人CD44基因真核表达载体构建及在乳腺癌细胞中的表达.doc

人CD44基因真核表达载体构建及在乳腺癌细胞中的表达 作者：房新建 许文林 张徐 钱晖 陈琛 方莉莉 陈巧云【摘要】 目的： 从人类乳腺癌耐多柔比星细胞株细胞（MCF7/Adr)中克隆CD44基因并构建CD44基因真核表达载体pcDNA3.1CD44; 将pcNDA3.1CD44稳定转染入人乳腺癌细胞株（MCF7）细胞中。方法： 从MCF7/Adr细胞中提取总RNA进行RTPCR，获得全长的cDNA模板；将含有CD44基因的cDNA模板使用限制性内切酶进行双酶切获得带有酶切位点的CD44基因,再将带有酶切位点的CD44基因经TA克隆后测序验证，然后亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1中，双酶切鉴定后再次测序验证。脂质体法将pcDNA3.1CD44质粒转染到MCF7细胞中，48小时后RTPCR和流式细胞术检测转染前后CD44基因、蛋白在MCF7细胞的表达变化。结果： 成功从人MCF7/Adr细胞中克隆获得CD44基因并构建真核表达载体，转染后在MCF7中检测到CD44基因mRNA和蛋白水平表达上调；将上述表达CD44基因及蛋白的瞬时转染MCF7细胞经G418筛选两周后获得阳性克隆。结论： 成功克隆和建立人CD44基因真核表达质粒；pcDNA3.1CD44能在MCF7细胞中表达；在MCF7/Adr中新发现一种CD44基因的变异体(基因库号FJ216964)；这为进一步研究其基因功能打下了基础。 【关键词】 CD44； 多药耐药； 侵袭； 乳腺癌 Abstract Objective: To clone CD44 gene from multidrug resistant human mammary carcinoma cells(MCF7/Adr) and construct its eukaryotic expression vector. Which was transfected into MCF7 cells to obtain position clone.Methods： The full length cDNA encoding CD44 was obtained by RTPCR from the total RNA isolated from the MCF7/Adr cells and cloned into pMD19T vector. The CD44 gene sequence and reading frame were confirmed by two restriction enzymes and nucleotides sequencing, then inserted in the eukaryotic expression vector pcDNA3.1. The recombinant vector pcDNA3.1CD44 was transfected into MCF7 cells, and the expression changes of CD44 gene and protein were detected at 48 hour later, respectively. Results： CD44 gene was cloned from MCF7/Adr cells,and its eukaryotic expression vector was constructed successfully. After the identification and sequencing, the reconstructed plasmid was confirmed containing the sequence of CD44 gene. After transient transfection, the mRNA and protein level of CD44 gene were obviously upregulated in MCF7 cells. Screened with G418 for two weeks, positive clone was obtained from the above cells. Conclusion： The expression vector pcDNA3.1CD44 was constructed successfully and could be expressed in human mammary carcinoma cells. A new CD44 isoforms was found in MCF7/Adr cells(GeneBank NO.FJ216964)；Our study may start a new approach to study the function of CD44 gene and provide a method of gene therapy. Key words CD44； multidrug resistance； invasion； human mammary carcinoma cells CD44分子是一类重要的尚未归类的黏附分子,于1980年由Dalchau等1用单克隆抗体技术检测并最初发现,而后经过学者认定属于同一CD44 家族。