红细胞免疫检测及临床应用研究新进展.ppt

红细胞免疫检测及临床应用新进展,天马行空官方博客：/tmxk_docin ；QQ:1318241189；QQ群：175569632,一、红细胞免疫基本理论,天马行空官方博客：/tmxk_docin ；QQ:1318241189；QQ群：175569632,（一）概述,血液与免疫有密切联系。 本世纪初，Landsteiner采用免疫学方法在人类红细胞与血液混合试验中发现了人类ABO血型系统。认识到红细胞表面存在许多能与血清中相应抗体凝集的抗原，如Mn，P型、Rn、Lutheran、Lewis、Kell、Duffy、Kidd等。除了目前所知数十种血型抗原外，红细胞还含有不少其它抗原，这些抗原在异常情况下，可引起对自身红细胞免疫应答产生抗体而导致红细胞系统疾病，如输血反应、新生儿溶血症、自身免疫溶血性贫血，药物过敏性红细胞溶血等。,由于红细胞免疫粘附理论的发现以及红细胞免疫功能研究的逐渐深入，1981年美国生殖免疫学家Siegel提出“红细胞免疫系统”的概念，指出RBC是不可忽视的免疫细胞，也象白细胞一样具有重要的免疫功能，是完整机体免疫系统中的一个子系统，是不可缺少的一个重要组成部分。这一理论提出刷新了人们对RBC的认识只停留在CO2、O2呼吸载体的概念上，开拓了免疫学的新领域。,天马行空官方博客：/tmxk_docin ；QQ:1318241189；QQ群：175569632,我国在红细胞免疫研究工作始于1982年。 1989年成立全国红细胞免疫研究协作组。 1993年12月又成立了全国免疫学会基础免疫委员会红细胞免疫专业学组。,（二）红细胞免疫发展史,20世纪30年代，杜克（LH. Duke）首先发现锥虫在抗血清及补体存在时，可粘附于人类RBC上。 Brown和Broom：不同人的RBC对锥虫的粘附能力高低不同。Brown本人的RBC对抗体调整过的锥虫一直未能显示任何反应，但Broom的RBC却有很强免疫粘附作用。因此他们比较了52例各种疾病患者与26例正常人的RBC粘附活性，发现两例TB病患者与1例风湿热患者粘附能力降低。,1953年：纳乐逊（R.A.Nelson）观察体内外梅毒螺旋体，型肺炎双球菌粘附于灵长类动物（人、猴、狒狒等）的红细胞和非灵长类动物血小板上，促进吞噬现象。他用正常人RBC、WBC与相应抗体致敏的型肺炎双球菌进行培养，发现肺炎双球菌可粘附于正常人RBC表面并被WBC吞噬，其吞噬率达60%，未加抗体组（4%）和未加RBC组（18%），推测RBC膜存在免疫粘附受体，免疫复合物同该受体结合可促进WBC的吞噬作用。由此命名为免疫粘附现象（Immnme adhereru phenomenon）。,1956年：Nelson又将肺炎球菌注入猿猴体内，发现其绝大多数细菌粘附于RBC上，认为灵长类动物RBC的免疫粘附现象起到对血中异物的清除及细菌的固定作用，由此认为是宿主机体防御的一部分。 1963年：尼雪俄考（K. Nishioka）证实红细胞这种免疫粘附现象是通过人红细胞膜C3受体来实现，现称C3受体为第一补体受体（Ccomplement Receptor Typel, CR1）。,天马行空官方博客：/tmxk_docin ；QQ:1318241189；QQ群：175569632,天马行空官方博客：/tmxk_docin ；QQ:1318241189；QQ群：175569632,70年代后期有关CR1的研究报道很多。 1980年弗尔龙（D.T.Teavon）从红细胞膜上分离出CR1，研究CR1的性质：分子量19万25万，多态性膜糖蛋白，CR1总数95%以上存在于RBC膜上，CR1除了存在RBC膜上，还存在于多种细胞膜上如多核WBC、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、肥大细胞、肾小球上皮细胞。 ECR1在RBC膜上呈簇状分布。,1981年美国生殖免疫学家西格尔（I.Sigel）在前人研究基础上发现 （1）RBC有多种免疫功能 （2）RBC可粘附胸腺细胞 （3）血清中存在红细胞免疫粘附抑制因子，预见了血清中存在红细胞免疫调节系统。 （4）RBC膜过氧化物酶活性与CR1活性有关。 （5）RBC有杀伤致病原的效应细胞样作用推测RBC在阻止肿瘤细胞血行转移中有作用。 综上提出“红细胞免疫学说”。,天马行空官方博客：/tmxk_docin ；QQ:1318241189；QQ群：175569632,1982年梅多夫（M, E, Medlf）体外证明RBC的CR1和血浆中因子共同作用将粘附的免疫复合物（Ic）中的C3b降介为C3dg，C3d而失去炎性。 1982年郭峰证明（体外）RBC可粘附补体调理过的酵母菌，并证明SLE，肿瘤患者红细胞免疫粘附酵母菌的能力低下，该实验证明RBC可直接粘附补体调理过的病原体。 