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siRNA沉默PC3细胞中KDR基因的表达作者：缪应业，刘新，李浩，乔卿华，侯林虎，刘小圆，郝晓柯【摘要】 目的： 构建针对血管内皮生长因子受体（KDR）基因的shRNA表达载体，研究KDR基因沉默后对PC3细胞的增殖、生长的影响. 方法： 将合成的三对DNA正义链及反义链变性、退火，形成的双链DNA与pSilencerTM3.1H1 neo线性质粒用T4 DNA连接酶连接，构建pSilencer3.1KDR1, pSilencer3.1KDR2和Psilencer3.1KDR3三个siRNA表达载体. 经酶切及DNA测序鉴定后，采用脂质体介导的基因法转染PC3细胞，通过RTPCR、免疫印迹和免疫细胞化学染色实验,检测KDR的表达变化,MTT法检测细胞生长速度的变化，流式细胞仪检测细胞周期的变化，以未转染和转染阴性对照质粒pSilencer3.1NC的PC3细胞为对照. 结果： 酶切及测序证实设计合成的DNA已正确插入载体. RTPCR、免疫印迹和免疫细胞化学染色实验表明，pSilencer3.1KDR3有效地降解了PC3细胞中KDR基因的mRNA，下调蛋白表达;转染pSilencer3.1KDR3后PC3细胞生长速度明显变慢. 结果表明, pSilencer3.1KDR3组PC3细胞的G0/G1期百分率明显增高，而S期和G2M期的细胞减少,与其余组相比差异具有统计学意义(P<0.01). 而pSilencer3.1KDR1和pSilencer3.1KDR2无效. 结论： 成功构建针对KDR基因的siRNA表达载体，只有pSilencer3.1KDR3可有效地沉默KDR在前列腺癌细胞系PC3细胞中的表达，抑制PC3细胞的增殖. 【关键词】 RNA,小分子干扰;血管内皮生长因子受体;PC3细胞;前列腺肿瘤 0引言 血管内皮生长因子受体，又称激酶功能区受体(vascular endothelial growth factor , VEGFR2/kinase domain receptor, KDR)，其在血管内皮和部分肿瘤细胞上特异性表达，对于VEGF的信号转导及血管内皮生成起主导作用，在肿瘤发生、发展中起重要的调节作用. 研究表明，人前列腺癌细胞中有VEGF和KDR表达，存在VEGFKDR自分泌途径，与前列腺癌细胞的生长和转移密切相关1-2. 我们用pSilencerTM3.1H1 neo在前列腺癌细胞系PC3内表达针对KDR基因的短发卡状RNA(short hairpin small interfering RNA, shRNA), 阻断或降低细胞中KDR基因的表达， 探讨KDR基因沉默后对PC3细胞增殖、 生长的影响. 1材料和方法 1.1材料pSilencerTM3.1H1 neo质粒(美国Ambion公司)；LipofectamineTM2000转染试剂(美国Invitrogen公司)；PC3细胞株为本室保存；鼠抗人KDR mAb, 羊抗鼠二抗,DAB显色液(武汉博士德公司)；GAPDH内参及其mAb(上海康成生物有限公司)； pEGFPN2质粒由第四军医大学微生物学教研室韦三华博士惠赠. 1.2方法 1.2.1siRNA靶序列的设计及其表达载体构建根据siRNA设计原则3以及KDR(基因号AF063658)选取并针对KDR基因编码区（A：395414 AACATGGAGTCGTGTACATTA；B：29692988 AAGCTCCTGAAGATCTGTATA；C：39063925 AAGCGGCTACCAGTCCGGATA），分别命名为（pSilencer3.1KDR1, pSilencer3.1KDR2, pSilencer3.1KDR3）,序列经同源分析后，由北京赛百胜公司合成. 按操作说明将合成的DNA变性、退火，形成的双链DNA与pSilencerTM3.1H1 neo线性质粒连接，转化DH5感受态细胞，LB平板（AMP+）筛选阳性克隆，提取质粒进行BamH, Hind双酶切及琼脂糖电泳鉴定，并提交大连宝生生物公司进行测序. 1.2.2siRNA表达质粒转染PC3细胞提取测序正确的siRNA表达载体和pEGFPN2质粒并测定浓度. 将PC3细胞按1105/孔的数量转种于6孔培养板，siRNA表达载体转染PC3细胞按操作说明进行，每孔质粒用量为2 g，脂质体用量为5 L. 以任何已知序列不同源的shRNA序列的质粒为阴性对照, 以带有绿色荧光蛋白的pEGFPN2质粒同步转染，荧光倒置显微镜于395 nm检测转染效率. 