课件：固定化酶与固定化细胞技术.ppt

固定化酶与固定化细胞技术 王海磊 河南师范大学生命科学学院AEM室,2. 酶在应用中受到的限制因素：,1. 酶作为:生物催化剂的优点,稳定性差，易失活 反应速度随时间减慢（3分钟内吸光度的变化） 回收困难（淀粉酶水解废弃淀粉） 经济上不合算：多不能重复使用。 一些酶价格昂贵（漆酶用于木板粘合）,反应专一性强。 催化效率高（比一般催化剂高107-1013倍）。 反应条件温和（常温常压）。,（1）人工合成酶：应用化学合成法合成具有像酶那样活性的催化剂。这是有机合成和聚合化学中的最新技术。但距实际应用还有很大距离。 （2）酶的人工“改性”、“修饰”：酶和细胞固定化是其中的一类。其它如基因工程、化学修饰等方法。,3. 克服上述限制性因素的途径：,难得的报道：人工合成脂肪酶获得成功 随着生物产业的发展，人类对环境逐步认识，酶的广泛用途越来越得到人类的重视，尤其脂肪酶，在日化洗涤剂领域、医药美容领域、能源领域生物柴油生产中显得无可替代的优势。一般脂肪酶生产主要来源于发酵微生物生产法获得，产量受到限制，成本较高，很难满足工业需求。关于人工合成脂肪酶在中国乃至世界未曾有过相关报道。 经过不懈努力，我公司通过人工合成的手段获得成功，实属国际首例。经检验它不仅具备生物酶的通性，具有生物酶的全效功能，而且其催化性能、环境要求、毒化耐性各项指标远远高于普通生物酶。生产成本不足普通酶的三分之一，而且不受产量的局限，可大规模投入生产。 石家庄市华北联化科技有限公司,第一节 固定化酶 （Immobilized Enzyme）,一、发展概况,(1) 1916，Nelson和Griffin发现蔗糖酶结合于骨炭末上仍具有活力，但未引起人们重视。 (2) 1950前，研究不多，不超过10篇相关论文。有目的开展固定化研究始于50年代。1953，Grubhofer和Schloith将聚氨基聚苯乙烯树脂重氮化后与淀粉酶、蛋白酶结合最早固定化酶 (3)60年代进展较快：固定化酶投入工业化生产。 (4)70年代为快速发展时期。,固定化酶：连接于某种载体上或者限制在一定空间范围内、能连续使用的酶。,二、制备固定化酶的原则,1、保持酶原有专一性、高效催化能力和常温常压下起催化反应的特点。制备尽可能在温和条件下进行（低温、最适pH、水溶液中）。 2、能回收、贮藏和反复使用酶和载体结合牢固性问题。 3、有一定机械强度，以利于机械化、自动化操作。 4、酶与载体结合部位应避开活性中心及与维持酶高级结构有关的基团。且在制备过程尽可能保护这些基团。 5、最小的空间位阻：载体尽可能地不阻碍与底物的接近。 6、稳定性：载体不与底物、产物和反应液发生化学反应。 7、易与产物分离，便于回收和重复使用。 8、尽量降低成本。,三、固定化酶的制备方法,物理法: 吸附法、包埋法 化学法: 交联法、化学共价法 综合法: 逆胶束包囊法,（一）吸附法,采用固体吸附剂将酶吸附在它的表面使之固定的方法。,（1）无机吸附载体：矿物质和其它无机载体。 高岭土：胰凝乳蛋白酶 皂土： 过氧化氢酶、核糖核酸酶 氧化铝：葡萄糖氧化酶 二氧化硅（覆盖卵磷脂/脑磷脂）：酸性磷酸酯酶、磷酸葡萄糖变位酶。 不锈钢：直径100-200粒子，以氧化钛处理，可吸附-半乳糖苷酶（17mg/g载体）。,1、载体类型,9,高岭土,性质：良好粘结性 粒度和细度 较强结合能力 离子吸附性及交换性,瓷土，现在世界上都把它叫做“高岭土”，在很久很久以前，高岭村有一家姓盛的穷苦夫妻，日子苦得就像黄连一样。 盛家夫妻心地却特别善良。有一年冬天，天气寒冷，屋檐下躺着个白发苍苍的老公公，盛家妻子端来了一碗热开水，送到那老公公跟前，请他喝下暖暖身子。