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人核心蛋白聚糖的克隆及其在大肠杆菌中的表达 作者：王利民 温铭杰 李慎涛【摘要】 目的 在大肠杆菌中高效表达人核心蛋白聚糖，并建立适当的纯化方法，制备重组蛋白。方法 根据GenBank中人核心蛋白聚糖的序列设计特异性引物，从人肝cDNA文库中PCR扩增核心蛋白聚糖的编码序列，克隆到原核表达载体pET42a中，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达后，获得以高效表达的目的重组蛋白；用SDSPAGE和质谱鉴定重组蛋白。结果 重组蛋白主要以包涵体形式表达，SDSPAGE显示其分子质量与预期结果相符；经质谱鉴定，表达的重组蛋白为人核心蛋白聚糖。结论 成功地在大肠杆菌中高效表达了人核心蛋白聚糖，并纯化得到人核心蛋白聚糖蛋白，经鉴定，纯化所得到的蛋白为人核心蛋白聚糖。 【关键词】 核心蛋白聚糖；原核表达；蛋白纯化；质谱鉴定 【Abstract】 Objective To express the human decorin in Escherichia coli effectively, to set up a appropriate protocol for purification of the recombinant protein and to prepare the expressed human decorin.Methods Specific primers for human decorin were designed according to its sequence published in GenBank. DNA encoding the human decorin was PCR amplified from a human liver cDNA library, and was cloned into pET42, obtaining the plasmid of DCNpET42a. The plasmid was transformed into BL21(DE3) strain of E. coli.After induction with IPTG, the human decorin was effectively expressed in E.coli.Results Human decorin was expressed in E.coli in the form of inclusion body. Identifications by SDSPAGE and mass spectrometry demonstrated that the recombinant protein was human decorin.Conclusion Human decorin was successfully expressed in E. coli.A suitable protocol for purification of the recombinant protein was set up. After purification, we got pure protein of the expressed human decorin. 【Key words】 decorin，prokaryotic expression，purification of protein，identifications by mass spectrometer 在传统的烧伤治疗中，深度烧伤不可避免形成病理性瘢痕，由于病理性瘢痕形成机制尚未完全明确，烧伤后增生瘢痕及瘢痕疙瘩成为目前困扰临床治疗日益突出的问题。随着细胞生物学及分子生物学在瘢痕形成机制方面研究的深入，人们发现多种生长因子在瘢痕的形成中起作用，目前研究较多的有转化生长因子(TGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板生长因子(PDGF)及碱性生长因子(bFGF)，其中TGF的作用尤为突出，TGF是一种具有多种生物学效应的细胞因子，在损伤修复过程中可诱导纤维黏连蛋白、肌腱蛋白、胶原及蛋白多糖等多种细胞外基质（ECM）的沉积，同时通过降低蛋白酶的合成及提高蛋白酶抑制剂的水平阻止ECM的降解，诱导ECM的沉积，导致瘢痕的形成1。 体外及动物实验均已证实TGF抑制剂核心蛋白聚糖（Decorin）能与TGF结合，中和其活性，从而可以治疗烧伤瘢痕。国内外对治疗用Decorin的研究已做了大量的工作，但仍有许多空白，到目前为止，国内尚未见重组人Decorin的报道。