整合素β1亚基表达与人脑胶质瘤侵袭与复发的关系.doc

整合素1亚基表达与人脑胶质瘤侵袭与复发的关系 作者：章翔，吴景文，郭衍，付洛安，高大宽 【关键词】 脑胶质瘤 【Abstract】 AIM: To detect the expression of integrin1 gene in human gliomas and analyze its clinical significance. METHODS: The expression of integrin1 gene in 53 pieces of gliomas was detected by immunohistochemical and hybridization technique in situ. The patients were followed up and their prognosis was compared. RESULTS: The positive rate of Integrin1 in gliomas of grade I to was 36.3%, 38.5%, 72.2% and 81.8% respectively. The integrin1 positive rate in gliomas of grade and was higher than that of grade I and (P<0.05). The integrin1 mRNA expression in gliomas was positively correlated with its protein expression. Patients with higher expression of integrin1 had poorer prognosis and shorter survival time. CONCLUSION: The higher expression of integrin1 is closely related with the lower differentiation and higher invasiveness of gliomas. Integrin1 may be a good indicator in predicating the prognosis of gliomas patients. 【Keywords】 integrin 1; glioma; immunohistochemistry; hybridization in situ 【摘要】 目的： 检测脑胶质瘤中整合素1基因表达，阐明其临床意义. 方法： 应用免疫组化和原位杂交法，分析53例人脑胶质瘤整合素1基因表达，对患者随访并比较其预后. 结果： 整合素1蛋白阳性率，在IIV级脑胶质瘤分别为36.3%, 38.5%, 72.2%和81.8%，高级别（）高于低级别（）（P0.05），其mRNA表达同蛋白表达. 高表达整合素1的患者预后较差. 结论： 整合素1的高表达与脑胶质瘤分化程度低、侵袭性强密切相关，是预测患者预后的较好标示物. 【关键词】 整合素1；脑胶质瘤；免疫组化；原位杂交 0引言 人脑胶质瘤细胞恶性增殖和侵袭生长是其病理特征之一，也是术后肿瘤复发，导致患者预后不良的主要原因. 该过程涉及肿瘤细胞粘附、基质降解、细胞迁移等多环节. 肿瘤侵袭与各种因素有关，如：整合素（integrin）、tenascin及透明质酸等1-3,其中细胞粘附分子integrin是肿瘤侵袭生长的步骤之一，它通过与细胞外基质蛋白的相互作用，以及细胞间的粘附和信号传导，促进肿瘤形成、生长、分化和转移3. Integrin1是粘附分子家族的主要成员，它与脑胶质瘤恶性表型以及患者预后的相互关系，国内尚研究报道甚少，对此，我们采用免疫组化和核酸原位杂交法进行了初步探讨. 1材料和方法 1.1材料 样本来源人脑胶质瘤石蜡标本取自1995/1996本校西京医院病理科手术标本蜡块，共53例. 标本均经40 g・L-1甲醛固定，常规石蜡包埋，连续切片，厚5 m. 取材患者年龄21 74岁，平均(4711)岁. 胶质瘤分化程度按WHO分级，级为分化较好，级为分化不良. 级11例，级13例，级18例，级11例. 主要试剂和杂交探针 羊抗人integrin1 mAb和SABC试剂盒分别为Santa Crux和博士德公司产品. mRNA寡苷核酸探针由北京赛百盛生物公司合成，反义寡核苷酸探针序列为5GCAGTAAGCATCCATATC3互补于integrin1 mRNA的第16431661位点4，其相应对照正义寡核苷酸探针序列为3CGTCATTCGTAGGTATAG5. 按Boehringer Mannheim公司的地高辛寡核苷酸加尾标记试剂盒操作流程进行. 1.2方法 1.2.1免疫组化按试剂盒说明书，采用SABC法，对4 m厚系列石蜡切片进行组化染色，检测各级脑胶质瘤标本integrin1表达. 1.2.2核酸原位杂交mRNA原位杂交方法和步骤按Boehringer Mannheim公司的地高辛标记和检测试剂盒操作流程进行. 实验中以预杂交液代替杂交液为空白对照；阳性标本重复染色作为阳性对照，杂交前RNase消化并以正义寡核苷酸探针代替反义寡核苷酸探针为阴性对照. 杂交主要步骤：切片脱蜡水化，1PBS/DEPC 液洗5 min2次；40 g・L-1多聚甲醛，1PBS后固定. 依次入pH 7.2，1PBS溶液、0.1 mol・L-1甘氨酸1PBS溶液， 4 g・L-1 Triton X1001PBS溶液漂洗. 经50 mg・L-1蛋白酶K在37下孵育30 min后，入4 g・L-1多聚甲醛1PBS 溶液5 min，以1PBS洗片后，浸入25 g・L-1乙酸酐10 min，2SSC 10 min，然后将切片移入杂交液. 杂交液内探针浓度为50 mg・L-1，42，振荡杂交16 h. 切片经梯度SSC和2PBS漂洗后，加AP标记的抗Dig抗体Fab片段(浓度1800)，37, 40 min，室温1 h，分别用TSM1液和TSM2液漂洗，滴加NBT/BCIP湿盒中避光显色46 h，TE缓冲液终止显色，1PBS洗5 min，中性红复染，脱水透明，中性树胶封片. 统计学处理：数据以百分率（%）表示，采用2检验. 2结果 2.1Integrin1的表达及分布Integrin1阳性染色为棕黄色颗粒，分布于胶质瘤细胞膜和细胞质. 结果判断为随机选择的5个高倍视野（400），阳性细胞数5个，即为1染色阳性. 阳性程度分级为(-)为无棕黄色颗粒，(+)为阳性细胞数占总数10%，()为阳性细胞数占总数11%50%，()为阳性细胞占总数50%以上（Fig 1）. 