人血管内皮抑素毕赤酵母真核表达载体的构建.doc

人血管内皮抑素毕赤酵母真核表达载体的构建【摘要】 目的 构建人血管内皮抑素（ES）毕赤酵母真核表达载体。方法 利用RTPCR技术从人体肝脏组织扩增出ES基因，插入毕赤酵母表达载体pPIC9中，酶切鉴定并进行DNA测序鉴定。结果 成功克隆ES基因并筛选出pPIC9载体中的ES阳性克隆，测序证实其序列与已报道的ES基因序列一致。结论 用分子生物学方法构建ES毕赤酵母真核表达载体的成功，使高效表达ES蛋白成为可能。 【关键词】 内皮抑素类 人类 克隆 分子 毕赤酵母 ABSTRACTObjectiveTo construct yeast eukaryotic expression vector carrying human endostatin cDNA. Methods The functional fragment of endostatin gene was amplified by RTPCR from human hepatic tissue, and cloned into yeast pPIC9 expression vector. The positive clone was sequenced by automatized sequencer.ResultsThe endostatin cDNA was successfully cloned. The positive ES gene clone in pPIC9 expression vector was sieved, and its coding sequence was the same as reported sequence. ConclusionThe successful construction of ES gene pPIC9 expression vector ensures the high expression of ES protein. KEY WORDS endostatins; human; clone, molecule; construction; pichia 1997年，OREILLY等1从小鼠血管瘤细胞培养物中分离得到内皮抑素（ES），体内和体外实验证实，它能特异性地抑制新生血管内皮细胞生长,从而抑制多种实体肿瘤的生长和转移。ES是胶原经过蛋白酶水解产生，大约由180个氨基酸残基组成。为进一步研究ES的基因序列，探讨构建其高效表达载体的方法，为将来规模生产和临床应用提供依据，本文从人肝脏组织中提取RNA，自行设计引物，克隆ES基因，并成功地构建了其毕赤酵母真核表达载体，经测序获得的ES基因序列，与文献报道一致。现报告如下。 1 材料和方法 1.1 材料 人肝脏组织来源于青岛市市立医院普外科手术切除标本；大肠杆菌E.coli DH5，载体pKS为青岛大学医学院病原生物学教研室保存；pPIC9(8 023 bp,ColE1ori,AmpR)购自美国Invitrogen公司。各种限制性内切酶和反转录酶（Super Script RNase HReverse Transcriptase）、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、RNaseA、六聚寡核苷酸，购自Promega公司。测序试剂盒、RNA提取试剂盒和PCR纯化试剂盒分别购自美国Clontech公司。Trizol试剂盒购自GIBCO/BRL公司。 1.2 方法 1.2.1 引物设计 参照人胶原 cDNA设计ES基因引物，自胶原 cDNA序列第1 504 bp处开始作为引物1的5起始端，引入Xhol 酶切位点；引物2的3端始于第2 055 bp处，引入EcoR 酶切位点。为了便于真核细胞表达载体的构建和表达蛋白的纯化，在引物1中增加了真核表达信号肽序列，在引物2中增加了6个组氨酸的氨基酸序列。P1:5CTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCACTCTCATAGAGAC3；P2:5CGGAATTCCTATTAGTGATGGTGATGGTGATGCTTAGAGGC3。引物由上海生物工程公司合成。 1.2.2 ES基因的RTPCR扩增 将5 g新鲜肝组织匀浆，加0.5 mL PBS，制成细胞悬液。用Trizol试剂盒提取肝脏总RNA，RTPCR按RNA提取试剂盒说明书进行。取5 g总RNA为模板，六聚寡核苷酸和Oligo(dT)15为引物，应用RTPCR技术合成cDNA第一链，反应总体积为20 L。取2 L cDNA为模板，于0.5 mL离心管中加入引物1和2各约20 pmol，4种dNTP 200 mol/L，10PCR缓 冲液5 L，加无菌双蒸水至总反应体积50 L，混匀。94 、4 min变性，加入Taq DNA聚合酶2.5 U，在PCR仪上进行反应：94 、50 s，50 、90 s，72 、90 s，共进行30个循环；72 延伸10 min。反应结束后，将反应产物行琼脂糖凝胶电泳，鉴定PCR产物大小。然后，按上海华舜胶回收试剂盒说明将其回收，异丙醇沉淀后，溶于20 L ddH2O中，-20 保存。 1.2.3 pKSES重组质粒的构建 ES片段与pKS载体同时用限制性内切酶Xhol 和EcoR 进行酶切，酶切反应在50 L反应体系中进行，并选用两种酶的切割效率都较高的缓冲液，50 L反应体系包括：DNA 20 L(2 g)，EcoR 1 L(10106UL)，Xhol 1 L(10106 UL)，100BSA 0.5 L，10Buffer 2.5 L，ddH2O2 2.5 L。