1983年科娜康夫在猴血循环内注入免疫复合物（IC），用同位素示踪，发现大多数IC很快与红细胞结合，并迅速被运至肝、脾，在该特定环境下，巨噬细胞膜上FC段受体比RBC膜上CR1活性强，使IC从红细胞膜上脱落而被吞噬消毁RBC促吞噬作用。,1984年西格费索（A.Sigfuson）通过体外美州商陆素刺激淋巴细胞转化实验发现加入自身RBC可增加淋巴细胞转化率和培养液中IgG、IgA量。 1985福斯里德（J.Forslid）在体外通过对比实验证明红细胞促吞噬作用与红细胞CR1和SOD酶活性有关。 1986年郭峰通过体外对比实验证明RBC可粘附补体调整的各种肿瘤细胞，并证明肿瘤患者RBC免疫粘附肿瘤细胞的下降，发现RBC可直接粘附未经补体调理过的肿瘤细胞，其机理不明。,天马行空官方博客：/tmxk_docin ；QQ:1318241189；QQ群：175569632,1992年刘景田等证实这种直接免疫粘附的机理与红细胞膜上CR1和肿瘤细胞膜上C3b分子有关，肿瘤细胞膜上的补体来源于荷瘤小鼠的腹水中，而荷瘤小鼠的腹水中确有少量补体物质的存在。 1986年凯斯（L.Keyes）等发现人自身红细胞可增加T细胞产生-干扰素。 1987年鲁杰利斯（M.T.Rugeles）发现自身红细胞加入外周血单个核细胞培养管中可增强原发性和继发性特异抗体应答。 1987年郭峰通过体外对比实验证明血清中还存在一种加热（5830）不灭活的红细胞免疫粘附促进因子。,1988年叶瑞拉（G.Yirella）通过体外抗淋巴细胞功能相关抗原3（LFA-3）单抗或CD2单抗处理和不处理的红细胞对促进B细胞增殖和免疫球蛋白的影响分析，认为红细胞的这种作用是因CD58（LFA-3），CD59与T细胞的CD2分子相互作用密切相关。推测是由于RBC促进T细胞IL-2受体表达和增强对外源性IL-2应答的敏感度所致，可能与增加B细胞生长因子或分化因子有关。表达LFA-3的红细胞有利于激活T辅助细胞。T辅助细胞接受第一信号（加工后的抗原）刺激外，还接受第二信号通过LFA-3/CD2相互作用。,1988年万内利（J.R.Yannelli）在培养瓶内加RBC可促进LAK细胞的产量和活性，RBC数与淋巴细胞数为100：1时IL-2激活的LAK细胞活力最大。通过单抗阻断实验，证明这种促进作用与细胞膜上LFA-3与淋巴细胞膜CD2相互作用密切相关。,1988年威瑞拉（Vireal）用单抗标记法证明红细胞膜有CR3。 1989年郭峰发现RBC和淋巴细胞或粒细胞可共同围攻粘附各种肿瘤细胞。 1990年派考德（J.P.paceand）采用折痕标记免疫电镜比较PMN和红细胞的CR1形态，发现细胞细胞上几乎50%的CR1量3单位簇状分布，而这种簇状分布在PMN不到15%。CR1的这种簇状分布可使它与C3包被的IC结合位点呈多价性，连接更为牢固。 1994年刘景田发现CR1免疫调节因子，其中包括CR1免疫调节促进因子和CR免疫调节抑制因子。对粒细胞、淋巴细胞（主要指B淋巴细胞）也有同样的调节作用。,（三）红细胞的免疫物质,免疫细胞的免疫功能是通过其免疫物质实现的，红细胞的免疫物质主要为存在于红细胞膜上的蛋白质分子。现已发现红细胞有许多与免疫有关的物质如CR1、CR3、CD58、CD59、DAF，SOD酶等。,红细胞与其它免疫细胞的比较,1补体受体（CR1，CR3） 补体受体存在于不同种类的血细胞上，不同的血细胞所具有的补体受体不同，补体受体根据结合补体C3片段种类的不同可分为CR1，CR2、CR3三类。 CR1是C3b、C4b的受体也是与红细胞免疫粘附作用有关受体。 CR2是C3d的受体，C3d是C3b裂解的终末产物。 CR3是iC3b的受体（是C3b受I因子，H因子在CR1参与作用下形成的无活性C3b（iC3b）,人类细胞上的补体受体,红细胞的补体受体主要是CR1，最近发现还有CR3 CR1是一种单肽链糖蛋白，具有明显的多肽性，有4个同种异型，其配体是C3b、iC3b、C4b、iC4b均可结合于CR1，但C3b仅需少量即可发生免疫粘附（约60个分子/细胞），而C4b则需较大数量（2500个分子/细胞），才能发生反应。 iC3b也可结合于CR1，但结合程度较轻，它与CR3型受体结合能力强。 CR1活性能被胰酶、糜蛋白酶、鞣酸、甲醛、强酸、强碱所破坏，在PH6.77.3下最能发挥其细胞免疫粘附作用。,血细胞中CR1数量：红细胞CR1与白细胞CR1数比例21：1，红细胞膜上的CR1呈簇状分布，在吞噬细胞上主要呈散在分布，每簇约含2-15个CR1，红细胞CR1总数与簇数和每簇中CR1单体数高度相关。 CR1簇状分布优点：可使它与C3b包被的IC结合位点呈多价性，连接更为牢固。 