银杏叶提取物国际商务标准编制说明.doc

银杏叶提取物 国际商务标准编制说明一、工作简况本标准的制定工作，是由中国医药保健品进出口商会提出而进行的，由中华人民共和国商务部归口，中国医药保健品进出口商会标准化技术委员会负责解释。本标准由浙江康恩贝制药股份有限公司负责起草，北京绿色金可生物技术股份有限公司、晨光生物科技集团股份有限公司、重庆科瑞南海制药有限责任公司和上海诺德生物实业有限公司等单位复核。标准主要起草人为王如伟、方玲、姚建标、叶剑锋、姚德中、苏一多、章江生、雷凯琴、胡江宁、何厚洪、吴旭明、吴健、乔洪翔。二、标准制订的目的及意义银杏叶提取物(Ginkgo leaves extract)是以银杏叶为原料经提取分离制成的植物提取物，是我国乃至世界上重要的天然药物原料之一。中国是银杏的主产地，由于竞争激烈，各厂家生产设备及工艺水平参差不齐，部分银杏叶提取物厂家为了使产品主要化学指标符合客户标准，采用水提、半萃取，掺入银杏树皮、根皮与银杏叶共同提取，或掺入含有芦丁、槲皮素或山奈素结构的物质共同提取，使用甲醇、工业乙醇提取，这些不当的商业行为，不仅混乱了产品的质量构成，还严重干扰了市场秩序，损害了产品、行业乃至国家声誉，使得银杏叶提取物出口行业境况举步维艰。随着美国药典、欧州药典对EGB质量标准的修订和不断改进，国外企业在国内的银杏种植基地与产业基地逐步发展壮大，势必对我国的EGB行业构成实质性的冲击。目前，如何跟进美国药典、欧洲药典银杏叶提取物标准，提高国内EGB的标准，保证银杏叶提取物的质量稳定性，保证人民用药安全是第一紧迫任务。为了进一步规范国内银杏叶提取物在生产、贮存、运输过程中的质量管理，特制定本标准。 三、国内外有关法律法规和其他标准的关系银杏叶提取物标准已收载于中国药典2010年版一部、USP36-N31和EP7.0。不同药典标准中，银杏总黄酮醇苷、银杏内酯及银杏酸的样品前处理方法、含量测定方法、含量计算方法及标准限度等方面均存在一定的差异。四、标准的制订与起草原则本标准遵循中华人民共和国药品管理法、现行版国家药品标准工作手册和中国药品检验标准操作规范的有关规定，参照中国药典2010年版、USP36-NF31和EP7.0中银杏标准、及GB 9685 食品容器、包装材料用添加剂使用卫生标准等，制定本标准。五、确定各项技术内容 样品来源：银杏叶提取物主要由浙江康恩贝制药股份有限公司，样品批号为（120204、120318、120505等）；部分样品为市售银杏叶提取，样品批号为（110901、111104、111224等）；对照品芦丁、槲皮素、山奈酚、异鼠李素、白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果新酸、总银杏酸对照品、银杏叶对照提取物：中国食品药品检定研究院提供。1 工艺要求参照中国药典2010年版一部银杏叶提取物标准，本品为银杏科植物银杏（Ginkgo biloba L.）的干燥叶经加工制成的提取物。其制法为：取银杏叶，粉碎，用乙醇和水一定比例混合溶液提取，浓缩，稀释，沉淀，经大孔吸附树脂吸附、洗脱，洗脱液回收乙醇，干燥，粉碎，过80目筛，即得。2 感官要求对本品三批样品，嗅其气味和尝其滋味；另取试样适量置于白色瓷盘中观察其色泽、外观，并检查有无异物，结果见表1表1 银杏叶提取物感官要求批号120204120318120505色 泽浅棕黄色至棕褐色浅棕黄色至棕褐色浅棕黄色至棕褐色气 味气微，味微苦气微，味微苦气微，味微苦外 观均匀，无可见异物的粉末均匀，无可见异物的粉末均匀，无可见异物的粉末根据观察结果，本标准规定银杏叶提取物的感官要求描述为：本品为浅棕黄色至棕褐色粉末；气微，味微苦；外观均匀，无可见异物。3 理化指标表2 理化指标项 目指 标检验方法来源鉴别（1）、（2）应符合规定中华人民共和国药典（2010版）一部银杏叶提取物 （鉴别）指标成分含量总黄酮醇苷含量，% 24.0中华人民共和国药典（2010版）一部银杏叶提取物 （含量测定）：总黄酮醇苷总萜类内酯含量，% 6.0附录A2，参考美国药典（USP36-NF31）银杏叶提取物标准中银杏萜内酯测定的色谱条件和中华人民共和国药典（2010版）一部银杏叶总萜内酯测定的供试品制备方法；黄酮苷元峰面积比槲皮素与山奈酚峰面积比应为0.7美国药典（USP36-NF31）银杏叶提取物 （IDENTIFICATION）：B.HPLC异鼠李素与槲皮素峰面积比 0.1芦丁含量，% 4.0附录A3，参考中华人民共和国药典（2010版）一部银杏叶提取物总黄酮醇苷含量测定方法，改变了流动相比例和供试品制备方法；游离槲皮素含量，% 0.5附录A4，参考中华人民共和国药典（2010版）一部银杏叶提取物总黄酮醇苷含量测定方法，仅改变了供试品制备方法；游离山奈酚含量，% 0.5游离异鼠李素含量，% 0.2总银杏酸含量，mg/kg 