人DNA甲基化转移酶3B1真核表达载体的构建和鉴定.doc

人DNA甲基化转移酶3B1真核表达载体的构建和鉴定 作者：姜树原 邵国 张胜 黄丽华 龚向峰 周立社【摘要】 目的：构建人DNA甲基化转移酶3B1(DNMT3B1)真核表达载体pCMV-DNMT3B1。方法：根据Genebank中人DNMT3B1 cDNA序列设计并合成特异性引物,提取HCT116细胞总RNA,利用PCR技术扩增出DNMT 3B1,并将扩增产物克隆到真核表达载体pCMV-2B中。结果：PCR扩增得到人DNMT3B1的cDNA片段大小为2.6 kb,重组子利用限制性内切酶进行酶切、PCR鉴定和DNA序列分析得到真核表达载体pCMV-DNMT3B1。结论：成功构建了人DNMT3B1真核表达载体,为进一步研究DNMT3B1提供了条件。 【关键词】 DNA甲基化转移酶3B1;构建;鉴定Abstract Objective: To construct and identify the eukaryotic expression plasmid for human pCMV- 2B-DNMT 3B1. Methods: Accord to the published human cDNA sequence in Genebank, a pair of primers were respectively designed and synthesized. The total RNA was isolated from HCT116 cell. After amplification with reverse transcription polymerase chain reaction (RT - PCR), the product was cloned into pCMV- 2B vector. The recombinants were finally sequenced and identified by restrictive endonuclease digestion. Results: pCMV-DNMT3B1 eukaryotic expression vectors was successfully constructed, and it was identified by PCR, double restrictive endonuclease digestion and sequence analysis. Conclusion: The DNMT 3B1 eukaryotic expression vectors was successfully constructed and identified.Key words DNMT 3B1; Construction; IdentificationDNA甲基化是真核基因组修饰的一种重要方式，DNA甲基化出现于CpG二核苷酸中的胞嘧啶上1。真核细胞DNA甲基化由DNA甲基化转移酶(DNMT)催化，目前发现的DNMT有DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B及DNMT3L，其中DNMT1为维持型甲基化酶，DNMT3A和DNMT3B为从头合成型甲基化酶，DNMT3L单独没有活性，但其可以与DNMT3A或DNMT3B相互作用而调节其活性，目前还没有DNMT2的具体功能的报道。在Peter John研究小组的文章中指出，癌症病人样本中发现5/10的DNMT3A上调、6/10的DNMT1上调、8/10的DNMT3B上调，且DNMT3B上调的幅度最大，与对照相比，平均增加7.5倍。因此，DNMT3B在癌症的发生中可能有重要作用2。我们成功地构建了DNMT3B1的真核表达载体，为进一步研究DNMT3B的功能奠定了基础。1 材料与方法1.1 主要材料和试剂HCT116细胞购于上海细胞所，Trizol购自GIBCOBRL公司，反转录试剂盒购于invitrogen公司，限制性内切酶EcoR和BamH购于Takara公司，Expand High Fidelity PCR System及rapid ligation Kit购于Roche公司，DNA回收试剂盒购于Qiagen公司。1.2 方法1.2.1 总RNA提取将人HCT116细胞在培养皿中培养至对数生长期,用冷PBS洗涤后,每孔加入Trizol 1mL,吹打均匀后加入200 L氯仿,混匀,4 、12 000 rpm离心15 min,取上清液,然后加入500 L异丙醇沉淀,混匀后,室温放置10 min,4 、12 000 rpm离心10 min,沉淀物用70 %乙醇洗一次,4 ,7 500 rpm离心10 min,沉淀物用真空抽干,溶于20 L DEPC水中备用。