它是一种跨膜糖蛋白并且是透明质酸(HA)的主要受体。CD44分子的主要功能包括作为导向性受体调节淋巴细胞在血液及淋巴液中运行；促进成纤维与淋巴细胞等与细胞外基质成分HA、硫酸软骨素等的黏附。 最新研究表明CD44分子的异常表达还可显著提高恶性肿瘤细胞的转移能力,与恶性肿瘤的侵袭、转移及耐药密切相关。Sheridan等2认为CD44+/CD24-的乳腺癌细胞亚群表达更高水平侵袭相关基因，因此具有更高的侵袭特性。然而，对于CD44在肿瘤侵袭中所起的作用目前仍存在争论；Lopez等3认为CD44在肿瘤细胞中的表达可以阻止肿瘤细胞的转移。因此，为了进一步明确CD44在肿瘤侵袭多药耐药(MDR)及肿瘤生长中所起的作用，本实验拟构建表达CD44基因的真核表达载体，为深入研究CD44基因对恶性肿瘤细胞侵袭及耐药特异性的影响奠定基础。 1 材料与方法 1.1 实验材料 乳腺癌耐药细胞株(MCF7/Adr)及敏感细胞株(MCF7)购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清购自杭州四季青公司；RTPCR试剂盒购自Fergma公司；高保真Taq酶、T4连接酶、pMD19T载体、凝胶回收试剂盒购自TaKaRa公司；质粒小提、大提试剂盒购自艾思进公司；1640培养基(含10胎牛血清、0.2%碳酸氢钠)，2.5含EDTA的胰蛋白酶，Trizol，OptiMEM低血清培养基(OptiMEM)，Lipofectamine 2000转染试剂盒、G418购自Invitrogen公司；限制性内切酶EcoR，Kpn购自NEB公司；感受态大肠杆菌(DH5)、真核表达载体pcDNA3.1由江苏大学基础医学和医学技术学院许文荣教授惠赠；FITC抗人CD44抗体购自eBioscience公司；引物合成及质粒测序均交上海生物工程有限公司完成；细胞培养箱及超低温冰箱(Forma公司)；倒置显微镜(Olympus公司)；PCR仪(ABI公司)；凝胶成像系统(Syngene公司)；流式细胞仪(BD公司)。 1.2 方 法 1.2.1 CD44在人乳腺癌细胞株中表达 采用RTPCR鉴定人乳腺癌敏感细胞株MCF7及耐药细胞株MCF7/Adr中CD44基因的表达。取2106个处于对数生长期的MCF7及MCF7/Adr细胞消化后离心收集，加入1 ml Trizol，按照说明书提取细胞总RNA并逆转录成cDNA。采用引物设计软件Primer 5.0设计人CD44基因(基因库号AJ251595)片段引物(引物序列见表1中CD441)。PCR反应体系：H2O 16.0 l，10缓冲液2.5 l,MgCl2 2.0 l, dNTP 0.5 l, Taq酶1.0 l,上游引物1.0 l, 下游引物1.0 l, cDNA 1.0 l。 PCR扩增条件为94 5 min预变性，94 30 s，65 30 s, 72 2 min, 30个循环；72 10 min延伸结束反应。同时以肌动蛋白作为内参。PCR产物行1琼脂糖凝胶电泳鉴定。 表1 基因引物序列 Tab 1 Sequences of gene primer 基因名称引物序列产物大小(bp)退火温度()CD441上游引物5GGATGGACAAGTTTTGGTGGCACG31 02365 下游引物5GGTTACACCCCAATCTTCATGTCC3CD442上游引物5GGGAATTCATGGACAAGTTTTGGTGGCACG31 02366下游引物5GGGGTACCTTACACCCCAATCTTCATGTCC3 肌动蛋白上游引物5CTCGCGCTACTCTCTCTTTC333058下游引物 5CATGTCTCGATCCCACTTAAC3 采用流式细胞术检测MCF7及MCF7/Adr细胞中CD44蛋白表达。取1106个处于对数生长期的MCF7及MCF7/Adr细胞消化离心并收集，冷PBS洗3次, 1 500 r/min 离心5 min,弃上清, 加入CD44单抗1 l。避光4染色30 min后,加PBS洗1次,1 000 r/min离心5 min,弃上清, 加0.5 ml PBS缓冲液，上机检测，数据用Cell Quest软件处理。 1.2.2 pcDNA3.1CD44真核表达载体的构建 CD44基因克隆：取3.5106个处于对数生长期的MCF7/Adr细胞消化离心收集加入1ml Trizol，按照说明书提取细胞总RNA并逆转录成cDNA。采用引物设计软件Primer 5.0在上述上下游引物中分别引入限制性内切酶位点EcoR和Kpn,并加入2个保护性碱基GG(引物序列见表1中CD442)。采用高保真Taq酶进行PCR扩增，体系为：ddH2O 37.5 l，10缓冲液5 l，dNTP 4 l，高保真Taq酶0.5 l，上游引物1 l，下游引物1 l，MCF7/Adr cDNA 1 l。扩增条件为94 5 min预变性；94 30 s，66 30 s，72 1 min, 30个循环；72 10 min延伸结束反应。PCR产物于1琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，并参照胶回收试剂盒说明书对PCR产物进行回收纯化。 TA克隆：TA克隆体系包括pMD19 simple vector 0.5 l，PCR纯化产物2 l，ddH2O 2.5 l，solution5 l；16连接过夜。