5.0附录A5，检测方法参考中华人民共和国药典（2010版）一部银杏叶提取物标准中银杏酸限度的检测，供试品制备方法及标准参考EP7.0银杏叶提取物中银杏酸限度检测方法的标准粒度（80目筛通过率），% 95中华人民共和国药典（2010版）二部附录 B第二法水分，% 5.0中华人民共和国药典（2010版）一部附录 IX H 水分测定法第一法炽灼残渣，% 0.8中华人民共和国药典（2010版）一部附录 IX J重金属（以Pb计），mg/kg 10中华人民共和国药典（2010版）一部附录 IX E铅（Pb），mg/kg 1.0中华人民共和国药典（2010版）一部附录 IX B镉（Cd），mg/kg 0.3中华人民共和国药典（2010版）一部附录 IX B砷（As），mg/kg 1.0中华人民共和国药典（2010版）一部附录 IX B汞（Hg），mg/kg 0.1中华人民共和国药典（2010版）一部附录 IX B3.1 鉴别按中华人民共和国药典（2010版）一部银杏叶提取物【鉴别】项下要求：鉴别（1） 取本品0.2g，加正丁醇15ml，置水浴中温浸15分钟并时时振摇，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取银杏叶对照提取物0.2g，同法制成对照提取物溶液。照薄层色谱法（药典附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各3L，分别点于同一以含0.4 %醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5:3:1:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3%三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯（365mn)下检视。供试品色谱中，在与对照提取物色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。三批提取物鉴别结果见下图。鉴别(2) 照薄层色谱法（药典附录VI B)试验，吸取含量测定项下萜类内酯的供试品溶液和对照品溶液各15L，分别点于同一以含0.4 %醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇（10:5:5:0.6)为展开剂，在15C以下展开，取出，晾干，用醋酐蒸气熏15分钟，在140160C加热30分钟，放冷，置紫外光灯（365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。三批提取物鉴别结果见下图。3.2 总萜类内酯含量测定 银杏萜类内酯是银杏叶提取物中最重要的活性成分之一。对比国内外药典标准，针对内酯的含量检测，在检测器、样品前处理、色谱条件、含量计算方式等方面，均存在一定差异。检测器方面：目前主要采用的检测器有ELSD（如Ch.P、USP）和折光仪检测器（如EP）两种，国内外很多报道的文献，大多采用ELSD检测器，因此本标准仍采用ELSD检测器来检测银杏叶提取物总萜类内酯。含量计算方式方面：Ch.P标准采用外标两点法对数方程来分别计算各分内酯的含量；USP标准采用标准曲线法对数方程来分别计算各分内酯的含量；EP标准采用苯甲醇为对照分别计算各分内酯的含量（折光仪检测器，暂不考虑）。研究认为，Ch.P标准的两点法和USP标准的标准曲线法，本身并不存在太大差异，但是由于两点法受对照品浓度大小的限制，加之国内银杏叶提取物规格众多，容易出现同一个样品中，个别内酯测定的峰面积不在对照品相应两点范围内，如此计算所得结果准确性存在一定问题；同时，两点法所得k、b值的重复性，不如标准曲线法所得k、b值重复性好，测定误差相对较大。因此，为保证银杏叶提取物总萜类内酯测定结果更准确、可靠，本标准参考USP银杏叶提取物标准，采用标准曲线法对数方程来分别计算各分内酯的含量。样品前处理及色谱条件方面：Ch.P2010银杏叶标准采用酸性氧化铝柱纯化，流动相甲醇-THF-水系统测定，银杏叶提取物标准采用乙酸乙酯萃取，流动相正丙醇-THF-水系统测定； USP标准采用硅藻土柱纯化，流动相甲醇-水系统梯度洗脱；EP标准采用硅藻土柱纯化，流动相THF-甲醇-水系统测定。本研究首先对供试品前处理方法进行了对比研究，供试品批号120204、120318，结果如下表。表3不同前处理方法对比前处理方法试剂来源、规格总内酯含量/（%）120204 120318乙酸乙酯萃取国药，分析纯7.69 7.01硅藻土柱纯化国药进口分装7.78 7.18 结果表明，乙酸乙酯萃取和硅藻土柱纯化相比，柱纯化测定结果相对含量稍高，总体上总内酯含量并没有太显著差异。由于萃取法操作步骤较多，过程比较复杂繁琐，柱纯化方法操作更便捷，在保证含量测定结果没有显著差异的情况下，优选柱纯化方法。