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RNA干扰对流感病毒NP和PA基因表达及病毒增殖的抑制 作者：李瑶琛，赵志刚，李康生【关键词】 正粘病毒科 RNA interference mediated inhibition of influenza virus NP and PA gene expressions and multiplication in MDCK cells【Abstract】 AIM: To apply the small interfering RNAs targeting NP or/and PA gene of influenza virus to inhibit the expression of NP or/and PA and multiplication of influenza virus in MadinDarby canine kidney (MDCK) cells. METHODS: The recombinant plasmids, pEGFP/NP, pGenesil/PA and pEGFP/NP+ PA were constructed and transfected into MDCK cells. The transfected MDCK cells were infected with subtype H5N1 strain. The transfection efficiency was determined using fluorescence microscopy. The expression levels of NP gene were determined by Western blot and the transcriptions of NP or/and PA gene were detected by semiquantitative RTPCR. The culture supernatants were assayed for hemagglutination activity (HA) at different time points after infection in order to determine the effect of the siRNA on the multiplication of infectious virus. RESULTS: The results from fluorescence microscopy suggested that the transfection efficiency was about 65.0%. The introductions of plasmids pEGFP/ NP and pEGFP/NP+PA showed efficient in specifically inhibiting the expression of NP according to the results of Western blot, with inhibitory rates of 64.5% and 69.6%. Semiquantitative RTPCR showed that the transcription of NP gene was reduced by nearly 66.0% in infected MDCK cells after transfected by pEGFP/NP, and PA gene was reduced by nearly 63.0% in infected MDCK cells after transfected by pGenesil/PA. The transcriptions of NP and PA genes were reduced by nearly 71.4% and 69.3% synchronously in infected MDCK cells transfected by pEGFP/NP+PA. In contrast, the control plasmid did exhibit no inhibitory effect on the protein expressions and the transcription of NP or/and PA gene. The inhibitory rates of influenza virus in MDCK cells transfected with pEGFP/ NP, pGenesil/PA and pEGFP/NP+PA were 87.0%, 75.0% and 96.9% respectively according to the HA results, which demonstrated that the inhibitory ability of pEGFP/NP+PA was the strongest among the various groups. CONCLUSION: The small interfering RNAs targeting NP or/and PA gene shows a dramatic inhibition on protein expression, RNA transcription and multiplication of influenza virus in MDCK cells.