Rb基因和PCNA在前列腺癌中表达的意义及相关性分析.doc

Rb基因和PCNA在前列腺癌中表达的意义及相关性分析 作者：汤群辉杨力军王禾陈宝琦王鹏飞武国军 【关键词】 前列腺肿瘤 关键词: 前列腺肿瘤;增殖细胞核抗原;视网膜母细胞瘤基因;免疫组织化学 摘 要:目的 探讨视网膜母细胞瘤易感基因（Rb）和增殖细胞核抗原（PCNA）在前列腺癌中表达的意义及其相互关系. 方法 采用免疫组织化学SABC法对36例前列腺癌标本Rb基因和PCNA进行检测，并应用图像分析仪及统计学方法对两者在不同病理分级及临床分期中的表达进行对比及相关分析. 结果 36例前列腺癌标本中Rb表达阳性17例，阳性率47.2%，其表达在前列腺癌的不同病理分级及临床分期之间有显著差异（P<0.05）;PCNA在标本中的表达强度在不同病理分级及临床分期之间有显著差异（P<0.05）;同时还发现Rb表达与PCNA表达存在负相关，即Rb阳性标本中PC-NA表达弱而Rb阴性标本中PCNA表达强，两者比较有显著性差异（P<0.05）. 结论 Rb基因参与了前列腺癌的发生、发展过程，在发病机制中可能涉及到Rb和PCNA调节通路的异常，检测Rb基因和PCNA有助于前列腺癌恶性程度的判定及预后. Keywords:prostatic neoplasms;proliferating cell nuclear antigen;retinoblastoma genes;immunohis-tochemistry Abstract:AIM To discuss the expression and correlation of retinoblastoma susceptibility gene and proliferating cell nu-clear antigen in the prostatic cancer.METHODS SABCimmunohistochemistry was used to determinate Rb gene and PCNA in36samples of the prostatic cancer.The image pat-tern analyzer and the statistics methods were used to do the comparative analysis of Rb gene and PCNA in the different pathological grading and clinical phases of the prostatic cancer.RESULTS immunohistochemistry staining was Rb pos-itive in17of36samples，rated47.2%.The expression of Rb had significant differences in different pathological grading and clinical phases（P<0.05）.The expression of PCNA also had significant differences in different pathological grading and clinical phases（P<0.05）.The expression of PCNA was weak in the Rb positive expression samples and was strong in the Rb negative expression samples.There was a significant difference between Rb and PCNA expression（P<0.05）.CONCLUSION Rb is involved in the occurrence and devel-opment of the prostatic cancer.As for pathological mecha-nism，it is related to the abnormality of Rb and PCNA regu-lating path.The determination of Rb and PCNA can be an in-dex for estimating the level of malignant and progression of the prostatic cancer. 0 引言 前列腺癌是威胁人类生命的恶性肿瘤之一，自20世纪70年代以来我国前列腺癌的发病率明显升高，对前列腺癌的诊治已日益受到重视1 .Rb基因和PCNA在细胞周期及DNA复制的过程中起着重要的作用，我们采用免疫组织化学SABC法对前列腺癌标本Rb基因和PCNA进行检测，对两者在不同病理分级及临床分期中的表达进行了对比及相关分析. 