采用同一批供试品（批号120204）对不同柱纯化填料进行了考察，结果见下表。表4不同前处理填料对比前处理方法试剂来源、规格填料用量/（g）洗脱剂/用量总内酯含量/（%）硅藻土柱纯化1Merck15g乙酸乙酯/100mL7.88硅藻土柱纯化2Agela15g乙酸乙酯/100mL7.32硅藻土柱纯化3国药进口分装15g乙酸乙酯/100mL7.80酸性氧化铝柱纯化国药，100-200目3g甲醇/50mL7.85对比不同填料，只有Agela厂家的硅藻土前处理测定结果偏低， Merck和国药进口分装的硅藻土处理测定的含量和酸性氧化铝处理（暂参考Ch.P银杏叶标准，酸性氧化铝3g，200-300目，柱内径1cm，甲醇湿法装柱；供试品取样0.15g，）测定结果均相近，没有显著性差异。相比于硅藻土，采用酸性氧化铝方法填料便宜，所用试剂量较少，检测成本较低。因此，对该填料开展了进一步研究（供试品批号120204），结果见下表。表5填料用量比较前处理方法填料用量/（g）洗脱剂/用量总内酯含量/（%）酸性氧化铝柱纯化2g甲醇/50mL7.873g7.824g7.685g7.32表6洗脱剂用量比较前处理方法填料用量/（g）洗脱溶剂/用量总内酯含量/（%）酸性氧化铝柱纯化3g甲醇/20mL7.31甲醇/30mL7.61甲醇/40mL7.75甲醇/50mL7.84甲醇/60mL7.80上述结果表明，供试品取样0.15g，采用经活化的酸性氧化铝3g，湿法上柱，柱径1cm，再用甲醇40-50mL洗脱，可纯化样品，经HPLC-ELSD检测，各内酯分离度良好，含量准确。综合上述研究结果，本标准参照USP银杏叶提取物标准和Ch.P银杏叶、银杏叶提取物标准，对银杏叶提取物总萜类内酯的检测方法进行了修改，验证结果如下。照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录VI D）测定仪器：Agilent 1260系列高效液相色谱仪（ELSD检测器）3.2.1 色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：Agilent Zorbax XDB C18 2504.6mm 5um 流动相：流动相A 甲醇-流动相B 水按比例梯度洗脱（Post time：10 min）；Time(min)A (%)B (%)0352548755235364810052036401000检测器：HPLC-ELSD柱温：25 ；流速：1.0 mL/min。进样量：对照品溶液、供试品溶液各10L。理论塔板数以白果内酯峰计算应不低于 2500。3.2.2 供试品溶液制备取本品 0.15 g，精密称定，加甲醇分次溶解，加入装有3 g酸性氧化铝的层析柱（酸性氧化铝：200-300目，经活化处理；层析柱：柱径0.8-1.0 cm），以甲醇50 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，甲醇溶解并定容至5 mL量瓶，若有必要，可用超声波处理。用 0.45 m 微孔滤膜过滤，即得。3.2.3 对照品溶液制备称取白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C对照品适量（精确至0.01mg），加入甲醇溶解，制备得每1 mL含白果内酯 2.4mg、银杏内酯A 1.6mg、银杏内酯B 0.8mg、银杏内酯C 0.8mg的混合对照品甲醇溶液。再分别稀释2倍、4倍、8倍、16倍，制备得到5份已知浓度的混合对照品溶液，浓度系列见表A2。标准使用溶液用 0.45 m 微孔滤膜过滤后待测。3.2.4 标准曲线试验精确称取白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C对照品适量，加甲醇超声溶解，制备混合内酯对照品浓配液。按比例稀释5个浓度的混合内酯对照品溶液，照含量测定项下的方法测定，经线性回归后得回归方程，结果见下表及图。表7 内酯标准曲线及线性范围内酯标准曲线R2线性范围/ugBBy = 1.476x + 2.1330.9981.67-25.13GAy = 1.505x + 2.0800.9990.85-13.83GBy = 1.356x + 2.0730.9990.86-13.01GCy = 1.501x + 2.0600.9990.66-10.003.2.5仪器精密度试验取上述混合内酯对照品溶液，连续进样5次，测定。各成分峰面积RSD均小于2%，仪器精密度良好。结果见下表。表8 仪器精密度试验(n=5)序号BBGCGAGB1443.49173.48287.53159.042445.04174.06287.76159.253446.36174.84288.29159.834445.44174.0 287.38159.325445.74174.14287.61158.89A平均445.3 174.2 287.7 159.3 RSD/（%）0.21 0.22 0.12 0.23 3.2.6 重复性试验取供试品（批号120204），于同一天内称取5份样品测定，按3.2.2制备供试品溶液，测定总内酯含量，结果见下表。