【Keywords】 RNA interferece; orthomyxoviridae; MDCK cell line; NP gene; PA gene【摘要】 目的： 应用RNA干扰技术（RNAi）研究针对流感病毒NP或/和PA基因的siRNA抑制NP或/和PA基因的表达及抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖. 方法： 分别构建针对NP，PA及同时干扰NP和PA的三种siRNA表达质粒pEGFP/NP，pGenesil/PA和pEGFP/NP+PA，转染MDCK后，H5N1亚型流感病毒感染细胞，荧光显微镜判断转染效率，蛋白质印迹和半定量RTPCR检测NP及PA蛋白表达及基因转录水平的变化，并在不同时间点检测细胞培养上清中的血凝值（HA），观察siRNA抑制流感病毒增殖的能力. 结果： 荧光显微镜结果表明，重组质粒转染效率达65.0%. 蛋白质印迹结果表明，重组质粒pEGFP/NP和pEGFP/NP+PA均能抑制NP蛋白在MDCK细胞内的表达，两者的抑制率分别为64.5%和69.6%. 半定量RTPCR检测到pEGFP/NP质粒在MDCK细胞内对NP基因的转录抑制率为66.0%；pGenesil/PA质粒对PA基因的转录抑制率为63.0%；pEGFP/NP+PA质粒对NP和PA基因的转录同时抑制率，分别为71.4%和69.3%. 而对照质粒pEGFP/HK对NP或/和PA基因的蛋白表达及转录均没有抑制作用. HA结果表明，三种质粒均能抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖，以pEGFP6/NP+PA的作用最为显著，它们抑制流感病毒增殖的能力分别为87.0%，75.0%和96.9%. 结论： NP或/和PA基因的siRNA质粒可明显抑制NP或/和PA基因的转录和表达，并有效地抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖.【关键词】 RNA干扰；正粘病毒科；MDCK细胞株；NP基因；PA基因0引言近来，禽流感在世界各地频繁爆发，不仅给养禽业造成了巨大的经济损失1，也严重威胁到人类的健康2. 高致病性的H5N1亚型是较为严重的一类3. 而现有的、针对HA和NA的流感疫苗在流感病毒新亚型出现时却无能为力4. 我们利用RNA干扰技术 (RNA interference, RNAi)5，选择在A型流感病毒复制过程中起重要作用的RNA聚合酶PA（polymerase acidic protein, PA）或/和核蛋白(nucleoprotein，NP)编码基因中的高度保守序列作为siRNA靶序列，将其分别或同时克隆入表达载体，在马丁达比狗肾（MadinDarby canine kidney，MDCK ）细胞中，观察诱导PA或NP基因沉寂情况，以期具有更高的抑制效能，为预防与治疗流感寻找一种有效的措施.1材料和方法1.1材料pEGFP和 pGenesil1 载体由武汉晶赛生物技术有限公司提供. 限制性核酸内切酶购自NEB公司. 连接酶、DNA Marker由Takara公司提供. 转染试剂LipofectamineTM 2000购自Invitrogen. 兔抗人NP抗体购于晶美生物工程有限公司，actin mAb及HRP聚合的羊抗兔IgG购自Sigma公司.1.2方法选用流感病毒A/Pheasant/Shantou/44/2004 (H5N1亚型，2004.1.5分离). 将病毒接种于10 d鸡胚尿囊腔中，置于37的孵箱中，于病毒接种后的48 h收获尿囊液，冻融、离心后分装贮存于-70备用. 测定其空斑形成单位（plaque forming units, PFU）及感染复数（multiplicity of infection，MOI）. 据文献6，结合siRNA序列设计原则，确定PA2087和NP1496各19个单核苷酸作RNA干扰靶序列. 正义链：5gat ccg gat ctt att tct tcg gag ttc aag acg ctc cga aga aat aag atc ctt ttt tga att ca3， 反义链：3gcc tag aat aaa gaa gcc tca agt tct gcg agg ctt ctt tat tct agg aaa aaa ctt aag ttc ga5; PA2087，正义链：5gat ccg caa ttg agg agt gcc tga ttc aag acg tca ggc act cct caa ttg ctt ttt tga gct ca3，反义链：3gcg tta act cct cac gga cta agt tct gca gtc cgt gag gag tta acg aaa aaa ctc gag ttc ga5，上述两序列的5 端和3 端分别引入BamHI和HindIII的酶切序列，也在HindIII位点内侧分别引入EcoRI和SacI的酶切位点，以便将两个RNA干扰序列以串连的方式克隆入同一个载体中的两个U6启动子后，即U6 promoterNPU6 promoterPA，这样可同时产生两个RNA干扰序列. 