栅藻细胞培养及脂肪体诱导和观察.ppt

栅藻细胞培养及脂肪体诱导和观察,藻类是一类没有真正的根、茎、叶分化的低等植物，具有叶绿体，进行光合自养作用，分布于陆地、水体甚至漂浮于大气中。在自然界中以单细胞、群体、丝状体、异丝体（藻丝由直立枝和匍匐枝组成）、多核体、假薄壁组织状和薄壁组织状形式存在，体型大小各异，从几微米到数十米。藻类的营养需求相对简单，只需提供必要的水分、空气、光照和必需的无机盐即可。微型藻类（microalgae）由于个体微小，其和外界环境间的物质交换效率非常高，能快速吸收营养，高效利用光能，具有生长速度快、光合效率高的特征。很多藻类营养丰富，是理想的食品和保健品的来源，具有较高的开发和利用价值。目前商业化大规模培养的微型藻类主要有螺旋藻、杜氏藻、小球藻、雨生红球藻等。螺旋藻藻粉和小球藻藻粉常作为功能保健食品使用，而杜氏藻和雨生红球藻则分别用来生产类胡萝卜素和虾青素，二者作为色素和抗氧化剂使用。很多微型藻类是鱼、虾、蟹和贝类的天然开口饵料，在水产育种和养殖中也很重要。另外，藻类在环境监测和废水处理中也愈来愈显示出重要作用。,目前，由于化石燃料日渐减少和不可再生性，寻找和开发绿色环保的可再生生物能源日益引起人们重视。藻类由于具有光合效率高、生长快、单位面积产量高、含油量高和培养简单的特点，符合目前发展生物能源所提倡的“不与人争粮，不与粮争地”的方针，是开发生物能源的理想材料。藻类中的硅藻、黄藻、金藻和隐藻的同化产物主要是油脂，虽然其他藻类的主要储藏物是淀粉，但经适当诱导后，可转化为油脂，特别是中性脂，可用来生产生物柴油。如绿藻中的某些种类经诱导后，总脂含量可达干重的70%，而用于生产生物柴油的中性脂含量可高达60%以上。,脂肪是生物体内储存和供给能量的重要物质，根据其性质可分为中性脂肪、脂肪酸、胆固醇、磷脂等。脂肪不溶于水，易溶于浓酒精、苯、氯仿和乙醚等。因此在制作脂类标本时，多用甲醛类固定剂，用冰冻切片或铺片法替代石蜡切片，避免破坏脂类。苏丹染料（苏丹、苏丹或苏丹黑等）是一种脂溶性染料，易溶于酒精但更易溶于脂肪，所以当苏丹染料与含有脂肪的标本接触时，其即脱离酒精而溶于含脂肪的结构中，将其染色。是显示脂肪的常用染料，但是在使用时要注意选择合适的溶剂，要求既能溶解苏丹染料，又不破坏脂肪。常用Sudan III的70%酒精饱和液或丙酮和70%酒精等量饱和液将脂肪染为橙黄色。尼罗红（nile red）是一种亲脂性的荧光染料，能与脂类物质，包括蜡脂、三酰甘油和游离脂肪酸结合，在543nm(绿色)激发光下被激发出598nm的桔红色荧光，在450-500nm（蓝青光）激发光下，则显示为波长大于528 nm的金黄色荧光。,本实验将培养的绿藻在高光胁迫和氮素营养缺乏的条件下诱导藻细胞中的储藏物质由淀粉向脂肪的转变，在此过程中脂肪体由少变多，由小变大，最后形成大的脂肪体（lipid body）分布在细胞中。分别利用苏丹III和尼罗红染色后，在普通光学显微镜和荧光显微镜下进行观察。在此过程中藻细胞的形态和生化组成发生明显变化。,目的要求,了解藻类培养的基本过程和方法。 掌握细胞内脂类染色和淀粉染色的方法。 了解荧光显微镜的构造并掌握其使用方法。,实验用品,1器具：培养管、三角瓶、酒精灯、1和10 ml移液管、带塞试管、量筒、大试管架（放大培养管用）、吸耳球、载玻片、盖玻片、吸管、通气管、通气泵、CO2、1 ml Eppendorf 管。 2材料：二形栅藻（Scenedesmus dimorphus）或小球藻（Chlorella sp.）,BG11 培养基 配制,储备液1： Mg Na2 EDTA 0.1g/l 柠檬酸铁铵 0.6g/l 柠檬酸 0.6g/l CaCl22H2O 3.6g/l 储备液2： MgSO47H2O 7.5g/l 储备液3： K2HPO43H2O 4.0g/l 储备液4： NaCO3 2.0 g/l 储备液5： (微量元素) H3BO3 2.86g/L MnCl24H2O 1.81g/l ZnSO47H2O 0.222g/l CuSO45H2O 0.079g/l COCl26H2O 0.050g/l NaMoO42H2O 0.391g/l 使用时取10 ml储备液1、2、3和4、1.5g NaNO3和1 ml储备液5分别入到蒸馏水中，定容至1L。配制固体培养基时，在配好的培养基中按1.5%的比例加入琼脂，加热溶解后，灭菌备用。,内容与方法,1 藻类细胞的活化和培养 将保存在固体培养基上的藻种用接种针或接种产刮下少许，放到盛有灭菌后BG11培养基的三角瓶中先进行活化培养，当藻细胞生长到密度较大时，即整个藻液呈浓绿色时，按1:6的比例转入到通气管中进行通气培养，为了使藻类生长地更快，可适当通入CO2和增加光强。待藻生长到接近平台期时，即可作为藻种使用，取藻种按1:10的比例分别接种到含0.75,0.375,0.188和0.09 g NaNO3/L的BG11培养基进行通气和非通气培养一周。,2藻类细胞形态观察 一周后观察生长的栅藻可以发现在氮源充足条件下培养的藻液呈深绿色，取少量藻样滴在载玻片上，盖上盖玻片观察，可以看到由栅藻多以2、4、8个细胞组成的群体存在。群体中细胞并列于一条直线上，中间细胞呈纺锤形或近纺锤形，上下两端渐尖，直立；两侧细胞则成镰刀形或新月形，极少垂直，上下两端也逐渐变尖。细胞内可见周生叶绿体和圆形的蛋白核。不经尼罗红染色的样品在荧光显微镜下，则可以看到叶绿体中的叶绿素发出的火红色荧光。经尼罗红染色的样品中少见或不见金黄色的脂肪体。 而经高光和低氮胁迫的藻液则变成黄绿色，其中栅藻多以单个细胞存在，鲜见形成群体。细胞中部膨起，长宽比下降，呈丰满的椭球形，细胞两侧的尖端变钝。细胞中可见反光较强的区域，此为脂肪体。经苏丹染色的藻细胞中可见橘黄色的脂肪体。在荧光显微镜下观察不经任何染色的样品可看到火红色的荧光减少；经尼罗红染色后，可见大的金黄色的脂肪体出现以及周围较小的分散存在的红色叶绿体。,尼罗红染色,苏丹III染色,3 苏丹染色 取0.25ml藻样加到1ml Eppendorf 管中，加0.25ml 1M HCl,充分混合后，再加入0.25ml苏丹溶液，摇匀，放入70水浴中30 min，取少量染色后的藻样滴到载玻片上，加盖玻片后在普通显微镜下观察。可见脂肪被苏丹红染为橘黄色。 4 尼罗红染色 取0.25ml藻样加到1ml Eppendorf 管中，加等量体积尼罗红染液充分混合，70水浴30 mi