表9 重复性试验(n=5)序号总萜类内酯含量/（%）17.8228.0237.6447.9257.72 平均含量/（%）7.82RSD/（%）1.943.2.7 中间精密度试验取供试品（批号120204），在不同天内由不同人员取样、并用不同仪器测定5次，测定结果见下表。 表10 中间精密度试验(n=5)序号总萜类内酯含量/（%）17.5827.8637.8148.0557.67 平均含量/（%）7.79RSD/（%）2.323.2.8 准确度试验根据重复性试验测定结果，供试品120224总内酯含量为7.82%，含BB 3.16%、GC 1.04%、GA 2.38%、GB 1.24%。精密称取各银杏内酯对照品，加甲醇制成1 mL含BB 1.2mg、GC 0.4mg、GA 0.9mg、GB 0.45mg的混合内酯对照品贮备液。取本品（批号120204）约75mg，精密称定，等分为三组，各组分别加入对照品贮备液1.6mL、2.0mL、2.4mL，照3.2.2制备供试品溶液。照含量测定方法测定，计算回收率，结果见下表。表11 BB加样回收率结果样品取样量/mg样品中含量/mg对照品加入量/mg测得总量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%74.62.3571.924.2297.299.112.4375.22.3761.924.34102.376.52.4171.924.3198.673.42.3322.44.7299.575.62.3892.44.7196.677.32.4432.44.89101.874.12.3422.885.1296.575.82.3952.885.2097.476.92.432.885.37102.1表12 GA 加样回收率结果样品取样量/mg样品中含量/mg对照品加入量/mg测得总量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%74.61.7751.443.16 96.398.542.075.21.791.443.19 97.576.51.8211.443.24 98.273.41.7561.83.55 99.475.61.7991.83.55 97.277.31.841.83.68 102.374.11.7642.163.45 96.675.81.8042.163.58 100.676.91.832.163.56 98.8表13 GB加样回收率结果样品取样量/mg样品中含量/mg对照品加入量/mg测得总量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%74.60.9251.442.3498.698.612.1275.20.9321.442.3296.376.50.9491.442.3597.273.40.9151.82.6696.875.60.9371.82.7299.177.30.9591.82.79101.574.10.9192.163.0397.975.80.942.163.15102.476.90.9542.163.0697.7表14 GC加样回收率结果样品取样量/mg样品中含量/mg对照品加入量/mg测得总量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%74.60.7761.442.1897.899.322.4475.20.7821.442.2098.376.50.7961.442.26101.973.40.7681.82.5096.175.60.7861.82.5698.477.30.8041.82.65102.674.10.7712.162.9299.675.80.7882.162.8896.976.90.82.163.01102.3测定结果显示，本方法四个内酯的回收率在98-100%之间，回收率RSD小于3%，故本检测方法准确度高，实际可行。3.2.9 耐用性试验本研究对不同品牌色谱柱耐用性进行了初步考察，色谱柱信息及测定结果如下图：色谱柱1：Agilent XDB C18 250*4.6mm 5m；色谱柱2：Agilent SB C18 250*4.6mm 5m；色谱柱3：Kromasil 100-5- C18 250*4.6mm；色谱柱4：Phenomenex C18 250*4.6mm 5m ； 从上图可见，采用上述三个厂家四种色谱柱均可有效分离银杏内酯成分，而同品牌的色谱柱，C18 1504.6mm 5m的色谱柱对目标成分的分离度较差。