红细胞膜上的CR1总数比白细胞多。 红细胞对粘附C3b分子的抗原（如肿瘤细胞、细菌等）的亲和力显著大于吞噬细胞，红细胞在清除CIC致热原中占有重要地位。CR3：可能具备对某些小抗原有吞噬，通过释放过氧化酶对抗原加以消毁和可直接识别某些细菌有关。,2淋巴细胞功能相关抗原-3（LFA-3） 为红细胞膜上的一种蛋白分子，是CD2的天然配体，广泛分布于红细胞、T淋巴细胞，B淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞，血小板等表面是由14KD和19KD二条单链多肽和糖基组成的糖蛋白，分子量为55-70KD。 CD2为T细胞分化抗原中最早出现的，胸腺细胞时即出现，相当于OKT系统中OKT11，CD4（即辅助T细胞）CD8（抑制T细胞）细胞均存在此一分化抗原。,LFA-3作用：LFA-3与受体CD2结合后可传递足以诱导T细胞增殖，淋巴因子分泌及非MHC限制性细胞毒作用的跨膜信号，使T细胞活化，分泌IL-2，IFN-r和表达IL-2受体等，另外CD2/LFA-3在胸腺发生及T、B细胞相互作用中均起作用。 因此，LFA-3与CD2作用是免疫细胞间相互协调作用，淋巴细胞活化，产生淋巴因子的分子基础。,3人类补体膜辅助因子蛋白（MCP） 是红细胞膜上功能蛋白的一种，能与CR1，DAF等基因协调完成红细胞对补体活性的调节，是灭活C3b、C4b、iC3b的细胞表面辅助因子，可保护自身细胞免疫补体损伤。 4降介加速因子（DAF） 亦称为补体衰变加速因子，是一种糖蛋白，不同细胞膜上DAF分子量不同。DAF与红细胞膜上MCP、CR1等多种功能蛋白共同协调完成红细胞对补体活性的调节，使宿主细胞免受自身补体级联放大过程中引起的损伤。DAF主要作用于Bb及C2a，而CR1主要作用于C3b片段，DAF结合C3b的能力比CR1小得多。,5I因子 即C3b灭活因子，是一种糖蛋白。作用增加吞噬细胞对抗原的粘附，从而增强其免疫功能。与NK/K细胞上的CR3结合，发挥依赖补体的细胞毒作用（CDCC），杀灭肿瘤细胞或其它异已细胞。 6过氧化物酶 在RBC免疫粘附后该酶活性增强，提高消毁抗原物质的能力，且可将抗原决定簇提呈给T细胞，通过T细胞表面受体（TCR）激活T细胞功能。,7过氧化物歧化酶 RBC内含有SOD（超氧化物歧化酶），该酶是一类重要的氧自由基清除酶，使O2（超氧化物阴离子自由基）变为H2O2，O2分子，通过清除氧自由基O2，使细胞和组织免受损害，保护和增强免疫细胞的免疫功能。 8红细胞免疫粘附抑制因子 存在血清中，1981年发现一种糖蛋白。主要抑制红细胞C3b受体活性，可降低红细胞粘附携带IC的能力。 9红细胞免疫粘附促进因子 也存在于血清中，为一种糖蛋白，提高红细胞C3b受体活性，故可使红细胞免疫粘附活性增强。,（三）红细胞的免疫功能,1红细胞免疫粘附、携带及清除抗原异物的功能 免疫粘附：指细菌、寄生虫、梅毒螺旋体、胸腺细胞、肿瘤细胞等抗原物质激活补体或这些抗原与相应的抗体结合激活补体形成复合物粘附于血细胞（红细胞、白细胞或血小板）上。 红细胞的免疫粘附作用：通过细胞膜表面的补体受体实现的。,抗原与抗体形成的Ab-Ab复合物（或Ag-Ab-C）形成存在，红细胞通过其膜上CR1、CR3的免疫粘附功能将Ag异物携带至肝脾加以消毁的，因此红细胞是机体清除循环系统液相中CIC的主要承担者，几乎所有的补体调理过的抗原和IC都是由红细胞结合运至肝脾消毁的。,在肝脾血流降速时，RBC与固定巨噬细胞比例剧降为10:15:1时，吞噬细胞上CR1、CR3、FCR对红细胞上IC中的C3b、iC3b总亲和力大于红细胞CR1的亲和力时，微循环中的Ag-Ab-C复合物才能从RBC转向巨噬细胞，巨噬细胞便将红细胞免疫粘附的复合物夺下，并将其免疫粘附吞噬，红细胞释放回血液循系统，不被吞噬，继续执行CIC的功能。但对那些结合有特异性抗原、抗体、补体复合物的RBC被吞噬细胞吞噬、清除血行中大量潜在的致病性免疫复合物。,RBC通过清除血循环中的抗原异物，如细菌、病毒、癌变细胞等，在防御微生物感染，保持机体内环境的平衡，维持自稳机能方面有着重要意义。,2红细胞识别和储存抗原的功能 Garrey用新生兔做动物实验，将标记氚的牛血清白蛋白（3H-BSA）注入新生家兔腹内，用外周血涂片及组织切片的放射显影法观察循环中RBC和肝血管内的RBC，发现6小时后血循环中出现携带BSA的红细胞，12h后绝大部分抗原浓集于肝脏血管内，注入1-2天，肝血管系统内外红细胞表面聚集了大量抗原，携带抗原的红细胞在肝、血循环中可持续4-6周以上。,该实验结果提示新生兔的RBC有识别和储存异种抗原物质的能力。同时将标记氚的兔血清白蛋白（3H-BSA）抗原，采用同样方法观察，表明新生兔RBC对同种抗原亦具有识别能力和免疫耐受性。 