妻子借来米，男人生火熬粥，一会儿工夫，一大碗香喷喷，热腾腾的米粥端到了老公公的面前。老公公见了，也不客气，一口气就把粥喝了下去。 我没有什么好报答你们，我走后，可到村后东南面的松山顶上一口气挖它个九九八十一锄，老公公早已不见踪影。 软乎乎得就像糯米粉一样：“松山顶上的石头，可以拿来做瓷器，做成的瓷器能跟玉器一样的值钱哩！” 将挖起的土石做成一个个碗和杯的坯子来，放进窑里一烧，果然个个晶莹洁白，真象玉器一样。 从此，高岭村的穷人们在盛家夫妻的带领下，改行挖土建窑烧瓷器了。松山因地处高岭，就改名叫高岭山，山上的瓷土，就叫做高岭土了。,10,皂土：膨润土、火山黏土。,皂土是由天然膨润土精制而成的无机矿物凝胶。膨润土一般是指主 要由蒙脱土组成的一种黏土岩。皂土的主要有效成分即为蒙脱土， 含量大约90%。,蒙脱石是由两个硅氧四面体夹一层铝氧八面体膨润土组成的2:1型晶体结构，由于蒙脱石晶胞形成的层状结构存在某些阳离子 如Cu、Mg、Na、K等,且这些阳离子与蒙脱石晶胞的作用很不牢 固，易被其它阳离子交换，故具有较好的离子交换性 。,（2）有机吸附载体 纤维素粉：糖苷水解酶 火棉胶：木瓜蛋白酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（70mg酶蛋白/ cm2） ),（3）离子交换剂作为吸附载体 CM-纤维素、DEAE（二乙胺基乙基）-纤维素、DEAE-葡聚糖。 人工合成的阴离子、阳离子交换树酯。由苯乙烯、二乙烯合成的聚合物。 阳离子型：磺酸、磷酸、-COOH、酚基等基团 阴离子型：季胺、仲胺、伯胺基团。,火棉胶： 硝化棉溶液；硝化纤维素：用一种天然胶或合成胶增塑的树脂与之相结合,通过溶剂蒸发而干燥后制成的材料。 对眼睛、呼吸道粘膜有刺激作用。经呼吸道和消化道进入人体，影响中枢神经系统。人接触后有咽喉痛、头痛、嗜睡、精神迟钝、腹痛、呕吐、皮肤及眼结膜充血、疼痛。本品极易燃。遇明火、高热、氧化剂或胺能引起燃烧爆炸。长期贮存能自燃。,CM-纤维素 CMcellulose 即羧甲基纤维素（carboxymethyl cellulose）为阳离子交换纤维素之一。,2、影响因素,pH：pH变化影响载体和酶蛋白的电荷，从而影响酶的吸附。一般在蛋白的等电点时可达最大吸附。 (2) 盐：影响复杂。一般会阻止吸附。实际上已被用来洗脱从低盐溶液吸附的酶。个别情况可促进蛋白的吸附于原来不吸附的惰性支持物上。 (3) 温度：随温度升高而增加吸附量。但酶失活会加速 (4)载体：与载体表面积、多孔度、载体预处理有关。颗粒越小则吸附越好。多孔载体与孔的大小和表面积有关。另外载体的预处理是极为重要的：有的载体会影响酶的结合量、有的会引起酶变性、有的会降低酶的活性。例如多孔硅，其表面有较高的酸性而易使酶变性，需要用缓冲液进行予处理。,3、吸附法优缺点,(1) 优点 操作简单;可充分选择不同电荷、不同形状的载体; 酶的纯化和固定化可在吸附过程中一步完成;酶使用过程的失活可重新活化;载体可再生 (2)缺点 pH、温度、离子强度、时间等多因素对固定化酶影响复杂，不同酶、不同载体的情况各不相同。 最适酶量的选择是经验性的。 吸附程度和固定化酶的活力间不一定平行。 酶与载体结合力不强，易导致催化力丧失和污染反应产物。,4、方法举例,酶的发酵生产 Aspergillus oryzae 3042扩大曲40-50小时发酵6倍冷蒸馏水抽提2次压滤酶液（亮黄色）测活力。（25M/小时/ml） 载体予处理：DEAE-sephadex 25溶胀0.05mol/L NaOH处理洗涤。 固定化：酶液调节pH7.0-7.0与载体混合（载体湿重：酶液=1g：60ml）4-7冷库搅拌吸附过夜吸去上清液用蒸馏水和0.15Mol/L醋酸钠水溶液洗涤水洗涤后4备用。