BTLA在T细胞上的表达和功能.doc

BTLA 在T细胞上的表达和功能 作者：王月颖,王雪峰, 张学光, 顾宗江【摘要】 目的: 研究BTLA（B and T lymphocyte attenuator）在T细胞上的表达和功能。方法: 分离纯化人外周血T细胞, 流式细胞术检测BTLA在不同T细胞亚群上的表达。进一步用CD3抗体分别和游离、 包被以及抗Fc段二抗交联的BTLA激发单克隆抗体（mAb）或HVEMFc融合蛋白共同刺激T细胞活化, MTT检测细胞增殖。结果: BTLA组成性表达于CD3+、 CD4+和CD8+T细胞表面。游离的BTLA mAb和HVEMFc融合蛋白均不能抑制CD3刺激的T细胞增殖, 然而包被和交联后的BTLA mAb和HVEMFc融合蛋白则能够明显抑制T细胞增殖。结论: BTLA的活化能显著抑制CD3抗体所活化的T细胞的增殖。 【关键词】 BTLA; 共刺激分子; 抑制; T细胞T细胞的活化依赖于双信号的共同刺激。T细胞受体（TCR）识别抗原提呈细胞（APC）上抗原肽MHC复合体, 启动了T细胞活化的第一信号; APC上共刺激分子与T细胞膜上相应受体结合则提供了T细胞活化的第二信号。第二信号既包括增强T细胞反应的正性信号, 也包括抑制T细胞反应的负性信号。CD28是促进T细胞初始活化的重要共刺激分子, 能够增进IL2的合成, 维持T细胞反应; 与之相反, CTLA4抑制T细胞活化, 然而, 它们都与表达在APC表面的B71和B72结合1。CD28家族另外一个刺激分子ICOS与B7h结合, 增强效应T细胞的反应2。PD1是继CTLA4之后发现的负性共刺激分子, 具有两个配体PDL1和 PDL23。BTLA（B and Tlymphocyte attenuator）是CD28家族新近发现的负性共刺激分子4。BTLA-/- T细胞对CD3mAb刺激的增殖较野生型T细胞更敏感5。与其他家族成员不同, BTLA的配体不属于B7家族成员, 而是肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族的HVEM6。值得一提的是, HVEM与TNF家族配体LIGHT结合能增强T细胞活化7, 然而, HVEM与BTLA结合却产生抑制T细胞的作用8, 因此HVEMBTLA是一对比较特殊的信号分子。1 材料和方法1.1 材料淋巴细胞分离液Ficoll(上海生化试剂二厂); 96孔细胞培养板（Costar公司）; RPMI1640培养基（Gibco公司）; 胎牛血清FCS（杭州四季青公司）; 激发型CD28 mAb和BTLA mAb 8H9均为本室自行研制; CD3激发型抗体（Beckman Coulter）; 人HVEMFc融合蛋白（R&D公司）; PE标记鼠抗人BTLA抗体（eBioscience）; FITC标记鼠抗人CD4和CD8抗体（eBioscience）; 羊抗鼠Fc段抗体和羊抗人Fc段抗体（crosslink 抗体, Bethyl公司）; 人T细胞阴性分选试剂盒（StemCell Technologies）。二氧化碳培养箱（Jouan公司）; 流式细胞仪（BeckmanCoulter公司）。1.2 方法1.2.1 外周血T细胞分离及纯化采集健康志愿者外周全血, 经Ficoll密度梯度离心获得外周血单个核细胞（PBMC）, 进一步按人T细胞阴性分选试剂盒说明书方法, 磁珠分离T细胞, 检测 T细胞纯度 96%。1.2.2 流式细胞检测BTLA在T细胞的表达分离纯化的T细胞用PBS洗涤后重悬于100L PBS中, 加入PE标记鼠抗人BTLA抗体、FITC标记鼠抗人CD4、CD8抗体, 4作用30 min, 洗涤后上流式细胞仪检测。1.2.3 T细胞的活化 用CD3抗体分别和不同浓度的8H9、人HVEMFc融合蛋白及对照IgG共同包被96孔板, 4过夜,用PBS洗涤; 或CD3抗体包被过夜后加入不同浓度的游离8H9、人HVEMFc融合蛋白及对照IgG。将分离纯化的T细胞密度调整为1109/L, 每孔加入100L。在抗体交联实验中, 96孔板CD3抗体包被过夜后, 加入不同浓度的游离8H9、人HVEMFc融合蛋白及对照IgG, 继而加入T细胞, 置于37、50 mL/LCO2培养箱中孵育1 h, 然后加入抗Fc段抗体, 37、50 mL/L CO2培养箱中继续培养。1.2.4 T细胞增殖检测刺激活化的T细胞培养3d, 于培养的最后4h加入20L MTT溶液（5g/L）继续培养, 吸取上清, 加入100L酸化异丙醇彻底溶解结晶, 用酶标仪A570波长比色。1.2.5 统计学分析数据用平均值xs表示。两组样本均数的比较采用t检验, 以P<0.05 为有统计学意义。2 结果2.1 BTLA在静止T细胞上的表达流式细胞术检测显示, BTLA组成性表达于静止T细胞上。大约84% CD3+T细胞上表达BTLA, CD4+T上的表达高于CD8+T, 表达量分别是87%和77%（图1）。2.2 BTLA mAb 8H9对T细胞增殖的影响BTLA的胞内区包含2个免疫受体酪氨酸抑制性基序(ITIM), 基序中的酪氨酸磷酸化后, 可以募集酪氨酸磷酸酶SHP1和SHP2, 发挥抑制作用4。我们用CD3抗体包板, 联合BTLA mAb 8H9共同刺激纯化T细胞。结果表明, 游离的8H9不能抑制T细胞的增殖。然而, 8H9与CD3抗体一起包板后, 和对照抗体相比, 明显产生抑制T细胞增殖的作用（P<0.05）, 并且抑制效果具有浓度依赖性（图2A）。以前的研究表明, mAb与微球相偶联, 可以在液相中发挥作用9。