从-70冰箱取1支100 l DH5冰上融化后加入连接产物轻柔混匀，冰上放置30 min；42水浴热激90 s，迅速转移到冰中冷却12 min；加入800 l LB培养基, 37摇床200培养45 min后，3 000 r/min离心3 min，弃上清。菌体沉淀均匀涂布于氨苄青霉素平板(50 g/ml)，待吸收后置于37孵育箱中，培养1216 h。灭菌枪头挑取35个单个菌落，置4 ml LB液体培养基温度37,摇床200 r/min,培养过夜。提取质粒并测定含量。EcoR，Kpn进行双酶切反应验证。反应体系为:2 l 10NEB 缓冲液, 1 l 质粒DNA(0.4 g/l), 0.5 l EcoR(10 U/l), 0.5 l Kpn(10 U/l),BSA 0.3 l, 加灭菌去离子水到20 l，37酶切过夜，1%琼脂糖凝胶电泳验证。将含阳性质粒的转化菌送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。 pcDNA3.1CD44真核表达载体的构建：Kpn和EcoR分别双酶切真核表达载体pcDNA3.1和CD44 TA克隆质粒。反应体系：缓冲液I 5 l, Kpn(10 U/l)1 l, EcoR(10 U/l) 1 l, pcDNA3.1质粒(或CD44 TA克隆质粒) 4 g，BSA 0.5 l，加灭菌去离子水到50 l；37 酶切过夜。1%琼脂糖凝胶电泳分别回收后进行定向连接反应。体系为: 0连接酶缓冲液 1 l, 载体DNA(约100 ng) 2.5 l, 目的片段DNA(约400 ng) 1.0 l, T4 DNA连接酶0.5 l，灭菌ddH2O补至10 l；4连接过夜。转化涂板培养12 h后，挑菌落培养过夜。小提质粒后酶切鉴定。阳性质粒进行测序验证。 1.2.3 pcDNA3.1CD44转染MCF7细胞 转染前1天接种MCF7细胞于6孔板中，共设3组，分别为阴性对照组(MCF7)、转染空载体组(MCF7/neo)和转染CD44组(MCF7/CD44)，每组2孔，每孔3.5105个细胞。转染时细胞融合度为7080%，转染前2 h换新鲜1640培养基。将20 l Lipofectamine加入100 l的OptiMEM中并轻柔混合，静置5 min；在100 l的OptiMEM中混合3 g质粒；将稀释的Lipofectamine逐滴加入质粒DNA中并混匀；室温孵育20 min后加入无血清1640培养基1 400 l，将上述混合物逐滴加入各组细胞中，并前后轻摇动平板混合。将培养板放置入37, 5% CO2培养箱中孵育16 h后吸除转染混合液，加入含10%胎牛血清的1640培养基2 ml。正常条件培养4872 h后分别检测CD44基因和蛋白表达。 1.2.4 MCF7转染pcDNA3.1CD44后CD44表达情况 用细胞刮齿将6孔板中的3组细胞轻柔刮下后计数。分别取5105及1106个细胞用PBS清洗2次后进行流式细胞术检测及RTPCR检测，方法同“1.2.1”。 1.2.5 G418筛选获得稳定表达CD44的MCF7细胞克隆 瞬时转染pcDNA3.1CD44的MCF7细胞48 h后用筛选浓度的G418(400 g/ml)加压筛选，每2天换液1次；当6天后出现大量的细胞死亡时，将G418的浓度减为150 g/ml的维持浓度继续筛选。23周后可见有新生的筛选克隆，待克隆逐渐增大后，用蘸有胰蛋白酶的滤纸， 从培养孔中随机挑取3个细胞克隆于另一24孔培养板中扩大培养1416 d,最后移入细胞瓶培养。 1.2.6 统计学处理 所有实验数据用s表示；应用SPSS11.5统计软件分析实验数据，采用单因素方差分析；P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 CD44在MCF7/Adr及MCF7细胞中表达 RTPCR从MCF7/Adr细胞中扩增出长度约1 000 bp的目的条带,而MCF7细胞中CD44无表达(图1)。流式检测发现MCF7细胞中CD44蛋白的表达率为(8.40.6)；而在MCF7/Adr细胞中CD44蛋白表达率为(97.30.8)；两者比较差异有统计学意义P<0.01。 2.2 CD44基因克隆 使用高保真Taq酶进行PCR扩增，PCR产物于1琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，并参照试剂盒说明书对PCR产物进行回收纯化(图2)。TA克隆后小提质粒, Kpn和EcoR双酶切鉴定阳性质粒(图3)。测序结果表明克隆的cDNA片段长度为1 023 bp，经与基因库公布的CD44标准序列比对发现该扩增片段为CD44新变异体，含CD44的14号外显子，1617号外显子，18号外显子1205位碱基。并将本研究扩增的CD44片段序列登陆至NCBI数据库(基因库号FJ216964)。 2.3 真核表达载体pcDNA3.1CD44的构建 T4 DNA连接酶将双酶切后的pcDNA3.1空载体及TA克隆质粒上的CD44目的片断连接后，转入感受态大肠杆菌中扩增，再用质粒小提试剂盒小提质粒；用Kpn和EcoR对构建好的pcDNA3.1CD44质粒进行双酶切, 结果表明CD44基因片段已经被成功的构建到了真核表达载体pcDNA3.1上(图4)。 