郭峰报道RBC可粘附血清调理过的酵母菌和各种肿瘤细胞。机理可认为酵母菌和肿瘤细胞可旁路激活补体粘附C3b，再与RBC上的CR1相结合而被识别。由此认为RBC能识别，储存各种抗原。,3红细胞具有效应细胞样作用 RBC膜表面存在过氧化物酶活性，是一种典型溶酶体酶，抗原粘附RBC可提高粘附区域过氧化物酶活性，使RBC作为效应细胞起作用，RBC通过这种酶激活的作用，可直接杀伤病原体，消毁粘附的抗原抗体复合物，加强CIC的清除。因此认为RBC本身也有防御感染的作用。,4红细胞具有抗原提呈细胞（APC）样作用 RBC具有双重粘附特性，既可粘附IC，又可粘附自身胸腺细胞及T细胞上，从而可以将抗原提呈给胸腺细胞及T细胞，起抗原提呈细胞（APC）样作用，增强T细胞免疫功能，更有效地清除IC。,5红细胞促进淋巴细胞的免疫功能 RBC具有促进T、B淋巴细胞和体液免疫功能，扩大细胞免疫及体液免疫效应。RBC具有双重免疫粘附特性，即RBC不仅与Ag-Ab-C互相粘连，且可与自体的胸腺淋巴细胞和T淋巴细胞粘附，形成自身玫瑰花结，这种双重免疫粘附，在IC与T淋巴细胞之间起着桥梁作用，使抗原与T淋巴细胞靠近，从而将抗原提呈给T淋巴细胞，增加T淋巴细胞捕捉抗原的机会，从而扩大T细胞依赖的免疫应答。,T淋巴细胞在RBC作用下，能促使IL-2受体表达及-干扰素产生，抗CD2单克隆抗体可抑制RBC对T细胞产生干扰素的促进作用。 红细胞IFA-3与T细胞CD2的作用在促进T淋巴细胞活化及产生淋巴因子的分子基础。红细胞通过LAF-3/CD2以及CR1-CIC/TCR对T细胞粘附，提呈抗原，激活T细胞增殖而起抗原提呈细胞作用。红细胞能促进B细胞增殖分化产生抗体和加强抗体依赖的细胞毒性（ADCC）作用。,红细胞还能增强淋巴细胞对肿瘤细胞的免疫粘附作用，直接增强NK细胞的抗肿瘤活性，且红细胞增强NK细胞依赖于Ca2+的存在。 红细胞能显著增加LAK细胞（Lyhphokime cativctell killed cell）对肿瘤细胞的杀伤作用。在培养瓶内加入RBC可促进LAK细胞的产量和活性，RBC数与淋巴细胞数为100:1时IL-2激活的LAK细胞活力最大。LAK细胞系淋巴因子激活的杀伤性淋巴细胞，对多种肿瘤细胞均有杀伤作用，是目前肿瘤过继疗法中一各很有前途的细胞。,因此，RBC对T、B淋巴细胞、NK、LAK细胞等的免疫功能有着重要的影响。而白细胞分泌的细胞因子（如胸腺素、IL-2、IFN-等）可促进红细胞的免疫功能。,6红细胞促进吞噬细胞的吞噬功能 RBC通过其表面的CR1（补体受体）与病原体与相应抗体组成IC的连接，可促进吞噬细胞对微生物的吞噬作用。且与红细胞表面的补体受体CR1数量与活性有关。 Siegel推测RBC可阻止癌细胞在血循环中扩散。癌细胞可粘附红细胞，易被吞噬细胞捕捉、吞噬、清除，防止癌细胞的扩散。红细胞具有增强吞噬细胞抗肿瘤作用。,7红细胞清除阴离子的作用 超氧阴离子（O2）是生物体内主要的自由基（FR），在许多情况下，对机体是有害的，是导致炎症、衰老及癌变等的原因之一。红细胞超氧化物歧化酶（SOD）是一类重要的氧自由基清除酶，具有抗炎、抗衰及抗辐射的作用，可消除微环境中超氧化物阴离子自由基对巨噬细胞膜和淋巴细胞的破坏作用，以保护和增强吞噬功能和淋巴细胞的免疫功能，使吞噬细胞产生IL-1、TNF等因子的能力增强。SOD可清除微环境中的氧自由基对LAR活性的抑制，提高LAK细胞的产量与活性。,8红细胞参与补体活性的调控 补体系统通过免疫细胞上补体受体在调节细胞和体液免疫中处于枢纽地位。其中C3b分子占据重要地位。而红细胞有CR1、I因子、DAF与血浆H因子协同，先将C3b固定，后降解为iC3b、C3b，C3dg，使细菌、肿瘤细胞打上标记，使其更易被相应补体受体T、B淋巴细胞、NK、LAK细胞，吞噬细胞所识别，补体系统经红细胞协调作用调控各免疫细胞的免疫反应。,9红细胞自身免疫调控系统 血清中存在红细胞免疫粘附抑制因子和促进因子，分别抑制和促进红细胞免疫粘附活性，正常情况下这一对调节因子处于动态平衡。当比例失调，红细胞免疫功能低下或紊乱。,二、红细胞免疫学实验技术,目前国内外测定RBC免疫功能的方法有：花环法、放免法、酶联法、红细胞培养技术，发光法。 郭峰将红细胞免疫调节功能测定方法的研究概括为三个测定：,（1）红细胞免疫粘附功能的测定，包括： RBC-C3b受体花环 RBC-IC花环 红细胞SPA混合花环 肿瘤RBC花环直向肿瘤红细胞花环率（DTER）、促肿瘤红细胞花环率（ETER）、自然肿瘤红细胞花环率（NTER） 抗IgG单克隆抗体Coombs试验,（2）红细胞免疫功能自身调控能力的测定。