等量的正反义寡核苷酸（长65nt）混合、退火后分别插入经BamHI和HindIII线性化的载体pEGFP和pGenesil1中，得到重组载体pEGFP/NP和pGenesil/PA. 两载体经SacI和SalI双酶切后，分别回收载体与片段并连接，构建成新的重组子pEGFP/NPPA. 实验中为了排除siRNA本身的影响，设计了一个与流感病毒基因组序列无关的HK序列作为对照，寡核苷酸片段均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成. MDCK细胞株常规培养于含有100 mL/L FCS, 2 mol/L谷胺酰胺、105 U/L青霉素和100 mg/L链霉素的MEM培养基中，每23 d 进行细胞传代. 转染采用LipofectamineTM 2000，根据说明书进行操作. 分为pEGFP/NP, pGenesil/PA, pEGFP/NP+PA, pEGFP/HK和未转染对照组进行实验. 转染后6 h更换正常培养基，12 h后在荧光显微镜与流式细胞仪下观察EGFP的表达，计算转染效率. 细胞转染12 h 后，经H5N1感染72 h，2.5 g/L的胰酶消化，收集细胞，提取RNA. 在RTPCR反应体系中逆转录引物采用Uni12和PolyT进行，PCR扩增的三对引物, 第1对是内源性对照actin (336635 bp)，第2对与第3对是被沉寂的目的基因引物，即H5N1/NP (9011500 bp)和H5N1/PA (7082207 bp). GeneTools软件判定靶基因的沉寂程度. 收集转染并经感染的细胞，提取总蛋白，紫外分光光度计法进行蛋白质定量. 50 g蛋白质进行120 mL/L SDSPAGE（BioRad, USA），之后转至NC膜上. NP抗体的浓度为1400，二抗（羊抗兔IgG/HRP）为13000，辣根过氧化物酶/LumiGLO化学发光法进行Western检测. GeneTools软件判定靶蛋白表达的沉寂程度. 转染12 h后，去除培养基，以MOI为0.01的剂量感染H5N1病毒，于35, 50 mL/L CO2孵箱中吸附1 h后，加入5 mL的感染性培养基（含有2 mg/L的胰蛋白酶）于37, 50 mL/L CO2孵箱中培养，于不同的时间测定细胞培养上清的血凝值（hemagglutination activit, HA）. 病毒抑制率采用公式1(HAtest/HAcontrol)100进行计算11.2结果siRNA表达载体及其多克隆位点如图1A和图1B所示. 重组载体pEGFP/NPPA如图1C所示，两个小发夹RNA（small hairpin, shRNA）的产生见图2. pEGFP/NP采用EcoRI进行酶切鉴定，酶切后产生一个大约400 bp的片段. pGenesil/PA采用SacI进行单酶切鉴定，如图3A. pEGFP/NPPA重组体采用BamHI酶切鉴定，酶切后可得到约400 bp的片段，与预期结果相同(图3B). 荧光显微镜检测表明，除对照组呈阴性外，pEGFP/HK, pEGFP/NP，pGenesil6.1/PA或pEGFP/NP+PA实验组在转染12 h后均可见荧光蛋白表达，4872 h达高峰. 流式细胞仪分析，EGFP阳性细胞达65.0%（图4）.A: pEGFP; B: pGenesil; C: pEGFP/NPPA.图1siRNA表达质粒图谱（略）2.1转染细胞中NP和PAmRNA的检测各实验组actin 基因片段条带的亮度强弱相似，表明模板量一致. 未转染组与pEGFP/HK组细胞在病毒感染后，NP或PA基因扩增带亮度较强，而pEGFP/NP, pGenesil6.1/PA或pEGFP/NP+PA组的NP或/和PA基因扩增带亮度明显减弱，表明3种重组质粒在mRNA水平上抑制病毒NP或/和PA基因的转录，pEGFP/HK对靶基因的mRNA没有抑制作用，提示siRNA抑制靶基因转录有特异性. 以对照组NP或PA扩增条带为标准(亮度定为100)，GeneTools软件分析结果显示，pEGFP/HK组的NP或PA是对照组的96.5%和100%；pEGFP/NP组NP, PA基因扩增条带分别是对照组的34.0%和97.3%；pGenesil6.1/PA组NP, PA基因的扩增条带分别是对照组的89.6%和37.0%; pEGFP/NP+PA组的NP或PA扩增条带强度分别是对照组的28.6%和30.7%(图5).2.2转染细胞中NP蛋白的检测对照组与pEGFP/HK组的NP蛋白杂交带明显强于pEGFP/NP组或pEGFP/NP+PA组，其中pEGFP/NP+PA组的NP杂交带更弱. GeneTools软件分析结果所示，以对照组的NP蛋白带为标准（亮度定为100）， pEGFP/HK, pEGFP/NP或pEGFP/NP+PA组的条带强度分别是对照组的99.3%, 35.5%和30.4%,表明干扰序列可以特异地抑制流感病毒蛋白的表达（图6）.A： 表达质粒转录后，形成的发夹样结构； B： shRNA经dicer酶剪切后，特异性地结合到流感病毒基因组NA或PA节段上.