37 酶切1.52.0 h，然后用热灭活法或加入琼脂糖上样缓冲液终止酶切反应。ES基因与载体按照华舜公司DNA回收试剂盒操作，回收后连接。连接反应体系中外源DNA片段与载体DNA的摩尔数之比尽可能控制在41，反应总体积为20 L，T4 DNA连接酶的用量为1 U，16 连接过夜。 常规氯化钙法制备感受态受体菌，取10 L连接物与200 L感受态细胞混匀置冰浴30 min，然后转入37 、5 min进行热刺激。并再置于冰浴1 min。加入LB培养液1 mL于37 培养45 min，低速离心沉淀细菌，并用无菌涂布棒将转化菌涂于抗生素选择性培养平板上。置于37 温箱培养过夜。重组质粒碱裂解法小量快速制备重组质粒DNA，酶切鉴定。 1.2.4 酵母转化重组质粒pPIC9ES构建 将pPIC9与pKSES重组质粒分别用Xhol 和EcoR 酶切。酶切方法及酶切后DNA片段的回收同前，连接反应体系(pPIC9载体1 L，ES片段5 L，T4 DNA连接酶1 U)，16 连接过夜。将重组质粒载体转化至DH5a大肠杆菌中，经氨苄西林和Xgal互补筛选阳性菌落，提取阳性菌落重组质粒DNA，Xhol 和EcoR 双酶切鉴定。将这种阳性重组质粒命名为pPIC9ES，并送上海基因公司进行核苷酸序列测定。 1.2.5 转化酵母细胞并筛选阳性转化子 将用Bgl 切开的pPIC9/ES 10 g溶于10 L ddH2O中，并与80 L准备好的酵母细胞混匀,移入预冷的0.2 cm电极杯，置冰浴5 min；用Gene Pulser电穿孔仪进行电穿孔，在RDB平板上涂布250 L转化细胞，30 培养，直至出现阳性转化子菌落。 2 结 果 2.1 PCR扩增结果 人ES cDNA片段长为549 bp，本研究PCR产物因为增加了信号肽及6个组氨酸，cDNA片段长度为590 bp（图1）。 2.2 ES真核表达载体的酶切鉴定 将PCR产物首先克隆pKS载体，经酶切鉴定后克隆入Xhol 及EcoR 位点，经蓝白筛选和双酶切鉴定，获得含552 bp的阳性克隆质粒pPIC9ES（图2）。 2.3 ES基因序列分析与酵母转化 将上述阳性克隆进行全自动反向测序，所获得目的基因序列与已发表的ES基因序列一致2。同时，ES真核表达载体转化酵母细胞后在平板上长出大量菌落。 3 讨 论 抑制血管生成药物通过抑制肿瘤血管的形成， 达到治疗恶性肿瘤的目的。目前，已知有40余种抑制新生血管形成的药物。ES是近几年发现的、具有特异性抗血管内皮细胞增殖的血管生成抑制剂。大量的体内和体外实验证实，ES对多种实体肿瘤的生长和转移有抑制效应，且反复用药不会产生耐药性3，4。目前，研究的热点是通过基因工程技术获得重组的蛋白并开发成抗肿瘤的药物。 目前，已有大肠杆菌表达系统、哺乳动物细胞表达系统和酵母表达系统被用于人源或鼠源ES的表达。原核表达系统虽然产量高，但多以包涵体的形式存在，难以复性；哺乳动物细胞表达系统产量低，且难以纯化，生产成本高。相比之下，毕赤酵母这一新近发展起来的真核表达系统，具有产量高，易于纯化及较少糖基化等特点5，6，现已成为理想的表达系统，非常适用于疫苗等基因工程产品的开发和研制。本研究采用pPIC9为毕赤酵母真核表达载体，成功构建了人源ES的真核表达系统。 本文从人新鲜肝细胞中提取总RNA，加入自行设计的人血管内皮抑素特异性引物，采用PCR方法从正常成人肝脏cDNA库中扩增出人源ES基因。由于pPIC9质粒太大，为了成功将目的基因克隆到毕赤酵母真核表达载体，我们首先将PCR产物克隆到较小载体pKS中，然后再克隆到相对分子质量较大的酵母表达载体pPIC9中，酶切鉴定后进一步进行序列测定，与GenBank胶原 cDNA和人ES基因比较，基因序列一致。同时，本文为了便于目的基因能够在毕赤酵母中得到高效表达及目的蛋白的纯化，在引物中补加了真核表达信号肽序列和6个组氨酸的氨基酸序列。本文人源ES基因真核表达系统的成功构建，为人血管内皮抑素的规模生产和临床应用提供了条件。 【参考文献】 1OREILLY M S, BOEHM T, SHING Y, et al. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growthJ. Cell, 1997, 88(2):277285. 2贺祥,潘卫,芮耀诚,等. 血管生成抑制素Endostatin研究新进展J. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2000,7(1):7679. 3BOEHM T, FOLKMAN J, BROWDER T, et al. Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistanceJ. Nature, 1997,390(6658):404407. 4NYBERG P, HEIKKILA P, SORSA T, et al. Endostatin inhibits human tongue carcinoma cell invasion and intravasation and blocks the activation of matrix metalloprotease2,9,and 13J. J Biol Chem, 2003,278(25):2240422411. 5MINNING SA, SERRANO P, FERRER C,