1.2.3RTPCR检测KDR的表达转染后48 h，提取总RNA并定量，用DNA酶处理总RNA以去除DNA污染，取等量的RNA反转录后进行PCR. pSilencer3.1KDR1位点PCR引物正义链：5GCCCAATAATCAGAGTGGCAGTG3，反义链：5GAGACGGACTCAGAACCACATCA3，产物长度506 bp；pSilencer3.1KDR2位点 PCR引物正义链：5GCACGATTCCGTCAAGGG3，反义链：5TTCAAAGGGAGGCGAGCA3，产物长度383 bp；pSilencer3.1KDR3位点PCR引物正义链：5ACGGACAGTGGTATGGTT3，反义链：5CGAGTCAGGCTGGAGAAT3，产物长度279 bp. 内参照肌动蛋白 PCR引物正义链：5GCTCGTCGTCGACAACGGCTC3，反义链：5CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC3,产物长度353 bp. PCR产物经琼脂糖电泳后采用FR200图像分析系统分析. 1.2.4细胞总蛋白的提取及免疫印迹实验转染后72 h提取细胞总蛋白并定量，调整蛋白浓度至相同水平进行SDSPAGE电泳，转膜、封闭；鼠抗人KDR一抗1/1000，GAPDH为1/1000，4过夜，加羊抗鼠二抗1/1000室温1 h；洗涤、DAB显色30 min. 采用FR200图像分析系统分析结果. 1.2.5免疫细胞化学染色及阳性分值的计算转染后72 h的细胞爬片，经洗涤、固定，行KDR的免疫细胞化学染色，以 PBS代替KDR抗体为阴性对照. 每张染色片随机观察几个视野, 计数100个细胞，染色深度以多数细胞为准. 阴性细胞记0分,黄色记1分,棕黄色记2分,棕褐色记3分，合计即为该细胞的免疫细胞化学染色阳性分值，每种细胞计5次求均数. 1.2.6siRNA转染后PC3细胞的生长曲线转染后24 h，消化下各孔PC3细胞，按5103/孔的数量转种于96孔板，设24, 36, 48, 60, 72, 84 h 6个时间点，培养至各时间点，MTT法检测吸光度A值. 1.2.7细胞周期测定收集转染后72 h的细胞，加预冷的无水乙醇快速混匀(乙醇终浓度为600 mL/L700 mL/L) 4固定l h; PBS洗涤2次，每次加洗液2.5 mL左右，1000 r/min离心5 min；加100 L PBS调整细胞密度，每份样品为8105个细胞,加入1 mL PI 染色液，室温下避光染色30 min,300目滤网过滤于流式细胞分析样品管，以流式细胞仪检测 DNAPI 的荧光强度，结果采用Modit 软件系统进行析. 统计学处理：使用SPSS12.0统计分析软件，计量数据用xs表示，对多组间均值比较行方差分析，两两比较采用LSDt检验. P<0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1siRNA表达载体的构建酶切后的琼脂糖电泳图可见大小为66 bp左右的酶切片段，与设计合成的KDR基因特异性序列大小相符（图1）. DNA测序表明，各序列已成功插入了pSilencerTM3.1H1 neo载体. 将各siRNA表达载体分别命名为pSilencer3.1KDR1, pSilencer3.1KDR2和pSilencer3.1KDR3，阴性对照质粒命名为pSilencer3.1NC. 2.2转染效率的观察转染后24 h，经荧光倒置显微镜下观察pEGFPN2质粒同步转染的PC3细胞，结果显示，此次转染的效率约为65%. 2.3siRNA对KDR mRNA抑制作用与pSilencer3.1NC和未转染组PC3细胞相比，pSilencer3.1KDR3组PC3细胞的KDR mRNA水平明显下调；pSilencer3.1NC、未转染组和pSilencer3.1KDR3的KDR灰度积分值分别为：1894, 1914和1043，而后者比前二者均低(P<0.01). pSilencer3.1KDR1和pSilencer3.1KDR2组PC3细胞KDR的mRNA水平变化不明显. 各组间肌动蛋白的mRNA水平一致（图2）. 2.4siRNA对KDR蛋白表达的抑制作用转染72 h后，免疫印迹结果表明pSilencer3.1KDR3组，KDR蛋白总量明显下调，而其余各组蛋白总量水平无明显差异，各组GAPDH的表达水平一致（图3）. 免疫细胞化学染色结果表明pSilencer3.1KDR3组KDR阳性细胞减少，阳性分值减低. 经方差分析5组之间差异有统计学意义(P<0.01)，经LSDt检验，pSilencer3.1KDR3组与各组相比较，差异具有统计学意义(P<0.01)，而各组组间差异无统计学意义（表1）. 