,米曲霉氨基酰化酶,（二）共价结合法,在酶蛋白分子上功能团与固相支持物表面上的反应基团之间形成化学共价键连接而使酶固定的方法。 固定化酶研究中最活跃的一大类方法,可供共价结合于载体的功能团包括： 氨基：N端-氨基、赖氨酸残基的-氨基 羧基：C端羧基、门冬-羧基、谷氨酸-COOH 巯基：半胱氨酸-SH 羟基：酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸的-OH 苯环：苯丙氨酸、酪氨酸 咪唑基：组氨酸 吲哚基：色氨酸,在进行一种酶的固定时，首先要考虑酶的氨基酸组成、活性中心的氨基酸、立体结构及专一化学修饰对酶活性和影响。实际上，共价偶联中最普遍使用的基团是：氨基、羧基、和苯环。 共价偶联反应应注意的问题： (1) 共价结合的功能基团不影响酶的催化活性。 (2) 反应尽可能温和 (3) 最好能在水溶液中进行 (4) 较高的反应专一性：只对某一类功能基团有很高的专一性，而对其它基团或才水溶液几乎无副反应。,载体选择时的注意问题： (1) 理化性质：应是亲水性质的，疏水载体往往对酶有变性的作用。 (2) 有尽能大的表面积：较细颗粒、多孔载体。 (3) 机械强度和稳定性 (4) 具备在温和条件下与酶结合的功能团。,常用载体： (1) 天然高分子材料：纤维素、琼脂糖、淀粉、葡聚糖凝胶、胶原及其衍生物。 (2)合成高聚物：尼龙、多聚氨基酸、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等。 (3)无机支持物：多孔玻璃、金属氧化物等。,按载体连接的基团类型分为： (1) 苯氨基载体 (2) 羧基载体 (3) 酯族氨基载体 (4) 硅烷化无机载体,载体表面获得反应基的反应类型 ： 苯氨基：重氮法、异硫氰酸法 羧基：叠氮法、酰氯法、活化酯法、酸酐法 羧基、氨基：缩合法 氨基：戊二醛活化法 含羟基化合物：溴化氰法 活泼卤素、二硫化合物、醛基高聚物：直接与酶偶联 其它：硅烷化法、金属鳌合法、四元缩合反应,1、重氮法,原理：带芳氨基侧链的聚合物用亚硝酸处理，形成重氮盐，在中性偏碱性条件处（pH8-9），亲电子的芳族重氮离子攻击活泼的芳香环，如酪氨酸的酚基、组氨酸的咪唑基，形成相应的偶氮衍生物。而与-NH2(N端-氨基、赖氨酸残基的-氨基)的反应，须在过量重氮盐存在下形成双偶氮化合物。,pH8-9,芳族重氮基具有疏水性，趋向于吸附蛋白分子上疏水性的酪氨酸集中区域。,重氮法常用的载体有： 带苯氨基的珠状聚丙烯酰胺 带苯氨基的多孔玻璃 间氨基苯甲氧基纤维素 对氨基苯纤维素。,ABSE-多糖（对氨基苯磺酰乙基 )制备过程：,例：ABSE-纤维素固定化胰蛋白酶,（1）碱性纤维素制备：24g干甘蔗芒杆纤维素，加48ml 12% NaOH溶液，0搅拌1h，15倍水稀释后过滤。 （2）活化剂配制：对-硫酸酯乙砜基苯胺24g，加60ml蒸馏水，40搅拌，加1mol/L Na2CO3溶液调节pH至6.5（约48ml），离心去沉淀，得到对-硫酸酯乙砜基苯胺溶液。 （3）ABSE纤维素制备：加碱性纤维素、活化剂溶液于反应器，热水浴保持温度达60，立即用0.5M NaOH调节至pH13,温度升至80,维持pH13保温45min。以2L 0.05M NaOH洗涤3次,再以水洗涤3次。得ABSE-纤维素（约75g）,（4）偶联酶： A. 配制酶液: 20mg胰蛋白酶溶于16ml0.05M CaCl2-0.03ml正丁胺(保护剂)混合液(预先以1M HCl调至pH9.5)； B. ABSE-纤维素处理：取5gABSE-纤维素，加10ml蒸馏水，冰水浴，边搅拌边加1M HCl、5%NaNO2各2.5ml，摇匀，冰浴15min抽滤，取出滤饼，迅速用预冷的0.05M HCl和蒸馏水各洗涤三次。