包括： 血清中红细胞免疫粘附抑制因子测定 血清中红细胞免疫粘附促进因子测定,（3）红细胞对其它免疫细胞的免疫调控能力的测定 红细胞促淋巴细胞吞噬功能的形态学方法 肿瘤红细胞淋巴细胞混合花环 肿瘤红细胞粒细胞混合花环,近年来，红细胞免疫测定法的研究有了新的进展，如： 自然肿瘤红细胞花环试验，补体致敏酵母多糖血凝法，肿瘤细胞血凝法，红细胞促吞噬功能发光技术，红细胞免疫粘附混合花环试验，红细胞CR1PCR技术，红细胞促NK细胞活性测定技术等。,二、红细胞免疫技术,（一）红细胞C3b受体花环及免疫复合物花环试验 1原理： 红细胞C3b受体花环：红细胞膜上CR1可与C3b致敏酵母多糖粘附形成花环，花环率的高低与CR1的活性及数量有关；RBC免疫复合物（IC）花环：RBC膜粘附的IC中C3b分子可与酵母多糖粘附形成花环，花环率的高低与血清中CIC的含量有关。,2方法学 郭峰法： 预备试验：（1）待测RBC（肝素抗凝）悬液（指血，静脉血均可）经生理盐水洗涤离心3次，（2000rmin，3-5min），按红细胞计数方法配成1.25107ml使用液备用；（2）补体致敏酵母多糖冻干试剂按说明书要求溶解。用生理盐水洗涤离心2次（水平离心），按RBC计数法计数配成1108ml使用液备用。,正式试验：取两支试管，每管加待测RBC使用液0.075 ml，第一管再加补体致敏酵母多糖使用液0.075ml，第二管再加酵母多糖使用液0.075ml，都摇匀放37oC 水浴30min；取出用手腕轻轻摇匀，加生理盐水 0.15ml；混匀后再加0.25%戊二醛 0.05ml，轻轻混匀；取13量水平涂片，吹干，加甲醇固定加少许瑞氏液，再加瑞氏缓冲液（PH6.4），用盐水或自来水少许冲洗加盐水后高倍显微镜计数。一个红细胞结上2个或2个以上酵母菌为一朵花环。计数200个RBC，算出百分率。第一管为RBCC3b受体花环率，第二管为RBC-IC花环率。,刘景田法 （l）补体致敏YS酵母冻干试剂和补体未致敏YS酵母冻干试剂 按说明书要求溶解、洗涤，配制浓度为l108ml。 （2）红细胞悬液制备 取未梢血或肝素抗凝血1滴加入2ml生理盐水洗两次，每次2000rmin3min，配成1.25107ml浓度。,（3）操作 取上述致敏酵母菌悬液与未致敏酵母菌悬液各50l加入2支康氏试管，各加红细胞悬液50l，混匀，37水浴30min，取出加0.25戊二醛1滴，轻轻混匀，室温5 10min，水平抹片，低温干燥，瑞氏染色，湿片镜检，以一个红细胞上结合两个或两个以上酵母菌为阳性细胞，计200个红细胞求阳性率。,3注意事项： （1）计数要准确，RBC与酵母菌比例要适合； （2）酵母菌要分散不能自凝，要充分吹打分散，水浴时加盖，避免水进入 RBC破坏； （3）戊二醛加入前后都应轻轻混匀，避免假花环出现； （4）涂片要均匀、簿，高倍镜下一个视野大约10个RB C为妥； （5）各实验室要建立自己的正常值。,4意义： 作为RBC免疫粘附功能的指标。二项都低下判为原发性红细胞免疫功能低下，为RBC膜C3b受体受到破坏和影响所致;如果RBCC3b受体花环率降低而 RBCIC花环率升高，为继发性红细胞免疫功能低下，是由于 CIC增加，RBC粘附IC过多引起；如两项都升高，为红细胞免疫功能亢进与紊乱。该两项试验可作为临床上免疫性疾病的辅诊、判断预后、疗效观察等指标使用；可做为器官移植，疾病发病机理与药物筛选红细胞免疫指标使用；可做为中医中药免疫学研究指标使用。,（二） 红细胞SPA混合花环试验 1原理 葡萄球菌 A蛋白（SPA）能与红细胞膜粘附 IC中 IgGFc段相结合，而 C3b致敏酵母菌能与红细胞膜上未粘附IC的C3b受体结合，各自形成花环。,2方法学 在试管内加入洗过3次待测红细胞悬液（1.25 107ml）0.05 ml，补体致敏酵母菌悬液（1108/ ml）0.05ml混合，放 37水浴 30min；再加 0.05mlSPA菌体悬液（洗过一次后按红细胞计数法6.25 108ml），混匀，37水浴30min；取出水平涂片、瑞氏染色、油镜观察，RBC结上2个以上酵母菌为RBCC3b受体花环（酵母菌花环）；结上10个以上SPA 菌体为RBC-IC花环（SPA菌体花环）；结上10个SPA菌体和2个酵母菌以上为混合花环，未结合上SPA菌体与酵母菌为裸体红细胞。计数200个RBC，算出各自花环率。RBC为红色，酵母菌为兰色，SPA菌体为小的浅兰色。,3注意事项 基本同RBCC3b受体花环与RBCIC花环。另需注意的是染色要适当，不能太深；同时注意区别红细胞棘突变型与SPA菌体的区别（如SLE患者有棘状红细胞出现），酶标 SPA或 SPA纯蛋白可代替 SPA菌体。,4意义 基本同RBCC3b受体花环与RBCIC花环。