1.2.2 RT-PCR取总RNA 5 g用DEPC水调整至11 L,然后加入1 L oligo-dT,1L 10 mM dNTP，65 放置2 min后置于冰上,加入6 L 反应缓冲液(1 l 0.1 M DTT,4 L 5buffer，1L Rnaseout)，37 放置10 min后加入逆转录酶,37 放置60 min,75 放置10 min。取5 L反应产物做模板,用DNMT3B特异性引物进行PCR扩增。所用上游端引物(含BamH酶切位点)为:CGGGATCCAAGGGAGACACCAGGCATCTC,下游端引物(含EcoR酶切位点)为:GCGAATTCTCACACCTCCTGGGTCCTGGCTC。扩增条件为：94 变性5 min，94 、30 s,56 、60 s,72 、300 s,共30个循环;72 延伸8 min。1.0 %琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物,将2.6 kb扩增产物用Qiagen PCR产物回收试剂盒进行回收。1.2.3 pCMV-DNMT3B1真核表达载体的构建及鉴定将回收的2.6 kb片段及pCMV-2B载体分别用BamH I和EcoR I双酶切后回收目的片段,将回收的片段及质粒用rapid ligation Kit连接酶进行连接。用上述连接产物转化DH5感受态菌,涂平板,次日挑取单个克隆进行扩增并提取质粒。将提取的重组质粒分别用BamH和EcoR双酶切。将酶切鉴定正确的重组质粒进行测序鉴定。2 结果2.1 PCR扩增目的片段以人的DNMT3B1为模板设计上游引物和下游引物,通过PCR扩增后将产物进行琼脂糖凝胶电泳，将2.6 kb左右目的片段回收。2.2 重组表达载体pCMV-DNMT3B1的构建及酶切鉴定将PCR产物及pCMV-2B以BamH和EcoR双酶切,酶切产物经PCR纯化试剂盒纯化去除小片段，经rapid ligation Kit连接，连接产物转化感受态细菌。挑取单克隆，扩大培养，提取质粒，经BamH和EcoR双酶切，琼脂糖凝胶电泳检查片段大小,可获得到2.6 kb左右和4.3 kb 左右目的2个片段。表明目的片段已插入到表达载体中。见图1。2.3 pCMV-DNMT3B1序列测定选取6个克隆送公司测序，测得序列与Genebank登记的人DNMT3B1基因同源序列完全相同，即为人pCMV-DNMT3B1质粒。3 讨论从细菌到植物、动物，体内DNA都存在甲基化修饰的现象。在高等脊椎动物中，基因组中5 %的胞嘧啶(C)可发生甲基化，发生甲基化的位置常位于基因组中CpG岛中的胞嘧啶(C)的第5位碳上,大约有70 %的CpG岛被甲基化。CpG岛中C的甲基化是一些生理及病理现象的原因，即CpG岛正常的甲基化控制着基因特异表达、发育调节、基因组印记和X染色体失活，而CpG岛异常的甲基化是诱导突变、产生癌症等疾病的罪魁祸首3-4。癌细胞表现为整体甲基化降低和抑癌基因启动区的高甲基化，抑癌基因的甲基化可能是癌症发生的重要因素5。图1 构建人pCMV-DNMT3B1质粒BamH和EcoR酶切电泳图M：marker;1：pCMV-2B 质粒BamH和EcoR酶切，切出片段4.3 kb;2：pCMV-DNMT3B1 质粒BamH和EcoR酶切，切出2.6 kb和4.3 kb两个片段 DNA甲基转移酶(DNMT)3是DNA甲基化从头合成的主要酶，包括DNMT3A和3B。从Lien研究团队克隆得到DNMT3B基因的同时，他们就发现有DNMT3B(isoform)异构体的存在6。到目前为止，DNMT3B已经发现近40种异构体，其中包括7种主要的异构体和其他的一些异构体6-8。DNMT3B含有24个外显子，3B1是长度最长的广泛表达的异构体，但在脑、骨骼肌和外周血单核细胞中不表达。其他的异构体与3B1相比，都缺少外显子10(60个核苷酸)。3B3广泛表达于正常组织和大多数肿瘤细胞中,3B4在C末端缺失108个氨基酸,3B5在终止密码前有一个新的长度为45氨基酸的序列,3B6与3B2相比翻译的起点多出12个氨基酸残基(由于3B6主要表达在胚胎干细胞，正常及癌症组织几乎检测不到它表达，并且其与3B2差异不大),3B7终止于内含子10的中部。全长的DNMT3B1具有DNA结合能力(N末端)和甲基转移的能力(C末端)，但在DNMT3B的异构体中，有一些异构体的C末端发生缺失(如3B4和3B7)或变化(如3B5)，有文献推测，C端的变化使这些异构体丧失了甲基催化能力，并且对其DNA结合能力也有影响9。这些异构体之间可能存在着竞争关系，因此DNMT3B异构体可能有着非常复杂的生物学功能10。我们成功构建了人DNMT3B1真核表达载体pCMV-DNMT3B1，因此可以在DNMT3B1的基础上通过删除等手段得到其他的异构体，为进一步研究DNMT3B的异构体在真核细胞中的功能奠定了基础。【参考文献】 1 Hermann A,Gowher H,Jeltsch A. 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