课件：甲苯达唑.ppt

苯并咪唑类-甲苯达唑,检疫1412 雷月华 周录,目录,结构与性质 作用 危害 样品处理 1.水解 2.提取及净化 分析方法 国家标准,苯并咪唑类药物的结构式,苯并咪唑类药物是一个庞大的化学家族,包括噻苯达唑的同系物、苯并咪唑氨基甲酸酯类,以及苯并咪唑环上的各种侧链取代物。,苯并咪唑环,甲苯达唑(Mebendazole, MBZ),别名甲苯咪唑,为白色、类白色或微黄色结晶性粉末,在甲酸中易溶,在冰醋酸中略溶,在丙酮或氯仿中极微溶解,在水中不溶。 为广谱驱虫药,不仅对动物多种胃肠线虫有高效,而且对某些绦虫亦有良效,并且是为数不多治疗旋毛虫的良药之一。 甲苯达唑早在20世纪80年代已广泛用于世界各国的医学和兽医临床。,结构与性质,内服后胃肠道吸收差(5%10%),吸收后迅速分布于血浆、肝、肺等,血药达峰时间为24h,半衰期2.55.5h。 在动物肝内很少代谢,代谢物为极性很强的羟基(MBZ-OH)和氨基代谢物(MBZ- NH2)。在2448h内经粪便排泄的原形药物约占80%左右,经尿排泄的约为5%10%。吸收后药物,仅有极少量以脱羧基衍生物形式排泄。,一、作用,甲苯咪唑为一个广谱驱肠虫药，体内或体外试验均证明能直接抑制线虫对葡萄糖的摄入，导致糖原耗竭，使它无法生存，具有显著的杀灭幼虫、抑制虫卵发育的作用，但不影响人体内血糖水平。可用于防治钩虫、蛔虫、蛲虫、鞭虫、粪类回线虫等肠道寄生虫病。,二、危害,(1)长期应用本品能引起蠕虫产生耐药性，而且存在交叉耐药现象。 (2)甲苯达唑药物颗粒的大小，能明显影响驱虫强度和毒性反应，如微细颗粒(10.62靘)虽然比粗颗粒(21.27靘)驱虫作用更强，但毒性亦增加5倍。 (3)本品能影响产蛋率和受精率，蛋鸡以不用为宜；此外鸽子、鹦鹉因对本品敏感而应禁用。,三、样品处理,甲苯达唑含咪唑环结构,两个氮原子具有酸碱两性,在适当的pH条件下,分子可以质子化(pKa约56)或去质子化(pKa约12)。 在酸性或碱性条件下,大部分苯并咪唑类药物可解离,易溶于水性溶剂,并被提取,然后调节pH值使呈中性,用乙酸乙酯抽提。 由于5-OH-TBZ在pH值范围内都能电离,易溶于酸性或碱性的水溶液,乙酸乙酯很难将其抽提出来。,1、水解,肝和奶样中苯并咪唑类药物与蛋白结合率较高,不易被有机溶剂提取,可先将样品水解后再提取游离的药物。 常用的水解方法有酸水解和酶水解两种。 酸水解通常使用无机酸,例如用4moL/L盐酸于80110 ,在14h即可完成水解。 酸水解具有简便、快速、水解完全等优点,因而被广泛采用。,酶水解,酶水解通常使用-葡糖苷酸酶或芳基硫酸酯酶,前者可专一地水解葡萄糖醛酸苷结合物,后者可水解硫酸酯结合物。 由于肝样中通常存在上述两种结合物,常使用-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯混合酶,控制pH4.57.0,于一定温度下孵育1872h。 与酸水解相比,酶水解比较温和,一般不会引起药物的分解,但有时水解不完全和实验费用高是该法的缺点。,2、提取及净化,液-液萃取(LLP)是提取苯并咪唑类药物的最常用方法,通常将水性溶液调节至适当的pH值,用水不相溶的有机溶剂提取。 用酸溶液提取时,即包括了样品的水解过程。 由于苯并咪唑类药物的极性和pKa差异很大,因此多残留提取相当困难,即使对单一药物,母药及其代谢产物的同时提取亦难。,甲苯达唑,MBZ及其两个代谢产物MBZ-OH和MBZ-NH2,由于MBZ和MBZ-NH2呈碱性,pKa分别是3.5和5.5,在pH7.5时,这两种化合物不被电离;MBZ-OH含酸性的-OH,其pKa为9.8,在pH7.8时不被电离。因此,溶液只有在pH7.57.8间,所有化合物不被电离,呈中性,这时可用极性溶剂(如:乙腈、甲醇、水-乙腈、水-甲醇等)来提取。,三、分析方法,苯并咪唑类药物残留的测定方法主要有生物检测法、免疫分析法、气相色谱法和液相色谱法，采用紫外、荧光和质谱检测。,1、生物检测法,生物检测法曾被用来检测食品中苯并咪唑类残留,但现在大部分用来评价驱虫剂的效能。 生物检测法首先用TLC板将残留物分离出来,然后用含培养剂和生物指示剂的溶液喷雾TLC板,TLC板上抑制生物繁殖的区域表明药物残留的存在,抑制区域的大小与残留物的浓度有关。,分光光度法,Baeyens等利用MBZ和FLU在碱性条件下与0.3%过氧化氢反应产生荧光,检测了制剂中药物含量,这一方法也可用于四咪唑、右旋咪唑和左旋咪唑的检测。,4、免疫分析法,免疫分析法是一种简便、灵敏、选择性高的检测方法。 一般情况下,生物样品如血浆、血清、牛奶能够直接测定或者稀释后测定。 早期,放射免疫法被应用于测定动物组织和农作物中的苯并咪唑类残留。 