但该试验同时显示四种免疫功能状态不同的红细胞，按程度不同，将RBC分为四种亚群：,（1）SPA菌体花环为已全被IC或抗RBC抗体粘附的红细胞亚群； （2）酵母菌花环为未粘附IC或抗RB C抗体的红细胞亚群； （3）混合花环为部分粘附IC或有少许抗RBC抗体，并C3b受体有空位的红细胞亚群； （4）裸体红细胞为未粘附IC或抗体，并且C3b受体活性低（不能粘附补体致敏酵母茵）的红细胞亚群。,此实验做为科研方法深入研究各种免疫性疾病的免疫学发病机理更有价值。该试验的成功也证明红细胞按免疫功能状况不同，可分为亚群，结合Coombs试验使用可能更有价值。在资料不断积累过程中会进一步开拓该试验的实用价值，对自身免疫溶血性贫血发病机理新的解释会进一步深化。,（三） 血清中红细胞免疫调节因子活性的测定 1原理 血清中存在促进与抑制红细胞免疫功能的两种物质，即红细胞免疫促进因子（RFER）与抑制因子（RFIR），前者耐热（5830min不被灭活），后者不耐热（5830min灭活）而设计红细胞C3b受体花环促进与抑制试验。,2方法学 郭峰等法 促进与抑制试验两种方法可同时操作：取三支试管，第一、二支试管加入待测新鲜血清各0.075ml。第一管放58水浴30min。第二管放室温，第三管加入0.075ml生理盐水；然后每管再加入洗过3次的正常人0型红细胞悬液（1.25107ml）0.05Inl混匀，放 37.水浴 30min；再加补体致敏酵母菌悬液（1108ml）0.05ml混匀，放 37水浴30min，加 7滴生理盐水混匀，再加 2滴 0.25戊二醛混匀,从各管中取出约 13细胞悬液水平涂片、吹干，加甲醇固定后，用瑞氏液染色。红细胞呈红色，酵母菌呈兰色。血清灭活管涂片高倍镜下计数二种花环标准，一种是红细胞结上 2个或 2个以上酵母菌为一朵花环（计算促进率使用）；一种是结上3个或3个以上酵母菌为一朵花环（计算抑制率使用）。,血清未灭活管涂片高倍镜计数，红细胞结上三个或三个以上酵母菌为一朵花环（计算抑制率使用）。生理盐水管涂片高倍镜计数，红细胞结上2个或2个以上酵母菌为一朵花环。每管涂片都计数200个红细胞，按各自标准，算出花环率。按不同公式求出促进率与抑制率，以此标准代表血清中红细胞免疫促进因子和红细胞免疫抑制因子活性。,刘景田等法：一步法红细胞免疫调节因子测定 1材料 1.1补体致敏Ys酵母冻干试剂：按说明书要求溶解、洗涤，配制浓度为1108ml 1.2电子血细胞计数仪：山东三联电子公司产品，型号DXJ2。 1.3生物显微镜：日本产，型号CHB145T。 1.4电热恒温水浴锅：江苏省张家港医疗器械厂，型号HH.S。 1.5标本来源：为临床确诊的住院患者，其中食道癌24例，胃癌12例，肝癌9例，肺癌6例，膀胱癌11例。,2方法与结果 2.l 改郭峰原方法的两步法为一步法 按郭峰原法处理血清，分别加入灭活管（5830min）和未灭活管（室温）各0.075ml，第三管加入生理盐水0.075ml，然后依次加人洗过三次的正常人O型RBC悬液1.25107/ml），和补体致敏Ys酵母菌悬液使用液(1108ml)各0.05ml混匀，置37水浴30min，其余步骤按郭峰法操作，并与郭峰原法对照，其结果如下：,表2-1 一步法与两步法检测结果对比（X土s）,从上表可以看出，（1）用一步法对52例恶性肿瘤患者红细胞免疫调节因子的检测结果与两步法（原方法）检测结果基本相一致，二者无显著性差异（P005），说明将血清、O型 RBC和补体致敏 Ys酵母菌三者依次加人进行一次孵育与三者分别加入进行两次孵育所得结果是一样的，说明一步法是可行的，能够代替两步法。（2）恶性肿瘤患者血清中RFER明显下降（对照组 18.928.3），RFIR明显上升（对照组34.8 4.6），与恶性肿瘤患者红细胞免疫功能低下是一致的。,血清中红细免疫促进因子与红细胞免疫抑制因子在血清中的含量，可用其RFER与RFIR的比值来表示，值的大小可反映血清中调节因子的变化规律，同时亦能间接反映红细胞的免疫功能。其比值愈大，血清中红细胞免疫促进因子含量愈高，其抑制因子含量愈低，红细胞免疫功能就愈强；反之，比值愈小，血清中红细胞免疫促进因子含量愈低，抑制因子含量愈高，红细胞免疫功能愈弱。上表中RFERRFIR的比值明显减少（正常对照为5.71.2），与恶性肿瘤患者血清中红细胞免疫促进因子下降、抑制因子上升、红细胞免疫功能低下相一致。可见，测定患者血清中RFER与RFIR的比值在临床上有着重要意义。,2.2统一了阳性花环的判定标准，改原方法中一个红细胞上结合2个或2个以上酵母菌（计算促进率使用）以及结合3个或3个以上酵母断计算抑制率使用）为一朵阳性花环，一律改为一个红细胞上结合2个或2个以上酵母菌为一朵阳性花环（计算促进率与抑制率都按这个标准）这样的优点是：（1）程序简便，节约时间和人力；（2）实验结果比较精细、准确，不易出现较大的误差。