应用鼠疫菌全基因组芯片研究黄连抑菌机制的方法.ppt

应用鼠疫菌全基因组芯片 研究 黄连抑菌机制的方法,国内外研究现状：,李书宝.中国鼠疫监测现状及疫情态势分析 俞东征.我国鼠疫形势与鼠疫控制策略 沈尔礼, 张苇, 高崇华,等. 关于美国、秘鲁鼠疫防治工作的考察报告J. HoltRD,DobsonAP,BegonM,etal.Parasiteestablishmentinhost communitiesJ.EcologyLetters,2003,6 (9) :8372842. PowerAG,MitchellCE.PathogenspilloverindiseaseepidemicsJ. AmericanNaturalist,2004,164Suppl:S79288.,目的:建立一种应用鼠疫耶尔森菌全基因组芯片研 究黄连对鼠疫耶尔森菌抑制作用分子机制的方法。 方法:应用液体稀释法测定黄连对鼠疫耶尔森菌的最小抑菌浓度( MI C)；鼠疫耶尔森菌全基因组芯片包含 4005条鼠疫耶尔森菌基因。基因芯片表达谱实验中黄连作用鼠疫耶尔森菌的浓度为10MI C，作用时间为30min； 提取并 纯化鼠疫耶尔森菌总RNA；逆转录合成 cDNA；Cy3、Cy5染料标记后，与鼠疫耶尔森菌全基因组芯片杂交；通过芯片扫描仪获得表达谱分析结果。应用 S AM软件处理结果，应用SAM软件处理结果。,结论：应用鼠疫耶尔森菌全基因组 DNA芯片可以进行黄连抑制鼠疫耶尔森菌的分子作用机制研究,立项依据： 鼠疫耶尔森菌(以下简称鼠疫菌)可以引起烈性传染病一鼠疫鼠疫，菌对常规的抗生素敏感，链霉素、氯霉素及四环素是鼠疫菌治疗的首选药物。抗生素的有效使用很好地控制了鼠疫的发生、流行以及蔓延。链霉素耐药株的出现使得鼠疫菌治疗药物研究变得尤为迫切。不断探索新的治疗药物是摆在每一位鼠疫防治工作者面前的光荣使命。前期的研究结果表明，在传统中药中黄连对鼠疫菌有较强的抑菌作用。为了继续深入探讨黄连抑制鼠疫菌的作用机制，探索黄连应用于鼠疫预防与治疗的可能性，通过应用鼠疫菌全基因组芯片建立研究黄连抑制鼠疫菌分子机制的方法。,哈尔滨1910年特大鼠疫,1、材料与方法 1 、1 实验材料 鼠疫菌201菌株为布氏田鼠疫源地菌株，该菌株对人体 无感染性，对小鼠具有高度毒力；分离自锡林郭勒高原布氏田鼠鼠疫疫源地 ( 军事医学科学院微生物流行病研究所提供) 。 鼠疫菌全基因组基因芯片；由军事医学科学院微生物流行病研究所提供； 扫描仪；为Scan Array 4100(Axon Instruments，Inc ) 处理软件；为GenePix Pro41(Axon Instruments，Inc。) 黄连提取物 ：购自西安中鑫生物技术有限公司。,1 2 黄连作用鼠疫菌最小抑菌浓度(MIC)的测定黄连作用于鼠疫菌 的 MI C测定采用液体稀释法进行。准备系列含有1ml TMH液体培养基的试管，将黄连配制成相应浓度后加入含有培养基的试管中，以2倍比稀释法逐管稀释黄连，最终各管黄连的浓度分别为 01、0 05、0025、00125、000625gml ,在每个试管中加入15X108CFUml的细菌10ul ,试验设空白及重复对照,28培养 24h后，分别转种普通琼脂平板培养基，观察细菌在平板培养基的生长现象 ，无细菌生长的试管浓度为黄连作用鼠疫菌的 MIC。,1 3 鼠疫菌基因芯片表达谱实验 1 3 1 实验分组 选择黄连作用鼠疫菌组作为试验组，等量生理盐水相同条件作为对照组，进行基因芯片表达谱试验。黄连作用 鼠疫菌的作用浓度为10MIC。