为保证各内酯能够有效分离，建议采用C18 2504.6mm 5m 色谱柱，品牌方面，建议安捷伦（Agilent）；菲罗门（Phenomenon）。3.2.10 结果计算供试品中各萜类内酯组分含量以质量分数Xi计，数值以%表示，按公式（A1）计算，分别计算白果内酯、银杏内酯A 、银杏内酯B、银杏内酯C的百分含量。将各组分的百分含量累加计算总萜类内酯的百分含量，按公式（A2）计算。（A1） （A2）式中：X1供试品中总萜类内酯的质量分数，%；Xi某萜类内酯组分含量，%；ci从标准曲线中求得的供试品溶液中某组分含量，单位为毫克每毫升（mg/mL）；Vi供试品溶液总体积，单位为毫升（mL）；mi供试品质量，单位为毫克（mg）。3.2.11 样品测定 取本品0.15g，精密称定，按3.2.2和3.2.3制备供试品和对照品溶液，测定。分别计算分内酯和总内酯含量。多批银杏叶提取物含量测定结果见下表。表15 银杏叶提取物总萜类内酯含量测定结果样品来源批号总萜类内酯/（%）浙江康恩贝1202047.85浙江康恩贝1203187.12浙江康恩贝1205058.36市售提取物11109016.84市售提取物21111047.03市售提取物31112247.37参考Ch.P2010银杏叶提取物标准，本标准规定银杏叶提取物中总萜类内酯含量不得低于6.0%。3.3 黄酮苷元峰面积比中国药典2010年版和USP32-NF27收载的银杏叶提取物质量标准中，均规定了黄酮类成分的峰面积比，槲皮素（Q）：山奈酚（K）峰面积比应为0.81.2，异鼠李素（I）：槲皮素应大于0.15。多年的研究经验表明，黄酮苷元峰面积比可在一定程度上反映银杏叶提取物的内在质量，为杜绝掺假，规范行业标准，应严格加以控制。本标准参照中国药典2010年版一部银杏叶提取物标准【检查】黄酮苷元峰面积比 项下要求，按含量测定项下的总黄酮醇苷色谱计算，样品测定结果见下表。表16 黄酮苷元峰面积比结果批 号120204120318120505对照提取物Q/K1.030.920.960.98I/Q0.320.440.380.36参考中国药典2010年版银杏叶提取物标准，本标准规定，槲皮素与山奈酚的峰面积比应为0.8-1.2，异鼠李素与槲皮素的峰面积比值不小于0.15。3.4 芦丁限量 照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录VI D）测定该检测方法完成参照中华人民共和国药典（2010版）一部银杏叶提取物 【含量测定】项下总黄酮醇苷的色谱条件进行测定，仅改变了供试品制备方法和流动相比例。仪器：Agilent 1260系列高效液相色谱仪（UV检测器）3.4.1 色谱条件与系统适用性试验色谱柱：Diamonsil C18 1504.6mm 5m；流动相为A 甲醇-B 0.4磷酸梯度（38:62）；流速1.0mL/min；柱温30；检测波长为360nm；进样量10L。理论板数按芦丁峰计算，应不低于2500。3.4.2 仪器精密度试验取芦丁对照溶液（浓度0.208mg/mL），重复进样6次，测得芦丁RSD1.2。3.4.3 标准曲线试验精密称取经五氧化二磷干燥至恒重的芦丁对照品适量，加甲醇制成贮备液，然后加甲醇稀释成每1mL中含芦丁为13.0、26.0、52.0、104.0、208.0、416.0g的溶液，照含量测定项下的方法测定，经线性回归后得回归方程为y = 18.548x + 4.4136，r=0.9999。 结果表明，芦丁浓度在13.0-416.0g/mL的浓度范围内呈良好线性关系，标准曲线如下：3.4.4 供试品溶液制备取本品细粉约35 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加 70甲醇溶液适量，使溶解，并稀释至刻度，摇匀，用 0.45 m 微孔滤膜过滤，即得。3.4.5 溶液稳定性试验 取供试品（批号120204）制成的供试液，分别于0、2、4、6、16、24小时，进样10L，记录色谱图，结果供试品中芦丁峰面积的RSD为1.52 %（n=6），表明本品溶液在24小时内稳定。3.4.6 重复性试验取供试品（批号120204），于同一天内称取5份样品测定，芦丁平均含量为2.95%，RSD为0.96（n=5）。3.4.7 中间精密度试验取供试品（批号120204），在不同天内由不同人员取样、并用不同仪器测定5次，芦丁平均含量为2.81%，RSD为1.85（n=5）。 3.4.8 准确度试验取供试品（批号120204）约350mg，精密称定，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品贮备液；精密称取对照品芦丁适量，加甲醇制成0.21mg/mL的对照品贮备液。精密移取5mL供试品贮备液至9个10mL量瓶，等分为三组，各组分别加入对照品贮备液2mL、2.5mL、3mL，加甲醇稀释至刻度。