1 材料和方法 1.1 材料 收集1982/1999年确诊为前列腺癌的石蜡包埋标本36例，患者年龄5884（平均72）岁.其中高分化腺癌13例，中分化腺癌9例，低分化腺癌14例;临床分期T1期13例，T2期9例，T3期8例，T4期6例.兔抗Rb（C-15）多克隆抗体（美国Santa Cruz Biotechnology Inc），鼠抗PCNA（PC-10）单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司），羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG（本校病理学教研室），SABC试剂盒（武汉博士德生物工程公司）.石蜡切片机（德国Leitz），双目显微镜（日本OLYMPUS BH-2型），MIAS-300图像分析仪（四川大学）. 1.2 方法 免疫组织化学法:按照SABC试剂盒步骤进行，用已知肝细胞癌阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗作空白对照，双盲法阅片.PCNA图像分析仪分析法:普通光源照明，显微镜放大400倍，将图像输入高分辨图像监视器上，在每张切片中央及四周每隔45度扇面取视野共9个，分析统计每个视野内PCNA阳性细胞数，剔除细胞数最多和最少的视野各2个，取余下5个视野的阳性细胞均值为该例标本的PCNA阳性表达细胞数均值.统计学处理:2 检验，t检验，Bartlett方差齐性检验. 2 结果 Rb蛋白主要定位于前列腺癌细胞核和核膜上，阳性显色为棕黄色，其高、中、低分化前列腺癌细胞的阳性表达率分别为69.2%（9/13），55.5%（5/9），21.4%（3/14）;T1，T2，T3和T4临床分期的阳性表达率分别为76.9%（10/13），44.4%（4/9），25.0%（2/8）和16.7%（1/6）.PCNA位于细胞核内，以染成棕黄色或棕褐色者为阳性，高、中、低分化前列腺癌细胞的PCNA表达均值分别为72.369，96.467，122.786;T1，T2，T3和T4临床分期的PCNA表达均值分别为68.523，96.289，111.675和146.200.Rb与PCNA在不同病理分级、临床分期的表达情况见（Tab1，2）. 表1 前列腺癌36例Rb，PCNA表达强度与病理分级之间的关系略 在将Rb与PCNA在前列腺癌中的表达作相互比较时，结果发现Rb与PCNA之间呈现负相关性，即17例Rb阳性表达标本中PCNA计数为83.74130.066，标准误7.292，变异系数35.90，最小值 39.600，最大值150.200;而19例Rb阴性表达标本中PCNA计数为110.75832.119，标准误7.369，变异系数29.00，最小值39.000，最大值166.600，明显高于Rb阳性表达标本的PCNA平均计数，两者比较显示有显著性差异（P<0.05），两者比较时的Bartlett方差齐性检验显示P=0.7891>0.05. 表2 前列腺癌36例Rb，PCNA表达强度与临床分期之间的关系略 3 讨论 3.1 Rb基因在前列腺癌中表达的意义 Rb基因是人类最早发现的一种抑癌基因，它位于染色体13q14，基因产物是110ku的具有DNA结合能力的核磷蛋白质，主要参与细胞周期的调节，对细胞生长起负调控作用，同时Rb基因可调控与细胞增殖有关的原癌基因的表达，如C-myc等2-4 .一旦Rb基因缺失或突变，细胞周期就会失去调控或某些原癌基因大量扩增从而导致肿瘤的发生5，6 . 我们应用抗Rb基因蛋白的多克隆抗体及免疫组织化学SABC法检测36例人前列腺癌标本中Rb基因表达产物的分布，结果发现阳性表达17例，阳性率为47.2%（17/36），且在肿瘤的不同病理分级中Rb基因蛋白的阳性表达率不同，肿瘤分化程度越低，则阳性表达越低，高分化肿瘤阳性表达率明显高于低分化肿瘤，统计表明有显著性差异（P<0.05）.本结果表明Rb基因可能与前列腺癌细胞的分化过程有关，在低分化前列腺癌中Rb基因的缺失和突变更为常见，由于Rb基因的缺失和突变使Rb基因不能表达或异常转录无功能的Rb蛋白，从而使抑制细胞周期由G1期向S期过渡的功能丧失，细胞增殖过程失控，使肿瘤细胞在人体内形成肿瘤的能力增强.本结果还表明Rb基因的表达与前列腺癌的临床分期有显著相关性（P<0.05），T3，T4期的阳性表达率较T1期低，提示Rb基因的异常伴随了前列腺癌的发生、发展，并与它的浸润及转移有关. 3.2 PCNA表达强度在前列腺癌中的意义 PCNA是一种3572ku的核蛋白，它是DNA聚合酶的一个辅助蛋白，并调节其活性，人类PCNA基因定位于第20对染色体上，它的合成和表达与细胞增殖有关，可以调节DNA的复制 7-10 .PCNA存在于核内，也是在核内合成，而不是从胞质进入核内的，免疫荧光技术和流式细胞定量技术均已证实，在静止期细胞中PCNA含量极少，在正常增殖细胞和转化细胞中，PCNA的含量在细胞周期G1期开始增加，S期早期达到高峰，G2期及M期时降低，由于这种与细胞增殖过程相一致的周期性变化，PCNA被认为在细胞增殖和DNA合成方面起主要的和根本的作用，目前已将它视为S期细胞的标志物，用于细胞增殖动力学研究11，12 .