人白介素24cDNA克隆、突变纠正和原核表达.doc

人白介素24 cDNA克隆、突变纠正和原核表达 作者：魏丽丽，李成华，袁成福，陈济，丁嵩涛，刘革力，易发平，宋方洲【摘要】 目的 获取人白介素24(IL24)cDNA，构建原核表达载体以表达含有谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白GSTIL24。方法 以人外周血单核细胞(PBMC)总RNA为模板，RTPCR扩增IL24 cDNA，克隆入原核表达载体pGEX4T2，测序结果显示在IL24 cDNA第223位GA，370位TC，从而导致其编码蛋白的氨基酸发生改变：A75T，H124Y，通过二次PCR将其纠正，重组载体pGEXIL24转化大肠杆菌BL21(DE3)，异丙基D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，SDSPAGE，Western blot检测显示有融合蛋白GSTIL24表达。结果 通过RTPCR及二次PCR得到人IL24 cDNA，构建其原核表达载体，经IPTG诱导在相对分子量约为50 000处有融合蛋白表达。结论 IL24的重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)可以表达GSTIL24融合蛋白。 【关键词】 白介素24；二次PCR；突变纠正；融合蛋白；克隆；原核表达白细胞介素24(interleukin24, IL24)是1995年由美国哥伦比亚大学的Jiang等1研究发现的，它能选择性地抑制广谱癌细胞生长，促进凋亡，并具有一定的免疫调节能力。经复制缺陷腺病毒携带的IL24已经进入II期临床试验，研究结果显示：疗效显著而毒副作用很少2。因此，IL24有望成为肿瘤基因治疗的一种新的候选基因。我们拟通过RTPCR方法获取IL24 cDNA，构建其原核表达载体，并诱导其表达，为进一步的研究奠定基础。1 材料与方法1.1 材料大肠杆菌E.coli DH5，E.coli BL21(DE3)为本室保存。pGEX4T2(4970bp)购自Amersham公司。淋巴细胞分离液购自鼎国公司。Trizol，BamH，Xho，pyrobestTM DNA polymerase，DNA连接试剂盒,引物的合成和重组质粒测序由TaKaRa公司完成。RT试剂盒购自TOYOBO公司。DNA marker、小量质粒纯化抽提试剂盒和胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。小分子量蛋白marker购自博大泰克公司。抗谷胱甘肽S转移酶(glutathione S transferase,GST)抗体及其二抗购自Merck公司。1.2 IL24的基因克隆通过淋巴细胞分离液分离健康人静脉血的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，用Trizol提取其总RNA,通过RTPCR扩增IL24 cDNA，RT反应体系： 2L RNA，1L olig dT(20)，9L RNasefree dd H2O 70 5min，冰浴10min，再加入4L 5RT buffer，2L dNTPs， 1L RNase inhibitor，1L莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukaemia virus, MMuLV)反转录酶30 10min，42 20min，99 10min。根据GenBank中人IL24基因序列(登录号：NM 006850)通过DNAStar软件设计IL24引物，并在引物的5端引入酶切位点，上游引物a：5CGGGATCCATGAATTTTCAACAGAGGCTG3，下游引物b：5CCGCTCGAGCTAGACATTCAGAGCTTGTAG3(划线部分分别为BamH和Xho的酶切位点)，管家基因G3PDH (glyceraldehyde 3phosphate dehydrogenase)引物序列：Primer R：5TCCACCACCCTGTTGCTGTA3；Primer F：5ACCACAGTCCATGCCATCAC3，扩出的片段长450bp。PCR反应体系：ddH2O 8.4L，10PCR buffer 2L, dNTPs(2.5mmol/L)1.6L，引物a、b各2L，PrimerR、 F各0.4L，cDNA 3L，DNA聚合酶0.2L，94 5min，94 30s，56 30s，72 1min (30)，72 10min。