Nerenberg等建立了放射免疫法检测血浆中的OFZ,多克隆抗体通过兔免疫接种OFZ和多聚赖氨酸载体培养得到,后来这种方法应用于绵羊脂肪组织中OFZ残留的检测。 Newsome等采用多克隆抗体、放射免疫法检测农作物中BEN及其主要代谢产物MBC,多克隆抗体通过兔接种半抗原-2-氨基苯并咪唑和人血清蛋白培养得到。,5、气相色谱法,只有少数苯并咪唑类药物(如:TBZ、5-OH-TBZ)可直接用GC法分析。 Lafuente等采用硅酮键合相的毛细管柱(10m 0.53mm)分离水果中TBZ残留物,分别用氮磷检测器(NPD)和电子捕获检测器(ECD)检测,发现NPD检测的灵敏度更高,LOD为10g/kg。 Oishi等采用GC-NPD法检测TBZ,石英毛细管柱(25m 0.2mm)分离,LOD为10g/kg。 大部分苯并咪唑类药物极性较高,难以气化,热稳定性差,故GC法分析需要衍生化。,衍生化,由于苯并咪唑类分子结构上含氨基和羟基,可与衍生剂发生酰化、硅烷化和烷基化反应。 常用的酰化衍生剂有三氟乙酸酐(TFA)、七氟丁酸酐(HFB)和五氟苄基酰氯(PFB-CO-Cl); 硅烷化试剂有N,O-双三甲硅基乙酰胺(BSA)、N-甲基-N-(叔丁基二甲基硅烷基)三氟乙酰胺(MTBSTFA)和N-甲基-(三氟乙酰胺) (MBTFA); 烷基化衍生剂有碘甲烷、溴代五氟苯、五氟苄基溴(PFB-Br)、二甲基乙缩醛-二甲基甲酰胺(DMA-DMF)和氢氧化三甲基苯胺(TMAH)。,6、液相色谱法,HPLC法被广泛应用于动物组织中苯并咪唑类残留的分析,通常采用反相柱如C18、C8柱分离,也有采用正相柱如uBondapak NH2柱分离。 存在问题： 采用硅胶基质的RP-HPLC法测定苯并咪唑类时,硅胶键合相表面残余的带负电荷硅醇基能强烈吸附苯并咪唑类药物,导致保留时间过长、峰拖尾或变形。 当流动相在弱酸性或中性时(pH57),苯并咪唑类的离子化被抑制,最后出峰的组分保留时间较长,峰展宽严重;当流动相为酸性时(pH23),苯并咪唑类的离子化增强,先出峰的组分容易分离,但后出峰的组分拖尾严重。,解决办法： 为降低游离硅醇基的吸附作用和增加苯并咪唑类药物在流动相中的溶解性,可采取离子抑制或离子增强的方法来解决。 通过调节流动相的pH值、加入离子对试剂、掩蔽剂、盐和较高比例的有机改性剂等,对流动相进行优化。 例如,在酸性流动相中加入四丁基铵阳离子,可改善苯并咪唑类的色谱性能,消除峰变形,提高分辨率。,早期,分离柱有采用硅胶柱或阳离子交换柱。 Karlaganis等用硅胶柱分离血浆中的BNZ,以乙腈-氯仿饱和水溶液-甲酸(75+92.5+0.25)作流动相。 Alvinerie等用硅胶柱分离TCB、TCB-SO、 TCB-SO2和OFZ,在15min内获得良好的分离。 Kirkland等用阳离子交换柱分离植物和土壤中的BEN残留。 Arenas等用强阳离子交换柱分离牛奶中的TBZ和5-OH-TBZ。,Bogan等最早采用C18柱分离8种苯并咪唑类残留,分析时间14min,但分离度较差。 Long等和Wilson等分别建立了多残留RP-HPLC法分离8种苯并咪唑类药物,分析时间为35min,采用梯度洗脱,可改善分离度。 Rose用C8柱、二元泵梯度洗脱,35min内分离OFZ和9种代谢产物。 Roudaut等用C18柱,二元泵梯度洗脱,分离了10种苯并咪唑类残留,除OXI和OFZ外,所有残留物在16min内获得分离。,检测器,苯并咪唑类及其代谢物在245nm和295nm处有强的吸收,可用紫外检测。在295nm处摩尔吸收系数相对较低(10000),但干扰少,吸收峰稳定、灵敏度足够,应用较多。 对于本身有荧光的化合物,如阿苯达唑及其代谢物和噻苯达唑及其代谢物,可用荧光检测,内源性杂质干扰小、检测灵敏度高。 光电二极管阵列检测(PDA)可提供化合物的吸收光谱图(200700nm),与标准品谱图进行对照,可对样品作出初步的定性判断。,国家标准,农业部1730号公告-1-2012 饲料中8种苯并咪唑类药物的测定 液相色谱-串联质谱法和液相色谱法 本标准规定了饲料中8种苯并咪唑类药物（噻苯达唑、阿苯达唑、芬苯达唑、奥芬达唑、氟苯哒唑、甲苯咪唑、氧苯达唑和三氯苯达唑）含量的液相色谱-串联质谱测定方法和液相色谱测定方法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中苯并咪唑类药物的测定。 本标准的方法检出限和定量限：液相色谱串联质谱法的检出限为0.20mg/kg，定量限为0.50mg/kg；液相色谱法的检出限为0.20mg/kg，定量限为0.50mg/kg。,案例,复方甲苯达唑含甲苯达唑(mebendazole)100mg和左旋米唑(levamisole)25mg,为新合成的低毒高效广谱驱肠虫药。由于肠道吸收少,毒副作用少见,偶见腹痛、腹泻,但作者遇到该药所致的单纯血尿1例,未见有文