照含量测定方法测定，计算回收率，结果见下表。表17 芦丁加样回收率结果对照品加入量/mg样品中含量/mg测得总量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%0.420.5310.959101.998.721.520.420.5310.94899.30.420.5310.9497.40.5250.5311.04497.70.5250.5311.056100.00.5250.5311.04998.70.630.5311.14797.80.630.5311.15198.40.630.5311.14497.33.4.9 耐用性试验本研究对不同品牌色谱柱耐用性进行了初步考察，色谱柱信息及测定结果如下：色谱柱1：Diamonsil C18 1504.6mm 5m；色谱柱2：Diamonsil C18 2504.6mm 5m；色谱柱3：Agilent Zorbax SB C18 1504.6mm 5m；色谱柱4：Agilent Zorbax XDB C18 1504.6mm 5m；从上图可见，采用上述四种色谱柱均可有效分离芦丁成分，但采用色谱柱2时，芦丁相对保留时间大大延后，为提高检测效率，建议采用C18 1504.6mm 5m色谱柱，品牌方面，暂建议采用安捷伦或迪马（一代）公司产品。3.4.10 结果计算供试品中芦丁含量以质量分数X2计，数值以%表示，按公式（A3）计算：（A3）式中：X2供试品中芦丁的质量分数，%；Ax2供试品溶液中芦丁的峰面积； As2对照品溶液中芦丁的峰面积； V2供试品溶液的体积，单位为毫升（mL） ；c2对照品溶液中芦丁的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；m2供试品质量，单位为毫克（mg）。3.4.11 样品测定 取本品35mg，精密称定，按3.4.4制备供试品溶液。照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录D）测定，精密量取10L，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取芦丁对照品溶液适量，同法测定，按外标法以峰面积计算，即得。多批银杏叶提取物芦丁含量测定结果见下表。表18 银杏叶提取物芦丁含量测定结果样品来源批号含量/%浙江康恩贝1202042.87浙江康恩贝1203182.72浙江康恩贝1205053.01中检所对照提取物110866-2002022.89市售提取物11109013.49市售提取物21111045.12市售提取物31112243.87结论：上述方法学试验表明，HPLC法测定游离芦丁含量方法可行，订入本标准。自然界的银杏叶中，游离芦丁含量是有一定范围的，按照中国药典标准制备的银杏叶提取物中，游离芦丁含量也不会很高，我公司对不同厂家银杏叶提取物以及中检所提供的银杏叶提取物对照品，测定游离芦丁含量，结果均在2%3%左右，而从市场采购的部分银杏叶提取物，经检测其游离芦丁含量存在较大差异，见表8。欧洲药典中虽然没有明确控制芦丁含量，但从我公司多年的销售经验看，很多欧盟国家的客户均对银杏叶提取物中芦丁含量进行了限度要求，大部分客户要求芦丁含量为小于3%。为保证银杏叶提取物质量，防止国内一些不当商业行为扰乱市场秩序，本标准规定，银杏叶提取物中芦丁含量不得高于4.0%。3.5 游离槲皮素、游离山奈酚和游离异鼠李素限量 照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录VI D）测定该检测方法完成参照中华人民共和国药典（2010版）一部银杏叶提取物 【含量测定】项下总黄酮醇苷的色谱条件进行测定，仅改变了供试品制备方法。仪器：Agilent 1260系列高效液相色谱仪（UV检测器、DAD检测器）、Agilent 1100系列高效液相色谱仪（DAD检测器）3.5.1 色谱条件与系统适用性试验色谱柱：Diamonsil C18 1504.6mm 5m；流动相为A 甲醇-B 0.4磷酸（50:50）；流速1.0mL/min；柱温30；检测波长为360nm；进样量10L。理论板数按槲皮素峰计算，应不低于2500。3.5.2 供试品溶液制备精密称定银杏叶提取物粉末 35 mg，置10 mL容量瓶中，加 70甲醇溶液适量，使溶解，并稀释至刻度，摇匀，用 0.45 m 微孔滤膜过滤，即得。3.5.3 对照品溶液制备精密称取槲皮素、山奈酚、异鼠李素对照品适量，加甲醇制成每1mL分别含30 g、30 g、20 g的混合对照品溶液，即得。3.5.4检测限和定量限试验取槲皮素、山奈酚和异鼠李素混合对照溶液，浓度依次为1.18g/mL、1.30g/mL、0.8184g/mL进行限度检测，结果见下表。