作用时间为 3 0min。实验分组应用系列重复设置，包括2个生物重复，以及2个技术重复。对不同分组采用不同荧光素交换标记。,132 鼠疫菌RNA提取应用细菌RNA保护剂(QiagenInc)分别对实验组与对照组细菌进行保护，保证细菌mRNA停留在进行保护的时刻。分别应用MasterPureTM RNA提取试剂盒(EpicentreInc)进行实验组与对照组鼠疫菌的总RNA提取，提取RNA后通过分光光度计与凝胶电泳鉴定提取RNA的质与量。,1 3 3 探针标记 采用Find GDPs软件针对芯片上所有基因(4005个)为靶标设计全基因组特异引物(GDPs)，同时应用N6随机引物，将二者等量混合用 于总RNA的逆转录。将获得的 cDNA 用QIAquick PCR Purification Kit(QiagenInc)试剂盒纯化，氨基标记cDNA的荧光素标记，应用Cy3与Cy5分别标记实验组与对照组的cDNA，标记完成后应用QIAquick PCR纯化试剂盒(QiagenInc)进行纯化。,134 芯片杂交与扫描杂交探针分别置于95 变性5min，然后立即将探针加在芯片上，盖玻片封片置于杂交炉内42杂交16h。然后依次以2SSC+ O 2SDS溶液、 01SSC+02SDS溶液及01 SSC溶液各洗涤2min，电吹风吹干。用Scan Array 4100扫描仪扫描芯片。,13 5 结果分析 利用 GenePi x Pro4 1软件对扫描的荧光信号进行处理，首先确定样点信号和背景噪音，计算各个样点扣除背景后的荧光信号值。剔除双通道荧光信号中值小于2倍背景值的数据，再采用整体归一法对双色荧光数据进行归一化处理。应用SAM软件对获得数据进行分析。,结果： 21 黄连作用鼠疫菌MIC的检测黄连作用于鼠疫菌的最小抑菌浓度MIC为0 025ml，对鼠疫森菌有较强的抑菌作用 。 22 芯片杂交 芯片杂交后，启动激光共聚焦扫描仪Genepix4100A的扫描程序，分别用波长6 3 5nm和 5 3 2nm进行双通道扫描，读取荧光信号后将图保存。数据通过SAM 软件分析，共获得黄连作用鼠疫 菌差异基因360个，其中上调333个，下调27个。,讨论 由于中药的特殊性，细菌很少对中药产生耐药。而且中药还具有来源广泛，费用低廉等优势。因此，研究和开发抗菌中药对解决耐药菌株的产生与抗生素短缺问题具有重要的现实与社会意义。黄连是一味具有广泛药效作用的传统 中药，经常在临床上被用于降热镇痛、抗肠道细菌感染。黄连的抗菌谱广，很多细菌对其敏感。,如 肺炎双球菌、白喉杆菌、金黄色葡萄球菌等革兰阳性菌；大肠杆菌、伤寒杆菌、 霍乱弧菌、淋球菌等革兰阴性菌；以及白色念珠菌、红色毛癣菌等真菌。黄连的分布地区较广，栽培简便，资源丰富。因此，对黄连进行深入研究，扩大其药效作 用，将有很大的社会效益和广泛的开发前景。基因芯片技术的发展为进行黄连的分子药理学分析提供了一个有力的平台。基因芯片是伴随着人类基 因组计划发展起来的一 项高通量筛选技术，具有大规模、高通量和高平行等特点，利用基因芯片可以进行疾病相关基因筛选、新基因功能研究、药物 作用机制研究及药物靶点的筛选等。,通过对研究获得数据进行生物信息学分析，可以对黄连抑制鼠疫菌的分子机制进行阐述，从而有望阐明黄连抑菌的分子作用机理。,参考文献,吴整军，中医药抗感染治疗的探讨J中华医院感染学 杂志，2004，14(11)；12961297,Shaw KJ，Miller N，Liu X，eta1 Comparison of the chan gesin global gene expres