(重氮化) C. 偶联：滤饼投入胰蛋白酶液中，立即用2M Tris液调pH至7.5-7.8，搅拌1h，抽滤。 D. 洗涤：固定化酶以50ml 3%NaCl搅拌洗涤3次，水洗涤2次后，悬浮于0.05M CaCl2溶液中，冰箱保存备用。,2、叠氮法,将载体上羧基活化成叠氮化合物，可以与酶分子上的-NH2、-OH、-SH发生共价结合。 这是最早、也是经常使用的一种共价结合的方法。 该类方法所使用的载体有：CM-纤维素、CM-Sephadex、聚门冬氨酸、生物胶CM-100等。,反应原理,即CM载体在酸或三氟化硼催化下以甲醇酯化，然后用水合肼肼解，再通过亚硝酸活化成叠氮化合物。可与酶-NH2基反应形成肽键而偶联（pH7.5-8.5，高聚叠氮化合物易结合-NH2基）。,3、溴化氰法,带-OH基的多糖载体，通过溴化氰活化后连接酶. 具有连位-OH基的高聚物（纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等）都可用此法。反应原理：,多糖在高pH（10-11.5）用CNBr活化，在稍低pH条件下连接蛋白游离氨基。亚氨基碳酸盐对蛋白的氨基的亲核反应十分敏感，生成N-取代异脲、N-取代亚胺碳酸酯、N-取代氨基甲酸酯的衍生物。 实际连接过程很简单，即载体先与CNBr短时间反应，洗去未反应CNBr，投入酶液即发生连接。 该法优点：1）可应用不同的载体；2）酶连接量高；3）固定化活力高。 注意问题：CNBr有毒，称量、溶解及活化反应均就在通风橱内进行。过量试剂可在pH11条件下，用过量漂白粉处理一晚后弃去。,HCl（盐酸） 稀：比较酸，感觉嘴里滑溜溜的，典型的呕吐物感，微辣。 浓：极度的酸，吐掉以后回味苦，然后整个嘴里发凉，10分钟后好转。 H2SO4（硫酸） 稀：淡淡的酸味，回味感觉油腻，微热，甜，无任何不适感。 较浓的（40%左右的）：超烫，感觉喝烫稀饭了，然后微甜感和痛感并存，持续2天才退（98%的纯正浓硫酸不敢喝）。 HNO3（硝酸） 稀：先是苦，然后整条舌头麻了，然后痛，起了白斑，持续疼痛，3-4天后消退，同时嘴里感觉大吸了一口汽车尾气。 浓：不敢喝 （猜测是浓硫酸的加强版）。 NaOH（氢氧化钠） 稀：基本上同浓Na2CO3（我尝过，咸），多一些辣感（对蛋白质腐蚀性强的都会有辣感 ）。 浓：含在嘴里十分的辣(可能是已经反应起来了) 然后舌头烧坏,呈黄色,肉腐烂，1个月不能说话,口里有赤痛感而且舌头麻木 有辛辣感半年后出院,说话变得不准,味觉几乎消失,嘴部留下疤痕（这东西对蛋白质的反应不是闹着玩的）。 CuSO4（硫酸铜） 一开始没味道，吐出后回味淡淡的苦涩（我的确尝过）。 BaCl2（氯化钡）：极苦咸，大约相当于MgCl2的加强版 CCl4（四氯化碳） 这个最恐怖了，整个嘴里感到烧塑料的味道，极浓郁，吐掉以后出现说不出的怪异甜味，直感觉全身松软 （的确，闻起来还可以，尝起来就郁闷了）。 Na2O2（过氧化钠） 一般的咸 （Na盐基本都这个味道）。 无水酒精 嘴里完全没味道，之后花露水的味道在鼻子里挥之不去。 FeCl3）（氯化铁） 凉，然后酸，与硬币放嘴里感觉差不多（Fe盐都这味道）。 AgNO3（硝酸银） 没味道。 稀Br2（溴）水溶液 极其浓重味道，感觉像汽车尾气与松节油混合的味（只能如此形容） Hg(NO3)2（硝酸汞） 很淡的味道，有点像味精和醋混合了 。 H2O2（双氧水） 特辣，赶紧吐了，之后就没什么事情了 。 还有一个百度知道里面的：极其微量的氰化物是苦的，宝贵资料啊。 乙酰水杨酸我试过有点酸，有点涩，最后有点苦尽甘来的那种感觉。 我尝过溴化氢，一不小心吸进去的。