表19 限度检测结果对照品检测限（ng）信噪比定量限（ng）信噪比槲皮素1.184.23.5412.5山奈酚1.303.13.5013.7异鼠李素1.643.54.9111.93.5.5 专属性试验取本品35mg，精密称定，按3.5.2制备供试品溶液，照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录D）HPLC-DAD检测样品中目标成分的纯度，结果见下图。 从上图可判断，供试品中对应的游离槲皮素、山奈酚和异鼠李素峰纯度符合要求，说明本测定方法专属性强。3.5.6 耐用性试验本研究对不同品牌色谱柱耐用性进行了考察，色谱柱信息及测定结果如下：色谱柱1：Diamonsil C18 1504.6mm 5m；色谱柱2：Diamonsil C18 2504.6mm 5m；色谱柱3：Agilent Zorbax SB C18 1504.6mm 5m；色谱柱4：Agilent Zorbax XDB C18 1504.6mm 5m；从上图可见，采用上述四种色谱柱均可有效分离游离槲皮素、山奈酚和异鼠李素成分，为提高检测效率，建议采用C18 1504.6mm 5m 色谱柱，品牌方面，暂建议采用安捷伦或迪马（一代）公司产品。3.5.7 结果计算 供试品中游离槲皮素（或游离山奈酚、或游离异鼠李素）含量以质量分数X3计，数值以%表示，依次按式（A4）计算：（A4）式中：X3供试品中游离槲皮素（或游离山奈酚、或游离异鼠李素）的质量分数，%；Ax3供试品溶液中槲皮素（或游离山奈酚、或游离异鼠李素）的峰面积；As3对照品溶液中槲皮素（或游离山奈酚、或游离异鼠李素）的峰面积；c3对照品溶液中槲皮素（或游离山奈酚、或游离异鼠李素）的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；V3供试品溶液的体积，单位为毫升（mL） ；m3供试品质量，单位为毫克（mg）。3.5.8 样品测定取本品35mg，精密称定，按3.5.2制备供试品溶液。照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录D）测定，精密量取10L，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取槲皮素、山奈酚和异鼠李素混合对照品溶液适量，同法测定，按外标法以峰面积计算，即得。多批银杏叶提取物含量测定结果见下表。表20 银杏叶提取物游离槲皮素、山奈酚和异鼠李素含量测定结果样品来源批号游离槲皮素/%游离山奈酚/%游离异鼠李素/%浙江康恩贝1202040.0790.0820.049浙江康恩贝1203180.0660.0740.048浙江康恩贝1205050.0530.0640.042中检所对照提取物110866-2002020.0680.0710.032市售提取物11109010.750.520.30市售提取物21111042.840.890.24市售提取物31201011.060.440.11市售提取物41201150.120.110.05市售提取物51202020.230.210.09康恩贝作为国内银杏叶提取物的主要生产企业之一，药材来源包括了湖北、山东、江苏等国内国几个主要的大型银杏叶产地。公司多年的检测数据显示，在自然界的银杏叶中，游离槲皮素、山奈酚和异鼠李素的含量是非常低的，提取物中含量也是一样很低，按中国药典所载方法制备的银杏叶提取物以及中检所提供的银杏叶提取物对照品，进行含量测定，结果显示游离槲皮素和游离山奈酚的含量均小于0.2%，游离异鼠李素的含量均小于0.1%，而从市场采购的银杏叶提取物，经检测部分提取物中游离槲皮素、游离山奈酚和游离异鼠李素含量异常偏高，见上表含量数据及下图。从上述对比结果可判断，国内部分银杏叶提取物生产企业在提取物制备过程中可能采取了非常规的行为。为防止国内部分不法商家的掺假、掺杂等行为，保证银杏叶提取物质量，本标准规定，银杏叶提取物中游离槲皮素和游离山奈酚含量均不得高于0.5%，游离异鼠李素含量不得高于0.2%。3.6 总银杏酸限量 银杏叶提取物具有巨大的国际市场，也是我国出口量最大的植物提取物之一。然而，近年来，国内外一些企业生产的银杏叶提取物在外销过程中频频遭遇退货，究其原因大部分都是由于银杏酸的质量检测不符合要求，即使按照中国药典2010年版的检测方法控制总银杏酸在5g/g以下，仍不能满足外销的要求。因此，我们对欧洲药典和美国药典标准中银杏酸的检测方法进行了深入研究对比。研究发现，三个药典标准中银杏酸的限度检测方法在样品前处理、色谱条件、计算方法及限度要求等方面存在较大差异，对比结果见下表。