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文档简介
鉴定类实验,还原性糖、脂肪、蛋白质、淀粉的鉴定,一、实验目的: 尝试用化学试剂检测生物组织中糖类、脂肪和蛋白质,思考1阅读课本P18,完成下列表格:,思考2试以葡萄糖为例写出相应方程式: 葡萄糖+ Cu ( OH ) 2 葡萄糖酸 + Cu 2O(砖红色)+ H 2O 思考3蛋白质检测的反应机制是什么? 蛋白质的肽键在碱性溶液中能与Cu2+结合成紫色的化合物。颜色深浅与蛋白质白质浓度成正比。,斐林试剂,砖红色沉淀,碘,蓝色,双缩脲试剂,紫色,苏丹染液/苏丹染液,橘黄色/红色,二、实验原理,三实验材料 思考4做可溶性还原性糖鉴定实验应选择什么样的实验材料?为什么? 思考5做脂肪的鉴定实验应选择什么样的实验材料? 思考6做蛋白质的鉴定实验应选择什么样的实验材料?,选用含糖较高,而且组织的颜色较浅,或近于白色的,如苹果、梨。避免干扰或影响实验结果的正常颜色。,应选富含脂肪的种子,以花生种子为最好,实验前一般要浸泡34小时(也可用蓖麻种子)。,可用富含蛋白质的黄豆或鸡蛋清。,四、实验试剂 斐林试剂(包括甲液:质量浓度为0.1g/ mL NaOH溶液和乙液:质量浓度为0.05g/ mL CuSO4溶液)、苏丹或苏丹染液、双缩脲试剂(包括A液:质量浓度为0.1g/ mL NaOH溶液和B液:质量浓度为0.01g/ mL CuSO4溶液)、体积分数为50%的酒精液,碘液、蒸馏水。,思考7斐林试剂与双缩脲试剂相同吗?为什么?,不同;虽然它们的成份都是NaOH溶液和CuSO4溶液配制而成,但它们的溶液浓度不同,使用的原理不同(斐林试剂实质是新配制的Cu ( OH ) 2与还原性糖发生反应,而双缩脲试剂实质是在碱性环境下的Cu2+与肽键发生反应),使用的方法也不同。,思考8上述的酒精溶液起作用?,洗去浮色,五、方法步骤: 1、还原糖检测和观察的操作方法: 制备组织样液(去皮、切块、研磨、过滤)取1支试管,向试管内注入2mL组织样液向试管内注入1mL新制的斐林试剂,振荡试管放在盛有50-650C温水的大烧杯中,加热约2分钟,观察到溶液颜色。,思考9为什么苹果或梨组织液必须临时制备? 思考10实验中应将组成斐林试剂的甲液、乙液分别配制、储存,使用前才将甲、乙液等量混匀成斐林试剂,为什么?,因苹果多酚氧化酶含量高,组织液很易被氧化成褐色,将产生的颜色掩盖。,斐林试剂很不稳定,甲、乙液混合保存时,生成的Cu ( OH ) 2在70900C下分解成黑色CuO和水;,思考11实验中能否将甲液、乙液分别加入苹果组织样液中进行检测?为什么? 思考12还原糖溶液检测过程中出现的颜色变化过程是怎样的?,不能;因为甲、乙液分别加入时可能会与组织样液发生反应,无Cu ( OH ) 2生成,影响实验结果。,浅蓝色 棕色 砖红色(沉淀),2、脂肪检测和观察的操作方法: 方法一:向待测组织液中滴加3滴苏丹染液,观察样液被染色的情况; 方法二:取材切片制片观察 思考13为什么切片要尽可能薄些? 思考14制片过程中为什么要洗去浮色? 思考15制片过程中为什么要用吸水纸吸去花生子叶周围的酒精? 思考16制片过程中为什么在盖上盖玻片前要滴加蒸馏水?,切片要尽可能薄些,便于观察。,不洗去浮色,会影响对橘黄色脂肪滴的观察。,酒精是脂溶性溶剂,可将花生细胞中的脂肪颗粒溶解成油滴。,滴上蒸馏水可防止盖盖玻片时产生气泡。,3、蛋白质检测和观察的操作方法: 制备组织样液(浸泡、去皮研磨、过滤)加样液约2ml于试管中加入双缩脲试剂A,摇匀再加入双缩脲试剂B液34滴,摇匀观察颜色变化。,思考17检测时为什么要先加双缩脲试剂A液后加B液,而不能同时加入?,先加NaOH溶液,为Cu2+与蛋白质反应提供一个碱性的环境。A、B液同时加入,会导致Cu2+变成Cu ( OH ) 2沉淀,而失效。,思考18检测时向试管内加双缩脲试剂B液4滴,为什么CuSO4溶液不能多加?,因为多加CuSO4溶液,Cu ( OH ) 2的蓝色会遮盖反应的真实颜色。,4、淀粉检测和观察的操作方法: 用试管取2ml待测组织样液 向试管内滴加2滴碘液 观察颜色变化。 注意:碘液不要滴太多,以免影响颜色观察。