1.3 原核表达载体的构建将PCR产物和pGEX4T2载体分别用BamH/Xho双酶切，胶回收试剂盒纯化，TaKaRa连接试剂盒连接16 30min，转化E.coli DH5感受态，酶切鉴定，将阳性克隆送TaKaRa公司测序。1.4 IL24 cDNA点突变的纠正223位G突变为A，设计其纠正引物c、d；370位T突变为C，设计其纠正引物e、f, c：5TCTTTCACAGCCCAGAAGGCT 3，d：5AGCCTTCTGGGCTGTGAAAGA 3，e：5TCTATTGTGGTAGTTTTTGAA 3，f：5TTCAAAAACTACCACAATAGA 3(标有下划线的碱基是纠正点突变位置)，采用高保真DNA polymerase，通过PCR纠正突变。223位突变的纠正步骤：分别扩增ac、bd片段，扩增条件为94 5min，94 30s，56 30s，72 45s(30)，72 10min，胶回收后，回收的片段分别稀释10倍做为模板等量加入第二次扩增体系，再加引物a、b，94 5min，94 30s，56 30s，72 1min (30)，72 10min。370位突变的纠正步骤除在分别扩增ae、bf片段时的退火温度改为54，其他相同。将最后的PCR产物与载体pGEX4T2分别经BamH/Xho双酶切后连接。酶切鉴定后测序，正确的载体命名为pGEXIL24。1.5 诱导表达和SDSPAGE分析将测序正确的重组载体转化E.coli BL21(DE3)，37过夜生长，以1100比例转接含有终浓度为100mg/L氨卞青霉素的2YT培养液中，37振荡培养至A600nm为0.6时，加IPTG至终浓度为0.1mmol/L，30继续培养3h；离心收集菌体，裂解沉淀，用BioRad垂直平板电泳仪以60g/L的浓缩胶及150g/L的分离胶跑SDSPAGE，通过考染分析结果。1.6 Western blot鉴定IPTG诱导的表达产物经SDSPAGE分离后电转移至PVDF膜上，0.5g/L脱脂奶粉室温封闭1h，抗GST单抗(12000)室温孵育2h，TBST洗膜3次(每次15min)，羊抗小鼠IgGHRP(110000)室温孵育1.5h，TBST洗膜3次(每次15min)，DAB闭光显色1min。2.1 IL24基因的扩增以人PBMC的总RNA为模板，通过RTPCR扩增得到一条与IL24 cDNA大小相符的条带，出现在2、3泳道，大小为450bp的条带是管家基因G3PDH的产物(图1)。2.2 原核表达载体的构建PCR产物和pGEX4T2载体分别用BamH/Xho双酶切，胶回收、连接、转化，酶切鉴定初步显示构建成功(图2)，测序结果与GenBank中人IL24基因序列(登录号：NM 006850)比对后发现：IL24基因的第223位G突变为A、370位T突变为C，并导致其编码的氨基酸的改变：75位的丙氨酸(A)变为苏氨酸(T),124位的组氨酸(H)变为酪氨酸(Y)。2.3 IL24基因点突变纠正针对突变位点设计引物，通过二次PCR纠正， PCR产物再经BamH/Xho双酶切与被相同双酶切的pGEX4T2连接，构建好的载体经测序证实突变纠正成功(图3)。2.4 GSTIL24融合蛋白的诱导表达鉴定正确的重组载体转化E.coli BL21(DE3)，IPTG诱导后，离心收集菌体，SDSPAGE分离，通过考染分析结果(图4)，在相对分子量约为50000处有一新生条带。2.5 GSTIL24的Western blot鉴定经IPTG诱导带有重组表达蛋白的菌体裂解液和未诱导菌体裂解液经SDSPAGE电泳，将蛋白转移到PVDF膜上，用检测GST标签蛋白的抗体检测融合蛋白的表达。结果显示在融合蛋白的相应位置出现特异条带，而在未诱导、空载体诱导及未诱导的泳道未出现杂交带(图5)。3 讨 论IL24是IL10家族的新成员，可抑制广谱癌细胞的生长，促进凋亡。它是目前发现的唯一一个对正常的组织细胞没有毒性的细胞因子。