2.5siRNA抑制PC3细胞的生长与对照组相比，pSilencer3.1KDR3组转染的PC3细胞的生长速度明显变慢，pSilencer3.1KDR1, pSilencer3.1KDR2转染组无明显变化（图4）. 表1PC3细胞KDR蛋白免疫细胞化染色结果的比较 2.6siRNA对PC3细胞周期的影响pSilencer 3.1KDR3组G0/G1期细胞数较未转染组增加了18.33，较pSilencer3.1NC组增加了11.41；进入S期和G2M 期的细胞数较未转染组分别减少了12.07和6.26，较pSilencer3.1NC组减少了8.21%和3.2(表2,图5).表2siRNA对PC3细胞增殖周期的影响 图5流式细胞仪检测PC3细胞周期 3讨论 VEGF与其受体在肿瘤血管形成中起着关键的调节作用4-5 . VEGFR家族的成员KDR是发挥功能的主要受体，不仅表达于肿瘤组织的血管内皮细胞而且表达于肿瘤细胞的胞膜和(或)胞质，这提示肿瘤细胞分泌的VEGF不仅以旁分泌方式作用于血管内皮细胞并诱导血管新生，也可以通过自分泌途径与自身表面的受体结合而促进细胞生长或迁移、抑制细胞凋亡. Witte等6制备的可与KDR特异性结合的mAb DC101，在体外能抑制VEGF与受体的结合，阻断VEGF诱导的信号传导；Bruns等7用DC101治疗前列腺转移直肠癌小鼠模型，发现该治疗不仅抑制小鼠肿瘤血管的生成，而且导致肿瘤内皮细胞的死亡，这些结果表明抑制肿瘤细胞细胞和或肿瘤血管内皮细胞上VEGF受体的表达，不仅可阻止肿瘤细胞的生长，也可抑制肿瘤血管的生成，从而阻断肿瘤的生长和转移. 本研究构建的三个针对KDR基因的siRNA载体在前列腺癌细胞系PC3内表达了针对KDR基因的shRNA，结果表明针对3号KDR基因位点的pSilencer3.1 KDR3载体有效地抑制了PC3细胞中KDR基因和蛋白的表达. Schubert等8报道siRNA的干涉效率是受靶RNA的局部二级结构影响. pSilencer3.1KDR1和pSilencer3.1KDR2可能处于RNA的局部二级结构或者是其大部分碱基对处于RNA二级结构的“茎”位置，而pSilencer3.1KDR3可能是靶序列局部结构中的非配对碱基所占比例较大，则siRNA易于与其结合，从而得到较好的干涉效果，而本研究siRNA靶RNA的局部二级结构的猜测，有待进一步证实. 虽然靶位点选择的成功与否与其在mRNA中所处位置及二级结构密切相关，但是pSilencer3.1KDR3能够抑制PC3细胞中KDR基因和蛋白的表达，从而能够抑制VEGF和KDR的结合，阻止肿瘤细胞生长、增殖. 该策略，为肿瘤基因治疗奠定了基础，也为肿瘤血管抑制治疗提供了思路.【参考文献】 1 Strohmeyer D, Rossing C, Bauerfeind A,et al. Vascular endothelial growth factor and its correlation with angiogenesis and p53expression in prostate cancerJ. Prostate，2000，45(3)：216-224.2 Ferrer FA, Miller LJ, Andrawis RI, et al. Angiogenesis and prostate cancer: In vivo and in vitro expression of angiogenesis factors by prostate cancer cellsJ. Urology，1998，51(1)：161-167.3 UiTei K, Naito Y, Takahashi F, et al. Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian andchick RNA interferenceJ. Nucleic Acids Res，2004，32(3)：936-948.4 Suhardja A, Hoffman H. Role of growth factors and their receptors in proliferation of microvascular endothelial cellsJ.Microsc Res Tech，2003，60(1)：70-75.5 Underiner TL，Ruggeri B，Gingrich DE. Development of vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) kinase inhibitors as antiang