,2.3改室温为37，使实验结果稳定，不易受室温变化的影响，结果可靠。总之，在目前血清红细胞免疫调节因子还不能提纯，直接测定其含量还比较困难的情况下，采用郭峰创建的RFER与RFIR的测定方法，是反映红细胞自我调节功能的重要指标。该法在郭峰原法的基础上进行了改良，建立了RFERR与RFIR一步测定法，有利于推广应用。,3注意事项 基本同红细胞C3b受体花环试验。另外对血清灭活温度的控制（保持58），作用时间（固定半小时）很重要。正常人O型红细胞要肝素抗凝新鲜血，强调研究组与实验组标本同批化验，用同批补体致敏酵母菌。,4意义 为红细胞免疫自身调控机理研究提供简便有效的手段；对药物作用免疫学机理和疾病发病机理研究以及对机体红细胞免疫功能变化分析都有其重要价值。,（四） 血清中CRI免疫调节因子测定,1981年，美国学者Siegel发现血清中存在红细胞免疫粘附抑制因子，并认为血清中存在红细胞免疫自我调控系统。1988年，郭峰发现血清中还存在红细胞免疫粘附促进因子。1994年，刘景田等在 Siegel和郭峰研究的基础在，发现血清中的调节因子不仅对红细胞上的CRI，有调节作用，而且对粒细胞(淋巴细胞主要指B淋巴细胞)上的CRI；也有同样的调节作用，并且调节幅度基本一致，故将血清中的调节因子称为CRI免疫调节因子，其中具有正调节作用者称为CRI免疫调节促进因子，具有负调节作用者称为CRI免疫调节抑制因于。,同时在比较三种细胞的基础上，选择能长期保存、体积较大、敏感性高的粒细胞作为血清中CRI免疫调节因子测定实验用的被调节细胞，并以高效价补体致敏的酵母菌作靶细胞。其测定结果为血清中CR1免疫调节因于对粒细胞、红细胞等的免疫一调节作用，该结果既能反映血清中调节因子对粒细胞上 CRI的调节作用，也能够反映对红细胞上CR1的调节作用，故此实验方法可用于血清中红细胞免疫调节因子的测定。,一材料 HBSSH（无酚红 Hanks平衡盐溶液）；小牛血清；生理盐水；冻干被调节细胞及冻干高效价补体致敏Ys酵母试剂（陕西省人民医院免疫研究室生产）；生物显微镜；小型离心机；普通冰箱等。,二预备试验： （1）被调节细胞悬液制备：取冻干被调节细胞1支，用含1小牛血清的HBSS一H液洗2次，每次2000rmin离心8min，用HBSSH恢复体积0.35ml使其浓度为1x 107ml细胞悬液备用。（2）补体致敏（高效价）Ys酵母茵悬液制备：取冻干高效价补体致敏Ys酵母试剂1支，用生理盐水洗2次，恢复体积0.35ml，使其浓度为6X 107ml悬液备用。,正式试验： 取58灭活及末灭活血清各0.lml，加入灭活管与末灭活管，另设对照管加生理盐水0.lml，每管分别加被调节细胞悬液10l混匀，3730min孵育，取出后用含1小牛血清HBSSH洗2次，弃去上清液，再加高效价补体致敏酵母菌悬液10l，混匀，3730min孵育，混匀，加 0.25戊二醛 1滴，混匀，置室温 510min，水平抹片，自然干燥，瑞氏染色，高倍镜检，以被调节细胞上结合3个以上酵母菌为一朵阳性花环，计数200个被调节细胞，求阳性花环率，按下列公式计算CR1免疫调节促进因子对C3bRR的促进率和CR1免疫调节抑制因子对C3bRR的抑制率。,100%,表2-2 操作程序,三被调节细胞的比较,表2-3 被调节细胞的比较,四临床应用 采用上述试剂和实验方法，对60例健康人、30例乙肝患者（HBsAg、HBeAg和抗HBc阳性患者）、30例恶性肿瘤（肺癌9例、胃癌 14例、肝癌7例）、17例骨折患者、11例急性肾炎，共148例患者的血清标本进行检测，其结果如下表：,表2-4不同人群CR1免疫调节团子检测结果（X士 S）,*与对照组相比，P0.05；*与对照组相比，P0.1,从上表可以看出，恶性肿瘤、乙肝患者和创伤（骨折）患者红细胞免疫调节功能与健康人比较，其促进率明显下降（p0.05），抑制率明显升高（p0.05），急性肾炎患者促进率升高而抑制率下降（P0.05），与国内外报道基本一致，说明用粒细胞作被调节细胞来检测血清中的调节因子对红细胞上CR；的调节作用是完全可行的。,五注意事项 1冻干试剂用少量盐水反复冲洗干净，离心时防止细胞丢失，恢复体积后计数。 2溶解后未用的试剂，被调节细胞置4冰箱四天内效价不变，高效价补体致敏酵母试剂置冰盒内一周内效价不变。 3其它注意事项同红细胞C3b受体花环试额 六意义：同红细胞免疫调节因子测定。,国外有关红细胞CR1研究 的几种测定方法,红细胞的免疫粘附作用是通过细胞膜上的I型补体受体（CR1；或C3b受体）来实现的。目前国内外对CR1的研究很多。现将国外有关红细胞CR1研究的几种实验方法介绍如下：,（l）红细胞-红细胞花环试验(Red CellRed Cell Rosette):即Siegel首次提出的标准RICA试验。