb与鸡B细胞反应特异性（略）Fig 3 Detection of chicken B cells reaction with mAb by IFAA: Chicken B cells reacted with mAb; B: Chicken B cells reacted with negative mAb control; C: Chicken B cells under light microscope.2.4 mAb与鸡Ig反应的特异性 （1）间接ELISA: 重组鸡Ig蛋白包被ELISA反应板, 与mAb进行间接ELISA反应, 鉴定mAb与鸡Ig反应的特异性。以mAb的最大稀释倍数作为mAb的间接ELISA效价和工作浓度。1 mg/L的Ig蛋白包被反应板测定的杂交瘤上清的间接ELISA效价: E9、 3F3分别为1512和1128。 （2）Western blot: 鸡Ig蛋白经SDSPAGE分离, 转移到硝酸纤维素膜, 分别用mAb E9和3F3对Ig蛋白进行杂交试验, 鉴定mAb与Ig蛋白反应的特异性。显示的阳性杂交条带说明mAb与重组蛋白Ig能特异性反应（图4）。图4 重组鸡Ig与抗鸡Ig mAb Western blot（略）Fig 4 Western blot analysis of the secreted chicken Ig reaction with mAb1: The culture supernatant of COS7 cells transfected with pcDNA; 2: Recombinant chicken Ig after purification by NiNTA spin column; 3: Reactivity of Recombinant chicken Ig with mAb E9; 4: Reactivity of Recombinant chicken Ig with mAb 3F3.3 讨论 分泌蛋白的合成通常起始于细胞质基质中的游离核糖体, 在N端信号肽引导下进入内质网继续蛋白质合成和加工修饰, 最后经由高尔基体的囊泡运输转移至细胞膜外。鸡Ig轻链为分泌蛋白, N端具有21个氨基酸组成的信号肽7。本研究中采用PCR技术扩增出带有信号肽序列的鸡Ig轻链基因, 限制性酶切消化后, 定向克隆于真核表达载体pcDNA3, 成功构建带有6His标签、 分泌表达的重组载体pcDNA。重组载体转染COS7细胞, 收集细胞上清进行NiNTA亲合柱层析纯化分泌蛋白, SDSPAGE电泳分析表明有目的蛋白的分泌表达。重组表达载体所具有的6组氨酸标记物序列编码的6组氨酸标记物亲合性好, 便于重组蛋白的分离纯化。 Ig轻链是鸡B细胞表面分子膜免疫球蛋白（mIg）的重要组分, 在制备抗体时, 我们分别尝试用鸡法氏囊B细胞和可溶性抗原（重组鸡Ig）免疫小鼠, 并且从抗原剂量、 接种途径、 间隔时间以及是否加入佐剂等几方面进行了条件优化。免疫效价测定结果表明, 用2106个细胞免疫小鼠, 首免和二免间隔1周时间, 小鼠免疫效价虽然比加佐剂的可溶性抗原低, 但抗体特异性高, 杂交瘤筛选效果更好, 说明用全细胞免疫小鼠制备针对膜表面分子的mAb具有一定优势。 我们分别采用细胞免疫荧光、 间接ELISA和蛋白质印迹技术对阳性杂交瘤进行筛选和鉴定, 三种方法的综合运用提高了筛选效果, 尤其是蛋白质印迹综合了电泳的高分辨率和免疫探测技术的灵敏性和专一性的优点, 在特异蛋白质检测方面已得到广泛的应用, 对鉴定mAb的特异性更为适用8。【参考文献】 1 Sayegh CE, Drury G, Ratcliffe MJH. Efficient antibody diversification by gene conversion in vivo in the absence of selection for V(D)Jencoded determinantsJ. EMBO J, 1999, 18(22): 6319-6328.2 张 红, 刘钧珂, 张改平, 等. 鸡免疫球蛋白基因结构与抗体多样性产生的分子机制J. 河南农业科学, 2007, 2: 102-104.3 Conlon TM, Meyer KB. Cloning and functional characterisation of avian transcription factor E2AJ. BMC Immunol, 2004, 5: 11-18.4 Rosnet O, BlancoBetancourt C, Grivel K, et al. Binding of free immunoglobulin light chains to VpreB3 inhibits their matu