2.4 MCF7转染后CD44基因和蛋白表达情况 转染后提取MCF7，MCF7/neo，MCF7/CD44细胞的mRNA并进行RTPCR,结果表明MCF7，MCF7/neo组细胞中CD44基因不表达，而MCF7/CD44中CD44基因高表达(图5)。 流式检测结果显示CD44蛋白在MCF7细胞中表达率为(8.71.2)；在MCF7/neo中表达率为(7.81.0)；而在MCF7/CD44细胞中的表达率为(70.02.5)；MCF7细胞与MCF7/neo细胞比较，差异无统计学意义；MCF7与MCF7/CD44比较，MCF7/neo与MCF7/CD44比较差异均有统计学意义P<0.01(图6)。 2.5 G418筛选获得稳定表达CD44的MCF7细胞克隆 将瞬时转染48 h的MCF7/neo，pcDNA3.1CD44细胞用筛选浓度的G418(400 g/ml)加压筛选，6 d后出现大量的细胞死亡时，将G418的浓度减为150 g/ml的维持浓度继续给药。23周后可见有新生的克隆形成(图7)。 3 讨 论 本研究新发现一种人CD44基因变异体(基因库号FJ216964)，该变异体在MCF7/Adr细胞株中高表达，而在MCF7细胞株中不表达或低表达，这为研究CD44基因在多药耐药的乳腺癌细胞株中的功能提供了方向。CD44基因共包含18个外显子，不同外显子的选择剪切产生了大量的CD44变异体。CD44是一种广泛分布于细胞表面的黏附分子，它涉及很多人体的病理生理学过程；与肿瘤的侵袭及耐药具有密切关系。 Misra等4研究表明，在多药耐药的人类乳腺癌细胞株(MCF7/Adr)中，透明质酸(HA)能使MCF7/Adr细胞株对多柔比星的敏感性增加,而对亲代细胞株MCF7无明显作用。MilettiGonzlez等5通过免疫共沉淀实验和共聚焦显微镜发现MCF7/Adr细胞株中P糖蛋白及CD44共同表达于MDR细胞膜上；并且在肿瘤细胞中，标准型CD44转染进CD44阴性的MCF7细胞中诱导了P糖蛋白(Pgp)的表达。HA是CD44的受体，它在肿瘤的侵袭特性及血管生成方面起着重要的作用。 Slven等6认为HA的降解产物刺激着内皮细胞增殖迁移以及HA特异性受体CD44的活化；从而在组织损伤血管相关的疾病中调节着血管的生成。Misra等7首次在结肠癌细胞株中发现HACD44的相互作用与环氧合酶2(COX2)有关；在HA过表达的正常人类上皮细胞株(HIEC6)以及结肠癌细胞株(HCA7)中，通过COX2的诱导，HACD44的结合激活了ErbB2PI3K/AKTcatenin的信号传导通路,从而影响着细胞的增殖及分化。 Bourquiqnon8报道：HA/CD44介导了锚蛋白为基础的细胞骨架蛋白及小G蛋白Rho鸟苷三磷酸酶的激活，从而促进了肿瘤的进展。HA由透明质酸合酶1，2，3(HAS13)合成。Golshani等9认为HAS1通过调节HA的合成以及HA受体(CD44)的水平来调节膀胱癌的生长及进展。Gtte等10认为类肝素酶HA和CD44调节着乳腺癌细胞的细胞表型，并且和乳癌患者的临床预后有关。对乳腺癌的临床治疗来说，化疗药物与类肝素酶HA和CD44靶向治疗药物的联合应用很可能会是一种很有前景的治疗方法，因为HA生成增加可以引起肿瘤细胞对很多种化疗药物的耐药，包括多柔比星顺铂甲氨喋呤紫杉醇等；干扰HACD44结合所产生的信号传导作用可以使肿瘤细胞对常用的化疗药物产生更好的治疗反映。综上所述，本实验的结果将为进一步研究CD44在肿瘤治疗中的作用奠定基础。【参考文献】 1 Dalchau R, Kirkley J, Fabre JW. Monoclonal antibody to a human braingranulocyteT lymphocyte antigen probably homologous to the W3/13 antigen of the rat J. Eur J Immunol, 1980, 10(10):745-749.2 Sheridan C, Kishimoto H, Fuchs RK, et al. CD44+/CD24-breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties,an early step necessary for metastasis J.Breast Cancer Res, 2006, 8(5):R59.3 Lopez JI, Camenisch TD, Stevens MV, et al. CD44 attenuates metastatic invasion during breast cancer progressionJ. Cancer Res,2005, 65(15):6755-6763.4 Misra S, Ghatak S, ZoltanJones A, et al. Regulation of multidrug resistance in cancer cells by hyaluronan J. J Biol Chem, 2003, 278(28):25285-25288.5 MilettiGonzlez KE, Chen S, Muthukumaran N,et al. The CD44 receptor interacts with Pglycoprote