统计分析表明（2检验），级脑胶质瘤阳性率明显高于级脑胶质瘤(P<0.05），, 级间和, 级间的integrin1阳性率比较差异不显著（P>0.05, Tab 1）. 表1Integrin1在胶质瘤中的蛋白表达（略） Tab 1Expression of integrin1 protein in glioma（略） 2.2Integrin1核酸原位杂交核酸原位杂交阳性表现为紫蓝色颗粒，结果显示integrin1 mRNA主要分布于肿瘤细胞质中，小部分位于胞核内. 显微镜高倍视野(400)下计数杂交阳性肿瘤细胞. 标准为：(-)细胞质不着色；(+)细胞质有细小、稀疏、紫蓝色颗粒；()细胞质较密的细小、紫蓝色颗粒；()细胞质明显致密的紫蓝色颗粒（Fig 2）. 统计分析表明，级脑胶质瘤integrin1 mRNA杂交阳性率明显高于级脑胶质瘤(P<0.05)，, 级间和, 级间的integrin1 mRNA阳性率比较差异不显著（P>0.05, Tab 2）. 图1Integrin1在胶质瘤中的蛋白表达（略） Fig 1Expression of integrin1 protein in glioma (grade ) SABC400（略） 图2Integrin1在胶质瘤中的mRNA表达（略） Fig 2Expression of integrin1 mRNA in glioma (grade ) NBT/BCIP400（略） 表2Integrin1 mRNA在各级胶质瘤中的表达（略） Tab 2Expression of integrin1 mRNA in glioma（略） 2.3integrin1 表达与患者预后对53例标本中46例患者的目前生存情况进行了随访，其中integrin1 表达为， ，患者的生存率分别为78.5%, 52.4%, 9.12%和0%. 统计学分析表明（2检验），integrin1表达阳性率越低，生存率就越高，反之亦然；integrin1 表达为，患者的生存率显著高于integrin1 表达为的患者生存率（P<0.05）. 3讨论 Integrin是一类由, 两个亚基组成的跨膜糖蛋白，介导细胞与细胞基质、细胞与细胞间的粘附. 研究表明，integrin与肿瘤的恶性表型，如无限制性生长、低分化和侵袭转移等密切相关，其恶性表型决定了肿瘤患者临床病情的进程. 肿瘤浸润、转移与integrin分子表达和分布密切相关，胶质瘤细胞表达integrin分子具有不一致性，这可能与integrin分子的不同作用和胶质瘤细胞的高度异质性有一定相关性. Paulus 等5研究发现，integrin1 在正常脑组织有少量表达，integrin3和1在恶性胶质瘤组织中表达较高. Integrin1能与多种亚基相结合，如integrin21, 31, 51 和61等，它们是细胞外基质胶原蛋白，纤维连接蛋白和层粘连蛋白的受体，共同参与胶质瘤的侵袭生长过程6-8. 抗integrin21, 31, 51及61抗体可使C6胶质瘤细胞体外移行能力减弱；经诱导过表达integrin1的C6胶质瘤细胞裸鼠皮下致瘤性增强；integrin31, 61与LN的结合，促进了U251， A172和T98G胶质瘤细胞的侵袭性；抗integrin1抗体可明显抑制胶原蛋白I和IV的促U138和U373MG胶质瘤细胞的粘附和侵袭作用，这说明integrin1与胶质瘤的侵袭生长密切相关9,10. 我们的研究发现，分化良好的脑胶质瘤组织integrin1阳性率明显低于分化不良者，这与国外的有关研究结果相一致；且integrin1的高表达与脑胶质瘤组织分化程度低、高度粘附和侵袭生长等恶性表型密切相关，并可能对其恶性表型起正性调节作用；integrin1表达阳性率越高的患者，其预后越差. 本实验结果提示，integrin1表达是胶质瘤恶性表型的具体表现，因此可作为患者预后评估的重要指标. 【参考文献】 1 Zhang X, Wu JW, Fei Z, Gao DK, Qu Y, Liang JW. Cloning and sequencing of the fragment of human endostatin gene J. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ), 2000;21(9):1043-1045. 2 Wu JW, Zhang X, Fei Z, Gao DK, Qu Y, Liang JW, Liu XZ. Expression significance of extraoriginated angiostatinK(13) gene in human gliomas J. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ), 2000;21(9):1046-1050. 3 Hynes RO. Integrins: Versatility, modulation and signaling in cell adhesion J. Cell, 1992; 69(1) :11-25. 4 Lallier T, BronerFraser M, Thomas L, Mariznne BF. Inhibition of neural crest cell attachment by integrin antisense oligonucleotides J. Science, 1993; 259 (5095): 692-695. 5 Paulus W, Baur I, Schuppan D, Lena CW. Characterization of integrin receptors in normal and neoplastic human brain J. Am J Pathol, 1993;143(1):154-163. 6 Tonn JC, Wunderlich S. Invasive behaviour of human gliomas is medicated by interindividually different integrin patterns J. Anticancer Res, 1998;18 (4A): 25992605. 7 PijuanThompson V, Gladson CL, Good DJ. Ligation of integrin alpha5betal is required for internalization of vitronectin by i