它的抑癌机制不是很清楚，可以通过调节依赖双链RNA的蛋白激酶(doublestranded RNA dependent protein kinase, PKR)、p38有丝分裂原活化蛋白激酶 (p38 mitogenactivated protein kinase, p38MAPK)、连接素(catenin) 、磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3kinase, pI3K)、胞外信号调节激酶1/2(extra celluar signalregulated kinase 1/2, ERK1/2)和应激活化蛋白激酶CJun氨基端激酶1/2(stressactivated protein kinase CJun Nterminal Kinase1/2, JNK1/2)等信号通路，抑制DNA的修复; 干扰线粒体功能；促进活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)合成；抑制肿瘤血管形成和侵袭转移能力而抑制癌细胞的生长。由复制缺陷腺病毒携带的IL24(AdIL24)现已进入期临床实验，治疗效果显著而没有明显的毒副作用2。但是，AdIL24对一些肿瘤细胞的作用效果不好，如85%-95%胰腺癌细胞具有Kras突变，研究发现仅用AdIL24转染胰腺癌细胞，没有抑制生长和促进凋亡的作用，而用细菌表达纯化的GSTIL24处理胰腺癌细胞后，可直接特异性诱导癌细胞凋亡而不管其Kras状态3；肾细胞癌系(A498，UOK121N)缺乏柯萨奇病毒和腺病毒受体，所以可抵抗腺病毒的感染，而用GSTIL24处理后可以以剂量依赖的方式抑制肾癌细胞的增殖，对正常的肾组织无影响4。GSTIL24也具有选择性诱导肿瘤细胞凋亡的特性，它可以帮助阐明IL24的作用机制，并有可能应用于肿瘤治疗5。IL24在人的外周血单核细胞表达6，所以我们通过提取PBMC的总RNA，通过RTPCR获取IL24 cDNA，然后将其连入原核高效表达载体pGEX4T2。该载体可以经IPTG诱导后在IL24蛋白的N端连上GST标签，融合蛋白可以通过亲和层析方法纯化，为进一步研究其作用机制提供便利。我们构建的重组载体经测序证实在IL24 cDNA第223位GA,370位TC，从而导致其编码蛋白的氨基酸发生改变：A75T，H124Y。因此，这两个突变为有意突变，突变位点位于IL24成熟肽的编码区内，极有可能改变IL24蛋白的空间构象，影响IL24与下游信号分子的相互作用，进而影响其对肿瘤细胞的作用效果7。所以，我们通过设计针对突变位点的引物，通过二次PCR方法将其成功纠正。测序正确的重组载体经IPTG诱导后，检测到有GSTIL24融合蛋白表达，为我们进一步的研究打下了良好的基础。【参考文献】 1Jiang H, Lin JJ, Su ZZ, et al. Substraction hybridization identifies a novel melanomadifferentiationassociated gene, mda7, modulated during human melanoma differentiation,growth and progression J. Oncogene,1995,11(12):24772486.2Fisher PB.Is mda7/IL24 a magic bullet for cancer? J. Cancer Res, 2005,65 (22):1012810138.3Su Z, Lebedeva IV, Gopalkrishnan RV, et al. A combinatorial approach for selectively inducing programmed cell death in human pancreatic cancer cells J. PNAS, 2001, 98(18):1033210337.4Yacoub A, Mitchell C, Brannon J, et al. MDA7 (interleukin24) inhibits the proliferation of renal carcinoma cells and interacts with free radicals to promote cell death and loss of reproductive capacity J. Mol Cancer Ther, 2003, 2(7):623632.5 Sauane M , Gopalkrishnan RV, Choo HT, et al. Mechanistic aspects of mda7/IL24 cancer cell selectivity analysed via a bacterial fusion protein J. Oncogene, 2004, 23(46):