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四种嵌合免疫受体在T淋巴细胞中的表达分析 作者：骆耐香 陈森洲 徐雅娟【摘要】 目的 利用基因工程技术构建含人源抗癌胚抗原(CEA)单链抗体(scFv)的4种嵌合免疫受体（CIR），比较其在T淋巴细胞表面表达的情况。方法 将构建好的嵌合免疫受体CIRZ、CIR1、CIR2、CIR3通过电穿孔方法分别转染人T淋巴细胞，流式细胞仪检测各嵌合免疫受体在T淋巴细胞的表达情况。结果 有3种嵌合免疫受体成功表达在T细胞的表面，它们分别是CIR1、CIR2、CIR3，其中CIR3的表达更好。结论 嵌合免疫受体能够在T淋巴细胞的表面有效表达，为下一步的体内实验打下基础，同时为这一治疗策略最终应用于临床提供可靠的实验依据。 【关键词】 嵌合免疫受体；癌胚抗原；电穿孔转染；流式细胞术；人T淋巴细胞 【Abstract】 Objective To compare the expressions of four chimeric immune receptors (CIRs) with anticarcinoembryonic antigen (CEA)scFv gene on human T lymphocyte via electroporation in vitro. Methods Four CIRs (CIRZ, CIR1, CIR2, CIR3) with antiCEAscFv gene were transfected into human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) obtained from healthy adults respectively. The expressions of surface molecules of CIRs were detected by flow cytometry after 16hour transfection.Results Flow cytometry showed that CIR1, CIR2, CIR3 genes were efficiently expressed after transfection. But CIRZ cannot be detected any expression. Conclusions Three kinds of CIR genes can successfully express on human T lymphocytes surface. It can be the foundation of the further study and can provide the reliable evidence for clinical using this therapy. 【Key words】 Chimeric immune receptor; Carcinoembryonic antigen; Electroporation; Flow cytometry; Human T lymphocyte大多数肿瘤相关抗原(TAA)是自身抗原，由于胸腺的选择机制和耐受机制，机体针对这些抗原产生的T淋巴细胞中大多数T细胞受体（TCR）的亲和力都比较低，从而限制了其肿瘤识别及杀伤效果。将克隆的高亲和力识别TAA的T淋巴细胞受体也称嵌合免疫受体（CIR）通过基因转染技术转染给T淋巴细胞，可以使重定向的原来无肿瘤识别能力的T细胞在体外和体内有效识别并杀伤肿瘤细胞1。近年来利用基因工程技术构建的T淋巴细胞嵌合免疫受体，它包括识别TAA的单链抗体（scFv）和T淋巴细胞的活化基序，通过真核细胞表达载体转染T淋巴细胞，使T淋巴细胞能识别并杀伤肿瘤细胞。我们将含人源化抗癌胚抗原(CEA)scFv的4种CIR，即CIRZ、CIR1、CIR2、CIR3，转染人T淋巴细胞后检测其在人T淋巴细胞的表达，筛选出高表达的CIR，为进一步进行体内实验提供基础，同时为这一治疗策略最终应用于临床提供可靠的实验依据。1 材料与方法1.1 主要仪器和材料电穿孔仪NucleofectorTM为Amaxa Biosystems公司产品，流式细胞仪FACS Calibur为美国BD Biosciences公司产品。培养基AIMV购自Sigma公司。健康人外周血由福冈红十字血液中心提供。CIRZ、CIR1、CIR2、CIR3为本研究室制备，见图1。别藻兰蛋白(APC)标记试剂盒购自日本Dojindo分子技术有限公司，按说明将其标记CEA。1.2 细胞分离与培养按常规方法分离淋巴细胞。将分离的人T淋巴细胞在含10%小牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的AIMV培养基中，37含5% CO2的细胞培养箱中培养，每2天换液1次，取对数生长期细胞备用。1.3 基因转染将4种CIR通过电穿孔的方式转染人T淋巴细胞。按照产品说明，用100 l电穿孔液Nucleofector Solution重悬T细胞2106后，加入4 g CIR，使用程序A23进行电穿孔转染后即移入预先预热的AIMV培养液中，置37含5% CO2的细胞培养箱内培养。1.4 流式细胞术首先在转染后16 h收获并调整细胞浓度为1106/ml于Eppendorf管中,分别加入400 g /L CEAAPC与FACSPBS混合液200 l，混匀于冰上1 h,每隔15 min 颠倒混匀，PBS洗2次后，悬浮于500 l FACS Flow溶液中，采用流式细胞仪FACS Calibur检测分析不同的CIR在T细胞表面与CEA定向结合情况。