图2流感病毒NP或PA的shRNA（略）2.3NP或PA特异性siRNA抑制流感病毒在MDCK细胞的增殖各实验组于转染12 h后分别利用MOI为0.01的H5N1流感病毒攻击，于感染后不同时间测得的HA值(表1). 可以看出，对照组和pEGFP/HK组的病毒滴度随着病毒作用的时间延长而增高，在4872 h达到高峰，HA值均达到512，表明非特异的siRNA不会影响病毒的增殖. pEGFP/NP或pGenesil6.1/PA组在病毒滴度的高峰时间，即4872 h的HA值仅为64和128，以后随时间的延长并没有升高，表明pEGFP/NP或pGenesil6.1/PA在一定程度上能够抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖，且pEGFP/NP的抑病毒能力好于pGenesil6.1/PA. 在pEGFP/NP+PA组培养上清中，随病毒感染时间的延长未见到HA值明显升高，感染72 h后HA值仅为4. pEGFP/NP，pGenesil6.1/PA和pEGFP/NP+PA三者抑制病毒增值率分别为87%，75% 和96.88%.A： pEGFP/NP和pGenesil6.1/PA的酶切结果. M：标准分子量DL2000; 1: pEGFP/NP; 2: pEGFP/NP经EcoRI酶切后可以获得一个约400 bp的片段; 3: pGenesil6.1/PA; 4: pGenesil6.1/PA经SacI的酶切结果. B: pEGFP/NP+PA的酶切鉴定. M： 标准分子量DL2000; 1,3: 不同克隆的pEGFP/NP+PA; 2, 4: pEGFP/NP+PA经BamHI酶切后，可以获得400 bp的片段.图3siRNA表达质粒的限制性内切酶鉴定（略）A: pEGFP/NP转染MDCK细胞100; B: pEGFP/NP+PA转染MDCK细胞400; C: 阴性对照100.图4荧光显微镜检测质粒转染效率（略）actin作为内参照， 1: pEGFP/NP+PA; 2: pGenesil6.1/PA; 3: pEGFP/NP; 4: pEGFP/HK; 5: 感染的MDCK细胞; 6: MDCK细胞; M: 标准分子量DL2 000.图5半定量RTPCR法分析NP和PA mRNA的沉寂结果（略）1: H5N1感染的MDCK; 2: pEGFP/NP组; 3: pEGFP/NP+PA组; 4: pEGFP/HK组.图6Western Blot分析NP和PA蛋白表达抑制情况（略）表1特异性siRNA对流感病毒增殖情况的影响（略）HK: siRNA阴性对照序列; NP: 流感病毒核蛋白（nucleoprotein, NP）; PA: 流感病毒RNA聚合酶酸性蛋白亚单位（polymerase acidic protein, PA）.3讨论流感病毒是节段性、单股负链RNA病毒，基因组RNA在复制过程中高达10-4的错配率及机体免疫和药物治疗的选择压力，使病毒不断地变异与进化7，是造成流感流行与爆发的重要因素. 流感病毒RNA的转录、复制依赖于NP和3种RNA依赖的RNA聚合酶(RdRps)，即PB1，PB2和PA共同组成的核糖核蛋白酶复合体（RNP）. NP与其他聚合酶蛋白共同调节病毒RNA转录与合成间的转换NP也可以防止RNA合成中断，有利于RNA链的延伸8. PA是RNA依赖的RNA聚合酶亚单位之一，是RNA复制的基础. 如果PA的含量降低，RNA片段的转录与复制可能会被阻断，流感病毒的增殖则会受到抑制9. 由此看来，NP或PA基因是阻断流感病毒增殖的理想靶基因片段. RNAi是目前最有效的基因沉寂技术. 新近的研究表明，siRNA可通过沉寂同源的病毒基因或沉寂与病毒复制有关的宿主基因，使病毒在感染的不同时期受到抑制，且很少出现副作用，是一个潜在的、强有力的抗病毒武器，在抗HIV的实验研究中已经显示出较好的作用，表明RNA沉寂用于抗病毒治疗有良好的前景.为了更有效地抑制流感病毒的转录与复制，我们构建了干扰流感病毒NP或/和PA的siRNA表达质粒，避免了同一细胞转染多个质粒难度大、效率低的困难. 结果表明，三种重组质粒pEGFP/NP, pGenesil6.1/PA和pEGFP/NP+PA都能不同程度地抑制目的基因NP或/和PA的RNA转录水平及蛋白表达，而pEGFP/HK对NP或PA基因无抑制作用，提示pEGFP/NP, pGenesil6.1/PA和pEGFP/NP+PA抑制目的基因的特异性. 更为重要的是，HA结果表明，在分别转染pEGFP/NP, pGenesil6.1/PA或pEGFP/NP+PA的MDCK细胞中，流感病毒的增殖受到了不同程度的抑制，以pEGFP/NP+PA的效果更佳. 本研究为进一步体内实验奠定了基础.【参考文献】1 Haria C, Dennis JA. Avian influenza and human health J. Acta Tropica, 2002,83:1-6.2 Webby RJ, Webster RG. Are we ready for pandemic influenza J? Science, 2003,302(5650):1519-1522.3 Horimoto T, Kawaoka Y. Pandemic threat posed by a