本实验在CD3和游离8H9刺激的T细胞中加入针对Fc的二抗, 对8H9 mAb进行交联, 结果表明8H9经过交联后, 能明显抑制T细胞的增殖（P<0.05）, 并且与包板的8H9相似, 随着浓度的增加, 抑制作用更明显（图2B）。2.3 HVEMBTLA通路抑制T细胞增殖表达在T细胞上的HVEM与其配体LIGHT结合, 可以促进T细胞的活化, 而与BTLA结合, 则通过后者传递抑制信号。实验中利用HVEMFc融合蛋白来研究HVEMBTLA这对信号分子对T细胞的影响。与8H9相同, 包被固定的HVEMFc可产生抑制作用, 而游离的HVEMFc不能抑制CD3活化的T细胞增殖（图3A）。当用抗Fc抗体将HVEMFc融合蛋白交联后, 亦能明显抑制T细胞增殖（P<0.05, 图3B）, 并且HVEMFc融合蛋白在CD3抗体小于0.5 mg/L时抑制效果最好（P<0.05, 图3C）。3 讨论 BTLA是CD28家族发现的第3个抑制性共刺激分子。与CTLA4和PD1相似, BTLA分子的酪氨酸经诱导磷酸化后, 可以招募SHP1和SHP2, 产生抑制信号, 阻碍T细胞的活化4。我们的研究表明, BTLA组成性高表达于初始T细胞表面。与此不同, CTLA4和PD1仅诱导表达于活化T细胞表面1, 由此推测这些分子可能在T细胞免疫应答的不同阶段发挥作用。 共刺激分子在免疫应答的各个阶段都起着非常重要的作用。以往利用共刺激分子配体的Fc融合蛋白进行研究时, 需将Fc融合蛋白包被固定在培养板上, 才能发挥作用。当Fc融合蛋白未固定, 而在液体中处于游离状态时, 就无法对共刺激分子发挥作用7。在利用针对共刺激分子的mAb进行研究时, 也会遇到相同的问题, 即大部分mAb需要包被固定在板上, 才起作用。如果mAb游离在液体中, 就起不到有效的作用。这为研究共刺激分子在免疫应答各个阶段的不同时相的作用, 带来许多困难和不便。还有研究发现将mAb与微球通过化学方法偶联在一起, mAb就可以在液相中发挥作用9。但mAb与微球的偶联则带来了操作上的繁琐与不便。在本实验中, 我们针对在液相中处于游离状态的mAb或Fc融合蛋白, 加入抗Fc段的抗体, 将mAb或Fc融合蛋白上的Fc段进行交联（crosslinking）, 起到了加强mAb或Fc融合蛋白的作用, 使其在液相游离状态下, 亦能起到有效的作用。此方法简便易行, 容易控制。由于BTLA与其他两个负性共刺激分子CTLA4和PD1的表达时相有所不同, 因此, 在采用上述交联方法后, 我们对BTLA在免疫应答不同时相的作用, 分别进行了研究, 取得了有意义的结果, 将另文发表。【参考文献】 1Coyle AJ, GutierrezRamos JC. The expanding B7 superfamily: increasing complexity in costimulatory signals regulating T cell functionJ. Nat Immunol, 2001, 2(3): 203-209.2Tafuri A, Shahinian A, Bladt F, et al. ICOS is essential for effective Thelpercell responsesJ. Nature, 2001, 409(6816): 105-109.3Latchman Y, Wood CR,Chernova T, et al. PDL2 is a second ligand for PD1 and inhibits T cell activationJ. Nat Immunol, 2001, 2(3): 261-268.4Watanabe N, Gavrieli M, Sedy JR, et al. BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA4 and PD1J. Nat Immunol, 2003, 4(7): 670-679.5Krieg C, Boyman O, Fu YX, et al. B and T lymphocyte attenuator regulates CD8+ T cellintrinsic homeostasis and memory cell generationJ. Nat Immunol, 2007, 8(2): 162-171.6Sedy JR, Gavrieli M, Potter KG, et al. B and T lymphocyte attenuator regulates T cell activation through interaction with herpesvirus entry mediatorJ. Nat Immunol, 2005, 6(1): 90-98.7Tamada K, Shimozaki K, Chapoval AI, et al. LIGHT, a TNFlike molecule, costimulates T cell proliferation and is required for dendritic cellmediated allogeneic T cell responseJ. J Immunol, 2000, 164(8): 4105-4110.8Tao R, Wang LQ, Murphy KM, et al. Regulatory T cell expression of herpesvirus entry mediator suppresses the function of B and T lymphocyte attenuatorpositive