表21 三种药典标准银杏酸限度检测方法对比考察项Ch.P2010USP36-NF31EP7.0前处理取GBE 10g，石油醚回流提取，经甲醇溶解取GBE0.5g，甲醇溶解定容取GBE0.5g，甲醇溶解定容色谱条件流动相：甲醇-1冰醋酸溶液（90：10）；检测波长：310nm；色谱柱填料：C18；进样量：10uL；对照品：白果新酸C13:0；总银杏酸对照品流动相：0.01%磷酸乙腈-0.01%磷酸水梯度；检测波长：210nm；色谱柱填料：C8进样量：100uL;对照品：USP银杏酸对照品（ C13:0，C15:1和C17:1）流动相：0.01%三氟乙酸乙腈-0.01%三氟乙酸水梯度；检测波长：210nm；色谱柱填料：C8；进样量：50uL;对照品：EDQM银杏酸对照品，C17:1含量为0.35%计算方法以 白果新酸C13:0为对照，以总银杏酸对照品相应5个色谱峰峰面积总和计总酸分别计算银杏酸C13:0，C15:1和C17:1含量,相加得总银杏酸含量。以银杏酸 C17:1为对照，以C13:0，C15:1和C17:1三个色谱峰面积总和计总酸。限度要求10g/g5g/g5g/g值得注意的是，在前处理方法方面，中国药典采用石油醚回流提取，浓缩后甲醇转移定容的方法，美国药典与欧洲药典均采用提取物甲醇溶解，直接定容的方法。本研究对不同前处理方法进行了比较，6批供试品同时按照Ch.P和EP标准进行前处理，然后按照Ch.P标准测定和计算，结果见下表。表22 不同前处理方法测定结果对比样品总银杏酸/(g/g)Ch.P2010EP7.015.225.723.417.230.94.141.67.056.528.868.034.4从上表对比结果显示，按Ch.P标准前处理测定结果显著低于按EP标准前处理测定结果。研究认为，EP和USP标准采用提取物甲醇直接溶解、定容，操作简便，银杏酸几乎零损失，而中国药典标准采用石油醚回流提取银杏酸，操作步骤较复杂，且提取溶剂石油醚极性较小，溶剂量较少，提取过程中，提取物极容易被包裹起来，从而导致银杏酸提取不完全，测定结果远低于EP标准的测定结果。因此，EP标准的前处理方法较Ch.P标准更准确、便捷，更能反映银杏叶提取物中总银杏酸的真实情况。在此基础上，本标准参照EP和Ch.P标准，总银杏酸限度检测方法中，参照了EP的前处理方法来制备供试品，色谱条件和计算方法仍参照Ch.P标准，对总银杏酸限度检测方法进行了修改，验证结果如下。照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录VI D）测定仪器：Agilent 1260系列高效液相色谱仪（UV检测器）、Agilent 1100系列高效液相色谱仪（DAD检测器）3.6.1 色谱条件与系统适用性试验色谱柱：Agilent Zorbax XDB C18 1504.6mm 5m；流动相A 甲醇-流动相B 1%冰醋酸溶液(90:10)；流速1.0mL/min；柱温30；检测波长为310nm；进样量10-50L。理论板数按白果新酸峰计算，应不低于4000。3.6.2 供试品溶液制备取本品 0.5-1.0 g，精密称定，置10 mL量瓶中，加甲醇8 mL溶解，若有必要，可用超声波处理，并用同样的溶剂稀释至10 mL。用 0.45 m微孔滤膜过滤，即得。3.6.3 对照品溶液制备白果新酸对照品：精密称取白果新酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含1 g的溶液，摇匀，即得；定位用对照溶液的制备：取总银杏酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含100 g的溶液，摇匀，即得。3.6.4检测限和定量限试验取白果新酸对照溶液，浓度为4.9g/mL进行限度检测，结果见下表。表23 限度检测结果对照品检测限（ng）信噪比定量限（ng）信噪比白果新酸4.93.314.711.33.6.5 专属性试验取本品0.5-1.0g，精密称定，按3.6.2制备供试品溶液，照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录D）HPLC-DAD检测样品中目标成分的纯度，结果见下图。从上图可判断，供试品中对应的银杏酸三个主要峰C13:0、C15:1和C17:1的峰纯度符合要求，说明本测定方法专属性强。3.6.6 耐用性试验本研究对不同品牌色谱柱耐用性进行了初步考察，色谱柱信息及测定结果如下图：色谱柱1：Diamonsil C18 250*4.6mm 5m；色谱柱2：Phenomenex C18 250*4.6mm 5m；色谱柱3：Agilent XDB C18 250*4.6mm 5m；色谱柱4：Kromasil 100-5- C18 250*4.6mm；色谱柱5：Agilent XDB C18 150*4.6mm 5m； 从上图可见，采用上述四个厂家五种色谱柱均可有效分离银杏酸成分，为提高检测效率，建议采用C18 1504.6mm 5m 色谱柱，品牌方面，建议安捷伦（Agilent）；菲罗门（Phenomenon）；瑞典Kromasil。3.6.7 结果计算供试品中总银