,六、应用: 例题1:安徽阜阳劣质奶粉事件曝光后,有关部门对收缴的劣质奶粉进行了化验,发现不法商人为了降低成本,在其中添加了大量糖类物质,让婴儿喜欢吃却无法得到足够的蛋白质营养。请回答: (1) 长期以劣质奶粉为主食的婴儿会成为“大头娃娃”,这是由于缺乏蛋白质导致血浆渗透压下降,血浆中的大量水分进入 造成的。 (2) 有些劣质奶粉中含有大量还原糖,如果用斐林试剂鉴定,则该试剂与待测样液在试管中混合均匀后,还必须经过 处理;预计试管内混合液的颜色变化是 。 (3) 如果用双缩脲试剂鉴定劣质奶粉是否含有蛋白质,那么,将待测样液注入试管之后,注入试剂的顺序应该是 。 (4) 如果劣质奶粉含有大量脂肪,则用苏丹染液鉴定时,预计染液与待测样液混合后的颜色是 。,织液(或组织间组隙),将试管放进盛有热水的烧杯中加热煮沸(12min); 由蓝色变为砖红色,由蓝色变为砖红色,先注入双缩脲试剂A(或01gmLNaOH溶液),再注入双缩脲试剂B(或001gmLCuS04溶液),例题2:胰高血糖素对小白鼠和人具有相同的生理作用。为了验证“胰高血糖素具有升高血糖的生理作用”,请以小鼠为实验对象设计实验步骤,预测和解释实验应出现的结果,并写出实验结论。 (一)实验材料和用具: 正常实验小白鼠只,生理盐水,用生理盐水配制的适宜浓度的胰高血糖素溶液,斐林试剂,注射器,试管等。 (二)实验步骤: (实验提示:采用腹腔注射给药,给药剂量不作实验设计要求;给药小时后,用注射器在小鼠膀胱处穿刺取尿液。),(1)确定一只鼠为实验鼠,腹腔注射胰高血糖素溶液;另一只鼠为对照鼠,腹腔注射等量生理盐水 。 (2)将两支试管分别编号为1号和2号,各加入等量的斐林试剂 。 (3)给药1小时后,对两只小白鼠采尿液,实验鼠尿液放入1号试管内,对照鼠尿液放入2号试管内 。 (4)将两支试管摇匀后,放入盛有开水的烧杯内加热煮沸,观察两支试管溶液颜色的变化。,(三)实验结果的预测、解释和结论:,1号试管中应该出现砖红沉淀,说明实验鼠尿液中有葡萄糖;2号试管中仍为蓝色溶液,表明对照鼠尿液中无葡萄糖。实验结论:实验鼠血糖升高,超过一定数值而出现糖尿,是胰高血糖素具有升高血糖的生理作用所引起的。,叶绿体色素的提取和分离(必修一P97一 一实验目的: 思考题 1尝试用 方法提取叶绿体中的色素和用 法分离提取到的色素。 2分析实验结果,探究叶绿体中有几种色素,以及各自所呈现的颜色。 二实验原理: 1叶绿体中的色素是有机物,不溶于水,易溶于丙酮等有机溶剂中,所以用丙酮、乙醇等能提取色素。 2叶绿体色素在层析液中的溶解度不同,溶解度 随层析液在滤纸上扩散得快,溶解度 随层析液在滤纸上扩散得慢。),过滤,纸层析,高的,低的,三、实验材料:幼嫩、鲜绿的菠菜叶 四、实验步骤: 1提取色素:5克绿叶剪碎,放入研钵,加少量SiO2、CaCO3和无水乙醇,迅速、充分研磨。 加SiO2、加CaCO3的目的是什么?,加SiO2为了研磨得更充分;加CaCO3防止研磨时叶绿素受到破坏。,2收集滤液:漏斗基部放一单层尼龙布,研磨倒入漏斗内挤压,将滤液收集到小试管中,用棉花塞塞住试管口。 3制备滤纸条:将干燥的滤纸,顺着纸纹剪成长10cm,宽1cm的纸条,一端剪去二个角,并在距这一端1cm处划一铅笔线。,将干燥的滤纸的一端剪去二个角的目的是什么? 。 4画滤液细线:用毛细吸管吸取少量滤液,沿铅笔线划出细、齐、直的一条滤液细线,干后重复三次。 思考题为什么滤液细线越细、越齐越好? 为什么画滤液细线需要重复三次?,可使层析液同时到达滤液细线,层析时,色素分离效果好,为了防止色素带之间部分重叠。,为了增加色素在滤纸上的附着量,实验结果更明显。,5分离绿叶中的色素 将3mL层析液倒入烧杯中,将滤纸条(划线一端朝下)插入层析液中,用培养皿盖盖上烧杯。注意:层析液不能没及滤纸条的滤液细线,烧杯要盖培养皿盖。 为什么烧杯要盖培养皿盖? 6观察实验结果 请在右图中标示出相应的色素及其颜色: 提取和分离叶绿体色素的关键是什么?,层析液中的苯、丙酮、石油醚易挥发,提取叶绿体色素的关键是:叶片要新鲜、浓绿;研磨要迅速、充分;滤液收集后,要及时用棉塞将试管口塞紧。分离叶绿体色素的关键是:一是滤液细线要细且直,而且要重复划几次;二是层析液不能没及滤液线。,DNA的粗提取与鉴定(选修IP54) 一、实验目的:初步掌握DNA的粗提取和鉴定的方法。 