本研究将人Decorin基因在大肠杆菌中高效表达，为生产治疗用Decorin打下基础。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 菌种及质粒：人肝cDNA文库，E.coli DH5、BL21（DE3）及pET42a(+)质粒为本室保存。 1.1.2 主要试剂及仪器：VentRDNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶（BioLabs公司）；质粒小提、玻璃奶回收试剂盒（博大泰克公司、赛百胜公司）；DNA相对分子质量标准（TaKaRa公司）；其它试剂均为国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 目的基因的扩增：根据GenBank中人Decorin的基因序列，设计合成一对引物（上海生工生物 通讯作者：李慎涛，Email:工程技术服务有限公司合成），引物中引入Nde、Hind酶切位点。扩增编码Decorin的DNA序列。 P1：5GGAATTCCATATGAAGGCCACTATCATCC3，P2：5CCCAAGCTTTTACTTATAGTTTCCGAGTT3，以人肝cDNA文库为模板，P1和P2为引物进行PCR扩增Decorin全长基因。扩增参数为：94 预变性5 min；94 45 s，55 45 s，72 1 min，32个循环；72后延伸10 min。电泳观察结果。 1.2.3 目的基因表达质粒（pET42/DCN）的构建：将特异的PCR扩增产物经玻璃奶回收纯化。纯化产物与原核表达质粒pET42a(+)分别用Nde、Hind双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收。经T4DNA连接酶连接过夜，转化E.coli DH5感受态细胞，涂布于含卡那霉素的LB培养板上，37培养过夜。挑取单克隆扩增后提取重组质粒进行Nde、Hind双酶切及PCR电泳鉴定，筛选出的重组质粒进一步测定目的基因的核苷酸序列。 1.2.4 目的基因的诱导表达：将重组质粒pET42/DCN转化工程菌E.coli BL21(DE3)，提取质粒、酶切鉴定。挑取单克隆接种于含卡那霉素（50 mg/L）的LB培养基中，37振荡培养过夜，按2%比例接种新鲜LB培养基，37振荡培养至对数生长期，加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.1 mmol/L诱导表达，于诱导前、诱导后1.5、3、5、7 h分别取300 l菌液离心后取菌体进行SDSPAGE，检测目的蛋白表达情况，确定最佳诱导时间。大量诱导培养后，超声破碎，分别取超声上清及沉淀行SDSPAGE，确定目的蛋白是否为可溶性表达。 1.2.5 目的蛋白的初步纯化及质谱鉴定：将诱导后的菌液5 000 r/min离心20 min，收集菌体，超声破菌，15 000 r/min离心45 min，收集沉淀，依次用1% Triton X100、PBS、4 mol/L尿素洗涤，用8 mol/L尿素溶解沉淀，进行分子筛纯化，收集洗脱液，进行SDSPAGE分析，合并含纯的洗脱蛋白质的组分。将少量初步纯化的样品置于Eppendorf管中，经胰蛋白酶水解后进行质谱分析，获取蛋白样品的肽质量指纹图，最后应用Masco软件在人类蛋白质公共数据库（NCBJ，SWISSPROT）中搜寻，获得蛋白质相关信息。 2 结果 2.1 人Decorin的PCR扩增 以人肝cDNA文库为模板，P1和P2为引物进行PCR扩增，其产物经琼脂糖凝胶电泳检测，发现在1.1 kb附近有一清晰条带，大小与预期结果相符。 2.2 重组质粒的构建及鉴定 将PCR产物经纯化后与原核表达质粒pET42a(+)同时用Nde、Hind双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收纯化。经T4DNA连接酶连接，转化E.coli DH5感受态细胞，卡那霉素抗性筛选获得阳性克隆。挑取单菌落扩增、提取质粒后经PCR及Nde、Hind双酶切鉴定，结果显示含有1.1 kb的目的基因片段（图1）。将该重组质粒测序，结果与GenBank中人Decorin基因序列完全一致，表明成功构建了Decorin表达载体（pET42/DCN）。 