味道上没什么感觉，但是非常呛，吸进去很少，但是咳了一整个下午，一直到吃晚饭都反胃，印象深刻啊,4、硅烷化法,无机载体机械强度好、耐受有机溶剂的作用和微生物侵蚀能力强，可以再生，在广泛范围的pH、压力、温度下载体不改变结构，同时来源丰富、价格低廉。 无机载体支持物表面采用硅烷化反应引入功能团，进一步可通过不同的化学反应制成带有苯氨基、醛基等基团成为活性载体。然后连接酶蛋白 。 载体：多孔玻璃、多孔陶瓷、多孔氧化铝、磁性氧化铁等,1,2,3,与支持物表面硅烷醇或O-离子连接，相邻硅烷间还可以发生聚合。其产物烷胺基玻璃是带有有机功能团（氨基）的无机载体。进一步可通过不同的化学反应制成带有苯氨基、醛基等基团，成为活性载体。 例如，乳酸脱氢酶可通过此法偶联与多孔玻璃。 上述方法制备的固定化酶，其稳定性超过有机多聚物作为载体的固定化酶。,利用多功能试剂进行酶蛋白分子间的交联，酶分子与多功能试剂间形成共价键，得到立体交联的网架结构。,（三）交联法,常用的交联剂有： 戊二醛 双重氮联苯胺-2,2-二磺酸 1,5-二氟-2,4-二硝基苯 已二酰亚胺二甲酯。,戊二醛可直接参与酶蛋白分子的交联，便其作用机理不完全清楚。实验证明，酶蛋白分子中的赖氨酸参与了反应。可能过程如下：,多功能试剂制备固定化酶，可进一步分为： （1）单独与酶使用。 (交联酶法) （2）辅助蛋白、酶与之共同使用。 ( 酶辅助蛋白交联法) （3）酶吸附载体后再进行交联。 (吸附交联) （4）先与载体反应，形成多功能基团载体，然后再连接酶。(载体交联法) 直接交联酶法虽然操作简便，但固定化颗粒太细，活力往往不高。,（四）包埋法,将酶包裹于凝胶格子、或聚合物半透膜微胶囊中的方法。可分为凝胶包埋法和微胶囊化法。,1、凝胶包埋法（格子型）,常用载体：海藻酸、K-角叉菜（卡拉胶）、琼脂、三醋酸纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等。 方法：混合单体、交联剂和酶（于缓冲溶液中进行），然后加入催化剂，系统开始聚合。 固定化酶成型可分为凝胶后成型、边凝聚边成型两种。前者是在凝胶聚合后，将其切成小块，再经挤压后形成不规则颗粒。后者是在聚合过程中使之聚合成珠状。,卡拉胶：鹿角菜胶、角叉菜胶。是从某些红藻类海草中提炼出来的亲水性胶体，化学结构是由半乳糖及脱水半乳糖所组成的多糖类硫酸酯的钙、钾、钠、铵盐。由于硫酸酯结合形态的不同，可分K型、I型、L型。在果冻，软糖，冰激凌等食品工业应用广泛。,海藻酸：来自海藻的由D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸组成的多糖。可抑制大鼠肠道对锶(90Sr)吸收。除褐藻等海藻外，棕色固氮菌等细菌亦产生藻酸类型的多糖 。海藻酸为淡黄色粉末；无臭；几乎无味，在水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿中不溶，在氢氧化碱溶液中溶解。有助悬、增稠、乳化、粘合等作用。可用为微囊囊材，或作为包衣及成膜的材料。,以聚丙烯酰胺凝胶为例加以介绍： （1）单体：丙烯酰胺、丙烯酸、甲基丙烯酸 （2）双功能交联剂：N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis) （3）催化系统： 碱催化系统：TEMED（四甲基乙二胺）和过硫酸胺系统；-二甲基丙腈和过硫酸钾系统。 光催化：核黄素过硫酸胺系统 辐射、冰冻无氧辐射等。 （4）珠状聚合包埋过程：酶、保护剂、单体、交联剂、聚合催化剂混合后，立即在疏水相（一种乳化剂，与水有同样密度）的有机溶剂中分散成珠状凝胶。