二、实验原理: 1DNA的溶解性: 思考题1:DNA在氯化钠溶液中的溶解度有什么特点?对此有什么应用? 思考题2:利用什么原理来将DNA与蛋白质分离开?,DNA在氯化钠溶液中的溶解度,随着氯化钠的浓度的变化而改变的。当氯化钠的物质的量浓度为014mol/L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理,可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出;,DNA不溶于酒精,但细胞中的某些蛋白质则溶于酒精,利用这一原理,可以将DNA与蛋白质进一步地分离。,2DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性:蛋白酶能水解蛋白质,但对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受6080的高温,而DNA在80以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜,但对DNA没有影响。 3细胞在蒸馏水中易吸水而导致细胞膜和细胞核膜的破裂,据此可得到含有核DNA的溶液。 4DNA的鉴定: 思考题3:依据什么原理来鉴定DNA?,DNA遇二苯胺(沸水浴)被染成蓝色,所以可用二苯胺作鉴定。,三、实验材料:鸡血细胞液 思考题4:生活在牧区的人们,采集牛、羊和马血比较方便,他们能否选用牛、羊、马血做实验材料?为什么?,不能。因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核,仅靠白细胞和淋巴细胞中的少数DNA,在实验中很难提取到。,四、实验步骤: 1制备鸡血细胞液:在鸡血中加入质量浓度为01g/mL的柠檬酸钠溶液,离心处理; 2提取鸡血细胞的细胞核物质:向鸡血细胞液中加入蒸馏水,搅拌、过滤; 思考题5:加入蒸馏水的目的是什么?为什么能达到此目的? 3溶解细胞核内的DNA:加入2mol/L的氯化钠溶液,搅拌,使DNA呈溶解状态; 4析出含DNA的黏稠物:加入蒸馏水,用玻璃棒搅拌; 思考题6:此时加入蒸馏水的目的是什么?,加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂),从而释放出DNA;蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体,水分可以大量进入血细胞内,使血细胞胀裂。,使氯化钠溶液浓度接近014mol/L,使DNA最大限度地析出。,5滤取含DNA的黏稠物:过滤; 思考题7:这次过滤与上次过滤的目的一样吗?为什么? 6将DNA的黏稠物再溶解:加入2mol/L的氯化钠溶液,搅拌,使DNA呈溶解状态; 7过滤含有DNA的氯化钠溶液:过滤; 思考题8:这一步骤的目的是什么? 思考题9:为什么反复地溶解与析出DNA,能够去除杂质?,不一样;这次过滤是为了去除不溶于氯化钠溶液的杂质,而上次过滤是为了去除破裂的细胞膜等物质。,除去含有DNA滤液中的杂质;,用高盐浓度的溶液溶解DNA,能除去在高盐中不能溶解的杂质;用低盐浓度使DNA析出,能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此,通过反复溶解与析出DNA,就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。,8提取含杂质较少的DNA:加入冷却的95%的酒精,搅拌; 思考题10:这一步骤的目的是什么? 思考题11:为什么加入的酒精需要冷却的? 9DNA的鉴定:取两支试管,各加入0015mol/L的氯化钠溶液5mL,一支加入提取的DNA,两支各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后置于沸水中加热。 思考题12:为什么要设置对照组?实验中能观察到什么现象?,去除溶于酒精的杂质;,可抑制核酸水解酶的活性,防止降解DNA;降低分子的运动,易于形成沉淀析出;低温有利于增加DNA分子柔韧性,减少断裂。
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