1道：DNA Marker;2道：Decorin表达载体质粒 图1 人Decorin表达载体质粒酶切鉴定 2.3 目的基因的诱导表达 重组质粒pET42/DCN转化工程菌E.coli BL21(DE3)后，挑单一菌落接种于LB培养基（含卡那霉素）中，培养至OD600约为0.65时，用0.1 mmol/L IPTG诱导表达，菌体经SDSPAGE检测，在26 kD至40 kD之间有一明显的蛋白表达条带，推测为重组Decorin的蛋白表达条带（图2）。菌液经大量诱导培养，超声破菌后将全菌、超声上清、超声沉淀物进行SDSPAGE分离，在超声沉淀物中有目的表达条带，证明目的蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式表达。 1 道：蛋白Marker; 2道：诱导后; 3道：诱导前 图2 人Decorin在大肠杆菌中的表达 2.4 目的蛋白的初步纯化及质谱鉴定 工程菌经IPTG大量诱导后，超声破菌，15 000 r/min离心45 min，收集沉淀，依次用1% Triton X100、PBS、4 mol/L尿素洗涤，用8 mol/L尿素溶解沉淀，进行分子筛纯化，收集的洗脱液经SDSPAGE分析，可见去除了大部分的杂蛋白（图3）。 图3 重组人Decorin分子筛纯化 2.5 表达蛋白的质谱鉴定及数据库检索 将初步纯化的蛋白样品经过质谱鉴定，经NCBI数据库分析，证实确为人Decorin。 3 讨论 核心蛋白聚糖（Decorin）是一种富含亮氨酸的小分子蛋白多糖，由富含亮氨酸的核心蛋白和一条糖胺聚糖链组成，所带糖链为透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素、肝素。经硫酸软骨素酶消化处理，得到核心蛋白2，3。Decorin主要分布在人和动物的主动脉、肺、皮肤、肾脏、肌腱、平滑肌、骨、软骨、脐带、韧带、胎盘及角膜等部位的结缔组织中，属于细胞外基质（extracellular matrix,ECM）成分，与胶原纤维紧密相连，从细胞分布特征看，Decorin主要分布于间充质细胞，而内皮、上皮源性细胞含量少47 。 大量的研究证明，TGF是引起多种脏器纤维化最关键的因子之一 79。而体外及动物实验均已证实Decorin能与TGF结合，并中和其活性，Decorin与抗TGF单克隆抗体一样，能明显抑制脏器纤维化的进展2，3。Decorin抑制TGF活性的可能机制为其与TGF受体竞争性结合TGF的同一位点或临近位点，因为TGF的三种受体中，其中一种受体（III型受体）的细胞外部分也是一种蛋白聚糖，叫做聚糖（betaglycan），其与TGF结合后，并不介导信号传导，它的作用是与TGF结合，并将其传递给其它TGF受体，完成信号传导5，7。 人和动物Decorin的核心蛋白基因有很高的同源性，从动物骨、肌腱、韧带等组织获取的Decorin可用于临床，材料来源广泛。但此方法费时、费力、成本高，而且仍有一定的抗原性，一定程度上限制了其广泛应用。最近，Brown 等10用Q琼脂糖层析法从牛角膜基质中提取了天然Decorin，其纯度达98.4%。陈志阳等9以大鼠肌肉为原料，采用匀浆、透析、层析等步骤分离、纯化了大鼠的Decorin。 随着基因工程技术的进步，已能够用基因工程的方法来生产人Decorin，用这种方法生产的人Decorin具有纯度高、成本低、不易产生耐受及免疫原性的优点。但目前的生产方法需用真核表达系统，工艺复杂、成本高、表达量低，不适合于工业化生产。Gu等11在sf21昆虫细胞中表达了人Decorin，将编码359个氨基酸的preprodecorin的全长cDNA克隆到穿梭载体pVL1392中，转染sf21昆虫细胞，感染后的细胞将成熟的Decorin分泌到培养基中，分泌的Decorin缺失葡糖胺聚糖，但已N糖基化，而在细胞裂解物中存在未被修饰的Decorin，这说明Decorin从sf21细胞中往外分泌需要N糖基化。在非变性条件下，用两步层析从条件培养基中有效地纯化了重组Decorin，最终收率为200 ml（3108个细胞）培养物得到1.5 mg的Decorin，而且这种重组的Decorin可能会有治疗用途。曹茂开等12将人Decorin的cDNA克隆到pGEX4T1原核表达载体中，并在大肠杆菌中成功地表达了Decorin与谷胱苷肽转移酶（GST）的融合蛋白。王伟铭等13构建了大鼠Decorin的真核表达载体，在体外COS7细胞可短暂表达Decorin。 本文研究成功地在大肠杆菌中高效表达了人核心蛋白聚糖，并纯化得到人核心蛋白聚糖蛋白，经鉴定，纯化所得到的蛋白为人核心蛋白聚糖。【参考文献】 1 徐阳成,罗成群. 烧伤瘢痕的形成机制与防治J. 中国烧伤创疡杂志，2003,15(4):354357.2 Iozz RV. 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