以不含基因的空载体经电穿孔后作为阴性对照。2 结 果 CIR1、CIR2、CIR3可有效表达在T细胞表面，与CEAAPC发生定向结合，曲线高出阴性对照并向右移，其中CIR3效果更好，而CIRZ未与CEAAPC结合，见图2。3 讨 论 肿瘤过继免疫治疗虽然成功地应用于黑色素瘤和肾细胞癌的治疗，但对结肠癌、乳腺癌等实体肿瘤的治疗效果并不满意，其主要原因可能是培养足够的肿瘤特异性淋巴细胞非常困难。随着分子生物学技术及基因工程技术的迅猛发展，构建T淋巴细胞的CIR成为可能，CIR包含识别TAA的单链抗体和T淋巴细胞活化的协同刺激分子CD28、CD3链等，通过体外转染到T淋巴细胞的表面，以发挥抗肿瘤功能。 CEA是目前研究最广而且最具有潜力的靶抗原之一。它是一类主要的TAA,为分子量为180 000的糖蛋白，最先是在结肠癌提取物中发现的抗原。现已知CEA不但广泛存在于各种人类肿瘤细胞中，也存在于正常胃肠组织和胎儿小肠上皮细胞中，但正常组织中的CEA不直接分泌到血液和组织液中。因此，CEA可作为肿瘤免疫治疗非常有用的一个靶分子2，3。机体有效抗肿瘤免疫需要免疫系统能够识别肿瘤抗原，并最终利用免疫效应机制清除肿瘤细胞。大量的体外实验及动物实验证明，用抗TAA的TCR重定向的T细胞具有特异性的肿瘤杀伤功能4，5。由于人源抗体比鼠源抗体在肿瘤的免疫治疗和基因治疗中有更大的潜力，我们构建了4种含人源抗CEA单链抗体的CIR，分别为CIRZ、CIR1、CIR2和CIR3，而CEA特异性CIR可以表达在T淋巴细胞表面6。本实验发现有3种CIR（CIR1、CIR2、CIR3）可以在T淋巴细胞表面表达，其中CIR3表达最好。与CIRZ不同的是，3种可在T淋巴细胞表面表达的CIR具有的共同之处是胞外段均有铰链区，推测这类CIR容易在细胞表面表达，继而可与CEA发生结合。目前报道的所有临床应用的CIR的信号传导均使用CD3链，而近来的研究发现，只用CD3链作为信号传导会导致活化的淋巴细胞凋亡，而在单链抗体与CD3之间加入共刺激分子(如CD28)能有效地增强活化淋巴细胞的功能并防止细胞凋亡。我们利用人源化抗CEA的单链抗体的靶向性和CD3胞内区、跨膜区的共刺激信号，构建真核表达载体，转染T细胞，旨在制备能活化的有CEA靶向性的外周血T细胞来杀伤肿瘤细胞。该实验结合了杀伤性T细胞的抗肿瘤作用与协同刺激分子两大研究热点，使体液免疫与细胞免疫有机结合，利用了TCR/ CD3中抗原识别和信号传导的独立性，将抗体分子的导向作用和T细胞活化所需的双信号相结合，构建scFvCD3肿瘤特异性T细胞能降低T细胞活化的阈值。而且构建的肿瘤特异性T细胞的杀伤功能由于不受MHC限制有一定的临床应用价值，可以提高抗肿瘤综合免疫治疗水平。 临床研究表明，过继性输注肿瘤特异性T淋巴细胞可通过抑制肿瘤细胞的生长而有效的治疗肿瘤。临床应用的肿瘤特异性T淋巴细胞可从肿瘤病人的外周血、淋巴结或者肿瘤组织中分离。美国国立癌症研究所进行的一期临床试验中,对17例转移性黑色素瘤病人用Mart1TCR基因修饰的自体外周血T淋巴细胞进行治疗，两例病人出现客观疗效，这是首次基因治疗有效用于肿瘤免疫治疗的报道。在该两例病人中持续检测到高达40%70%的外周血细胞中含有基因标记，并且长达一年之久7。随着更多更好的CIR的构建及治疗方案的改善，有望在用基因修饰的T淋巴细胞治疗肿瘤方面取得突破进展。【参考文献】 1 Gross S，Walden P.Immunosuppressivc mechanisms in human tumors: why we still cannot cure cancerJ. Immunol Lett，2008；116(1)：714.2 Pavoni E，Flego M，Dupuis ML,et al.Selection，affinity maturation，and characterization of a human scFv antibody against CEA proteinJ.BMC Cancer，2006;6（1）:41.3 Aldrich WA，Ren C，White AF,et al.Enhanced transduction of mouse bone marrowderived dendritic cells by repetitive infection with selfcomplementary adenoassociated virus 6 combined with immunostimulatory ligandsJ.Gene Ther，2006；13(1)：2939.4 Zhao Y，Zheng Z，Robbins PF,et al.Primary human lymphocytes transduced with NYESO1 antigenspecific TCR genes recognize and kill diverse human tumor cell linesJ.J Immunol，2005；174 (7)：441523.5 Rosenberg SA，Dudley ME. Adoptive cell therapy for the treatment of patients with metastatic melanomaJ. Curr Op in Immunol，2009；21 (2)：23340.6 Shibaguchi H，Luo NX，Kuroki M,et al.A fully human chimeric immune receptor