恶性肿瘤的特点是分化受阻而增殖无限.因此，PCNA正是研究肿瘤细胞动力学及评估某些肿瘤预后的较好指标13 .我们应用PCNA单克隆抗体（PC-10）检测前列腺癌标本，该抗体是一种能与常规福尔马林固定石蜡包埋组织起反应的单克隆抗体14 .实验结果显示阳性颗粒位于细胞核内，阳性细胞着色深浅不一，呈颗粒状或弥漫状，这是因为DNA的复制存在的起点多少不一引起，DNA复制起点愈多，PC-NA的量亦愈多，细胞着色相对就愈深，所以细胞核阳性表达强度可以反映出细胞DNA复制的活跃程度15 .一般而言，肿瘤分化越差，恶性程度越高，本结果统计分析显示，低分化的前列腺癌PCNA表达增多、增强，明显高于高分化者，有显著性差异（P<0.01），这反映出肿瘤的分化程度与增殖活性的一般规律.同时，本结果还提示PCNA表达强度在前列腺癌各临床分期亦有显著性差异（P<0.01），T3，T4期的前列腺癌PCNA阳性表达增强，而T1，T2期的前列腺癌PCNA阳性表达较弱，可见PCNA与前列腺癌的病程密切相关.另外，我们还观察到在部分前列腺癌旁正常组织中，PCNA表达弱而规律，而在前列腺癌细胞中PCNA表达明显增多且呈不同程度的异质性分布，表明癌细胞生长调节失控，DNA合成紊乱，同时也提示肿瘤增殖细胞群中并非所有细胞均同步增殖. 3.3 前列腺癌中Rb基因与PCNA表达的相互关系及意义 我们在前列腺癌组织切片上观测Rb和PCNA的表达状态及其相互关系，结果表明Rb与PCNA之间呈现负相关性，即Rb阳性表达标本的PCNA计数明显低于阴性表达标本，而Rb阴性表达标本的PCNA计数明显高于阳性表达标本，两者比 较有显著性差异（P<0.05）.PCNA是细胞DNA复制所必需的，Rb基因不能表达或异常表达，消除了细胞内某些抑制因素的作用，使细胞增殖处于失控状态，继而可产生肿瘤或使原有肿瘤的恶性程度增加而致PCNA表达增强5 .从Rb基因与PCNA的相互关系可以推论，Rb基因的缺失或异常将使前列腺细胞趋向于肿瘤，这在恶性程度高和侵袭力强的肿瘤细胞中表现得更加明显，随即而来的是PCNA的高表达. 肿瘤的生长调控很复杂，与多种癌基因、生长因子的内在相互关系有关，前列腺癌的分子发病机制中除了Rb基因与PCNA调节通路的异常外，可能还涉及到P16，P21和P53等基因调节通路的异常16-18 .目前，人们对抑癌基因在肿瘤治疗方面的应用前景寄于厚望，在用手术、化疗及放疗等治疗措施减轻了患者的肿瘤负荷后，抑癌基因疗法有望成为一种较好的辅助治疗手段.同时，作为一种检测方法，可作为临床医生判定前列腺癌发生和进展程度有价值的指标，对制定合理的治疗方案提供有意义的帮助. 参考文献: 1Gu FL.Epidemiological survey of benign protatic hyperplasia and protate cancer in China J.Beijing Yike Daxue Xuebao（J Beijing Med Univ），2000;32（1）:30-33. 2Friend SH，Bernards R，Rogelj S，Weinberg RA，Rapaport JM，Albert DM，Dryja TP.A human DNA segment with properties of the gene that predisposes to retinoblastoma and osteosarcoma J.Nature，1986;323（6089）:643-650. 3Fung YK，Murphree AL，TAng A，Qian J，Hinrichs SH，Benedict WF.Structural evidence for the authenticity of the hu-man retinoblastoma gene J.Science，1987;236（4807）:1657-1661. 4Lee WH，Shew JY，Hong FD，Sery TW，Donoso LA，Young LJ，Bookstein R，Lee EY.The retinoblastoma susceptibility gene encodes a nuclear phosphoprotein associated with DNA binding activity J.Nature，1987;329（6139）:642-645. 5Ishikawa J，Xu HJ，Hu SX，Yandell DW，Maeda S，Kamidono S，Benedict WF，Takahashi R.Inactivation of the retinoblas-toma 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