,举例：制备珠状聚丙烯酰胺包埋-半乳糖苷酶 酶液：酵母半乳糖苷酶100mg，溶于56ml磷酸缓冲液（0.05M, pH7.3）。其中含15-30%的单体、Bis 5%。 催化剂：含TEMED 0.6ml、200mg过硫酸铵的缓冲液4ml。 疏水相：1ml山梨聚糖倍半油酸与400ml甲苯-氯仿（290：110）混合. 反应与成型：与混合后迅速加到疏水相，搅拌分散。反应器为1L圆底烧瓶，一浆状搅拌器，240rpm，反应器中保持氮气（保护物料不受氧化，保持产品质量，还能保证安全） 。4聚合反应30min 过滤、洗涤：砂芯漏斗过滤；用500ml缓冲液洗涤，再在0.1M NH4HCO3中搅拌洗涤60min。过滤,2、微胶囊化法,酶溶液被包裹在膜内，膜既能使酶存在于类似于细胞内的环境，又阻止了酶的脱落或直接与外环境接触。又分为界面沉淀法和界面聚合法。,（1）界面沉淀法 某些高聚物在在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成皮膜（沉淀析出），从而将酶包裹的方法。 酶溶液在与水互不相溶的有机相中乳化，使用油溶性表面活性 剂，可形成油包水的微滴。再将溶于有机溶剂的高聚物加入搅拌着的乳化液中，然后加入一种不能溶解高聚物的有机溶剂，使高聚物在油-水界面上沉淀、析出、形成膜，最后转移入水相，制成固定化酶即所谓 “人工细胞”。,微囊直径与乳化的程度有关，乳化分散的好坏又与搅拌的速度有关。 制作膜材料的高聚物： 硝酸纤维素 聚苯乙烯 聚甲酯丙烯酸甲酯等 优点：条件温和，不引起酶的失活。 缺点：除去膜上有机溶剂比较麻烦。,举例：界面沉淀法制备“人工细胞” 材料：10%血红蛋白溶液(Whatman No42滤纸过滤) 酶液：悬浮于10%血红蛋白溶液 有机相：100ml水饱和的乙醚加1ml Span 85（水-油乳化剂），用前配制。 硝酸纤维素溶液：4%硝酸纤维素的乙醇-乙醚（1：3）溶液，蒸发至原先重量的20%，然后加乙醚至原体积，重新溶解。 苯甲酸正丁酯- Span 85溶液：1ml Span 85加于100ml苯甲酸正丁酯（用前配制）。 Tween 20：50%和1%的水溶液（去乳化和洗涤）。 磁力搅拌器、磁力搅棒、烧杯,方法： 血红蛋白-酶液乳化：25ml酶液加等体积有机溶液，立即2600rpm磁力搅拌5秒钟。 加成膜材料，乳化：25ml硝酸纤维素溶液，继续磁力搅拌60秒。 微囊沉降：4放置45min。若全部沉降，去上清（约4ml），否则离心（350g，5min）去上清。 成膜：去大部分上清后，立即加苯甲酸正丁酯- Span 85溶液30ml，1200rpm搅拌30秒。4放置30min。微囊沉降完全，否则离心（350g，5min），去上清。 微囊转移至水相：加25ml50%Tween 20，2900rpm搅拌分散30秒，减至1200rpm，同时加入25ml水，再搅拌30秒，用200ml水稀释。离心（350g，5min），去上清。 洗涤：1%Tween 20反复洗涤，直到不再含有血红蛋白和苯甲酸正丁酯气味。最后悬浮于0.9%NaCl溶液中,(2)界面聚合法：,化学制微囊的方法。在油-水界面发生聚合反应而成膜。 成膜材料：尼龙610、聚酰胺、聚脲等。 主要过程: (以尼龙膜制备为例) 酶液与聚合单体混合：酶溶于10%血红蛋白溶液，加已甲叉二胺水溶液。 乳化：分散相为含1% Span 85的氯仿-环已烷。 聚合：加溶于有机相的癸二酰氯。 去乳化、洗涤：Tween去乳化和洗涤，转移至水相。,表1固定化化酶制备方法及特性比较,50,四、固定化载体材料新进展,（1）传统载体材料的改性 利用有机聚合物对传统无机载体材料改性修饰： 右旋糖苷对硅胶表面改性修饰可改善其表面的生物亲和性， 用于固定 -葡萄糖苷酶时可大大提高了酶的负载量。 