人红细胞采用EDTA抗凝血绵羊红细胞予先用成人血清在21作用60分钟。所有细胞均用改良 Hanks液洗三遍配成所需浓度。试验时在试管中加入 2的人红细胞0.1ml，2的抗体予处理过的绵羊红细胞0.1ml，再加0.0100.025ml 1：5稀释的人脐血清作补体来源。,混合后即取一滴置载玻片上，上加盖片，室温（2023）作用20分钟，相差显微镜下随机计数100个人红细胞，以粘附至少一个羊红细胞为阳性，算出百分率。由于人红细胞平均直径78m，而羊红细胞只有45m，两者相差近一半，故镜下不难区别。,（2）免疫粘附血凝试验（immune adherence haemagglutination IAHA）：用人混合血清经盐析和二乙胺乙基纤维素层析得到人IgG。-70保存。用时溶于磷酸缓冲液，65加热30分钟，冰水冷却，15000g离心15分钟。取上清为人聚合丙种球蛋白（AHG）。在U型微滴定板上将AHG系列倍比稀释（原始浓度100gml）每孔25l，再加等量补体，37作用45分钟，加入二硫基苏糖醇溶液固定。,然后将待测红细胞用EDTA-GVB配成 2108ml，取25l加入各孔，置 24下60分钟后观察结果。IgG聚合后暴露出 C3b结合点与补体C3b结合，加入苏糖醇固定使 C3b不被降解，可与红细胞表面C3b受体结合而致红细胞凝集。以发生血凝的AHG的最高稀释度的倒数为 IAHA的效价，表示 C3b受体的活性，此法敏感性与特异性均高。,（3）血吸附法（Haemadorption technique，HA）：待测红细胞用 PBS洗三遍，3000xg离心作成集块，液氮速冻，切成 6-8m厚的切片，置盖玻片上。用兔抗羊红 IgM抗体致敏羊红细胞、加血清37作用10分种，形成抗原抗体补体复合物，洗过二遍用GVB配成1的悬液作指示细胞。,在微培养载片的凹孔中加满指示细胞，盖上覆有红细胞切片的盖片，使切片正好位凹孔中央，颠倒载片使指示细胞下沉到红细胞切片上，室温置30分钟再倒回来，使未结合的指示细胞离开玻片。结果判定以待测红细胞紧密结合一层指示细胞为3+，部分覆盖指示细胞为2+，散在结合为+，没有血吸附现象-，该法比血凝法更敏感。,（4）放射免疫测定法（Radiohomunoassay，RIA：根据放射性同位素标记部位不同有几种方法。 放射碘标记抗人IgG抗体法：将一定浓度的待测红细胞、AHG和人补体置37共同作用30分钟，使AHG通过补体C3b结合到红细胞膜C3b受体上，洗涤过后再加入碘标记的兔抗人IgG，4作用30分钟，使碘标抗体结合到AHG上，然后将红细胞洗过，测其放射性，结果用待测红细胞吸收的放射碘标记抗人 IgG量与正常人红细胞吸收量之比的平均值表示。,放射碘标记F（ab）2法：静脉抗凝血红细胞0下洗过配成一定浓度，加人125碘标记的非免疫 F（ab）2或125碘标记的抗 C3b受体 F（ab）2，20作用 60分钟，各取 0.075ml加入含0.3ml邻苯二甲酸二丁酯的微量离心管中，8000g离心30秒，切断离心管，管中沉淀和上清液分别含结合与未结合的抗体。抗 C3b受体的 F（ab）2结合量减去非免疫F（ab）2结合量，得出特异结合量，按Scatchard法算出每个红细胞抗原饱和量。,放射碘标记二聚体 C3b法：将一定浓度的红细胞与125碘标记的二聚体 C3b单独或加0.2mg非标记的抗C3b受体F（ab）2，0共育20分钟，再用上述微量沉淀法分离开结合与未结合的配体，未加抗体管的结合量减去加人抗C3b受体F（ab）2管的结合量，则为特异结合量，再按scatchard法计算出红细胞结合C3b的量。,放射碘标记抗人C3b受体单抗法：用纯化人红细胞CR1免疫小鼠取鼠脾细胞与浆细胞瘤细胞融合，生产抗 CR1的单克隆抗体。用125碘标记单抗加待测红细胞 37作用 30分钟，取50l加入微量离心管，8000g离心30秒，切去顶部，于 r计数器内测定放射量，算出红细胞表面受体数。或将红细胞溶解后取二个稀释度的提取物加入包被C3b的塑料板孔内。37作用 2小时，洗过后加125碘标记的抗 CR1单抗，置室温 1小时，洗过后切开，计数仪测放射量，再由纯化CR1所作的标准曲线中，求得红细胞提取物的受体量。该法特异性强。,（5）间接血凝法（indirect heamagglutination techwue， IHA）：用 PBS将鼠抗 CR1单克隆抗体对倍稀释加入等量5待测红细胞悬液， 4作用 1小时，然后将微滴定板倾斜使其近乎垂直约10分钟。未凝集的红细胞则象泪滴一样地流出来，而凝集的红细胞则粘附在孔底，结果以能引起凝集的抗CR1抗体的最高稀释度表示。该法避免了一般单抗法放射标记的过程。,（6）酶联免疫吸附试验（EmpmeLinked Immu