原子转移自由基聚合(ATRP)方法，在Si(111)表面进行甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)的接枝聚合则在硅表面形成刷状 P(GMA)，并可调节P(GMA)侧链的长度,51,上述复合载体的传质性能良好，侧链富含能与酶共价连接的环氧基，故提高了固定化葡萄糖氧化酶(GOD)的载酶量，达到 0.2mg/cm2,52,无机多孔材料硅藻土在低压下强化吸附壳聚糖，经戊二醛活化后共价固定化青霉素酰化酶时，明显提高了酶的储存稳定性和热稳定性。 多孔且富含氨基的壳聚糖覆盖在 SiO2 表面上并采用多种方式活化氨基时，共价偶联胰蛋白酶的效果良好 。,53,有机高分子载体改性 甲基丙烯酸甲酯(MMA)接枝聚合到尼龙膜上，或先把苯乙烯接枝聚合到尼龙膜上再将 MMA接枝聚合到聚苯乙烯包覆层上，在膜表面引入了大量的反应性酯基，再借助己二胺和戊二醛活化并共价固定化 -半乳糖苷酶，膜上的载酶量达到 0.5mg/cm2。 一种聚合物对另一种聚合物的表面改性修饰： Ye 等先合成聚丙烯腈-顺丁烯二酸超滤中空纤维膜，用 1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCHCl)和 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)将低分子量的壳聚糖缩合覆盖到膜表面，形成双层仿生膜并用戊二醛将脂肪酶偶联到壳聚糖上，从而有效地降低了膜骨架对酶促反应的干扰，提高了酶对酸碱和热的耐受性。,54,55,2、新型载体材料,磁性载体：磁性载体具有特殊的磁响应性，可以借助外部磁场从反应体系中快速简便地富集、分离、回收固定化酶，从而可以随时控制酶促反应，提高酶的使用效率。 纳米级的铁氧化物则是使用较为广泛的一类磁性载体材料。 磁性高分子微球可以通过共聚、表面改性等化学反应在微球表面引入多种反应性功能基，对酶进行共价连接固定。,56,57,环境敏感性载体： 均相催化和异相分离特点的环境敏感性材料成为固定化酶的新型载体，通过调节反应体系的温度或 pH 实现了这一目的。 Kato 等用 N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)和丙烯酰胺(AAM)共聚合成了温敏性凝胶载体，它具有低临界溶解温度(LCST)特性，即可通过升温或降温来调节凝胶在水中的沉淀或溶解，提高了固定化淀粉葡萄糖苷酶(AG)的催化能力。 将适当量的聚乙二醇(PEG)接枝到壳聚糖上而制得的温敏性高分子水凝胶载体，随着温度的改变能在溶胶-凝胶之间转变。 先将木瓜蛋白酶与 N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯(NAS)反应，再利用自由基溶液聚合反应，制备的固定化木瓜蛋白酶具有pH敏感相分离特性，兼有溶液酶和固相酶两者的优点,58,导电载体： 导电载体具有一定的电子传导性，作为固定化酶的一类特殊载体，在基于酶电极的生物传感器领域得到了广泛应用。导电载体材料主要包括两类，导电高聚物载体和导电复合载体，前者一般是具有共轭结构和导电能力的有机高聚物,如聚苯胺(PAn)、聚噻吩(PTh)、聚吡咯(PPy)及其衍生物等，后者则是在导电材料中复合一些特殊物质而制得的导电复合载体。,59,第二节 固定化细胞,采用物理或化学的方法固定微生物细胞，是利用酶或酶系的一条捷径。70年代迅速发展起来的一项技术。沿用了固定化酶的方法，但其应用速度超过的固定化酶。,优点： （1）免去破碎细胞提取酶的复杂过程。 （2）酶在细胞内环境中，稳定性更高，固定后酶活损失较少。 （3）可催化较复杂的反应（复合酶系统）。 （4）制备成本低。,缺点： （1）多适用于胞内酶； （2）对底物和产物有一定限制：要求底物、产物易透过细胞膜。 （3）产物较复杂，有副反应，给提取增加了难度。 制备方法与固定化酶相类似，但以吸附法、包埋法应用最多。其它方法也有尝试，如超过滤、共价结合、交联法等。,一、包埋法,载体：琼脂、 明胶、 聚丙烯酰胺凝胶、 卡拉胶、 血纤维蛋白、 环氧树脂等。,1、明胶包埋法:明胶戊二醛包埋链霉菌细胞 实例:葡萄异构酶产生菌玫瑰暗黄链霉菌固定化,（1）戊二醛处理菌体细胞：10克菌体（湿重），0.1ml25%戊二醛，混匀。 （2）明胶液配制：1克明胶，加8ml 水溶解。 （3）固定制膜：混合（1）和（2），铺成2-3mm厚的膜，0-5凝固1h 。 （4）戊二醛处理：0.25%戊二醛溶液75ml，浸泡24-48h。 （5）成型：机械破碎，成10目大小，蒸馏水洗涤待用。,2、聚丙烯酰胺凝胶包埋法 大肠杆菌和产氨短杆菌已分别用于工业化生产L-天冬氨酸、L-苹果酸。,聚丙烯酰胺凝胶包埋大肠杆菌（L-天冬氨酸酶）： （1）材料准备： 菌悬液：E. coli ATCC II303，1kg菌体（湿重）加2L生理盐水，冷至8。 单体溶液：丙烯酰胺750g，N,N甲叉双丙烯酰胺40g，溶于2.4L水, 冷至8。,（2）固定化 混合菌悬液与单体悬液,加入催化剂:100ml25%-二甲基丙腈,500ml1%过硫酸钾。 聚合：20-25，15-20min（聚合反应约在5min后开始。温度升高，当温度升至30时，迅速用冰水冷却）。 成型：切成3-4mm颗粒，水洗。 （3）活化细胞 固定化细胞在含有1mM Mg2+的1N反丁烯二酸铵（pH8.5）中，3724-48h。（天冬氨酸酶活力可提高9-10倍）。,3、海藻酸盐包埋法 海藻酸为d-甘露糖醛酸和l-古罗糖醛酸通过1,4糖苷键联接而成的聚合物。 （1）海藻酸钠溶液配制：6g溶于96ml水（约6%浓度）。 （2）混合菌体：0.3g湿菌体/ml (30%W/V)。 （3）固化和成型：固化液（含Ca2+、Zn2+、Al3+等多价阳离子溶液，如0.1MCaCl2），将海藻酸钠与菌体的混合液用针形管滴入固化液中。 （4）硬化与洗涤：颗粒放置于0.1M CaCl2浸泡1小时进一步固化。 缺点：在高浓度的电解质（K+、Na+等）中颗粒不稳定。 Ca2+等多价离子会在磷酸缓冲溶液沉淀，导致机械强度降低，和重新溶解。,二、吸附法,细胞表面带有电荷，因此可以通过离子交换或吸附作用结合于载体。该法简便，易于再生，但结合力弱，易脱落。工业应用上较少。 阴离子树脂：固定放线菌（葡萄糖异构酶，生产果糖） DEAE-纤维素：固定巨大芽 孢杆菌（青霉素酰化酶，生产6-APA）。,三、其它 交联法有少量尝试，如含有天冬氨酸酶的大肠杆菌曾用多种双功能试剂交联，发现只有戊二醛交联能获得有活力的制剂，但所得固定化细胞颗粒太细，机械强度差。 共价结合法：少数细菌表面可能存在氨基，如微球菌，可以碳二亚胺脱水与CM-纤维素连接。细胞无生存能力，但仍保留组氨酸氨裂合酶的活性，故引起人们注意，有等进一步的发展。,第三节 固定化酶和细胞的应用,一、在工业方面的应用,1、氨基酸工业,（1）利用固定化酰化酶（细胞）生产L-氨基酸 DL氨基酸拆分,工业上化学合成氨基酸都是无光学活性的DL型外消旋混合物。须将它进行光学拆分以获得L型氨基酸。 外消旋氨基酸拆分方法:物理、化学和生物学方法，其中以酶法最有效，能够生产纯度较高的L-氨基酸。反应式如下：,（2）氨基酸的转化生产 门冬氨酸的生产：利用固定化门冬氨酸酶（细胞，E. coli）生产 HOOCCH=CHCOOH+NH3L-门冬氨酸 反丁烯二酸 L-丙氨酸