课件：第二章发酵工业微生物菌种.ppt

第二章 发酵工业微生物菌 种制备原理和技术,1,2019,-,第一节 发酵工业微生物菌种的选育,1. 能够利用廉价的原料，或使用来源丰富的原料.,2.菌体温度应适应较高的温度.,3. 遗传性能要相对稳定,4.菌对所采用的设备和生产过程的适应性,7. 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关）,5.菌的产物得率和产物在培养基中的浓度,6.产物容易从发酵液（细胞）中提取,一、工业微生物的特点,2,2019,-,2. 工业上常用的微生物,1）细菌,发酵工业上常用的细菌大多是杆菌，如枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、乳酸杆菌、梭状芽孢杆菌大肠杆菌等。,(1) 醋酸杆菌（Acetobacter）：用于酿醋，把乙醇氧化成乙酸。 (2) 假单胞菌（Pseudomonas）,3,2019,-,(4) 大肠杆菌：工业上利用大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶，进行谷氨酸定量分析。还可以利用大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸和缬氨酸等。医药方面用它制造治疗白血症的天冬酰胺酶。另外，在研究细菌遗传变异方面，以及构建基因工程菌时，大肠杆菌是理想的研究材料。,(3) 乳酸菌：由糖类生成乳酸的一类细菌总称为乳酸菌，有乳链球菌和乳酸杆菌之分，主要用来制造乳制品。凡发酵产物中只有乳酸者，称为同型乳酸发酵；凡发酵产物中除乳酸外还有乙酸等和CO2者，称为异型乳酸发酵。肠膜状明串珠菌属于乳酸菌族，是制药工业生产有旋糖酐的重要菌。,4,2019,-,(5) 枯草芽孢杆菌：是一类好气性的生芽孢杆菌，可用于生产淀粉酶、蛋白酶、某些氨基酸、肌苷、5-核苷酸酶等。例如枯草杆菌BF7658是生产淀粉酶的主要菌种，枯草杆菌AS1.398是生产中性蛋白酶的主要菌种。 (6) 梭状芽孢杆菌：发酵生产丙酮丁醇。 (7) 棒杆菌、短杆菌：北京棒状杆菌AS1.299为谷氨酸的高产菌株。,5,2019,-,(2)酵母 酵母菌是工农业生产上极为重要的一类微生物，也使微生物遗传学研究的非常有价值的材料。除了广泛用于面包及酒精制造外，还应用在石油脱蜡、单细胞蛋白制造、酶制剂生产以及糖化饲料、猪血饲料发酵等许多方面。此外，从酵母菌体中还可以提取如核糖核酸、细胞色素C、凝血质及辅酶A等医药产品。,6,2019,-,(3) 放线菌 放线菌是由不同长短的纤细菌丝所形成的单细胞微生物。放线菌是抗生素的主要产生菌。除抗生素外，放线菌在甾体激素生物合成和酶制剂生产上也有广泛应用。,霉菌 霉菌与人类日常生活密切相关。除了用于传统的酿酒、制酱油外，近代广泛用于发酵工业和酶制剂工业。工业上常用的霉菌，有子囊菌纲的红曲霉、藻状菌纲的毛霉、根霉和犁头霉，以及半知菌纲的曲霉及青霉等,7,2019,-,(1) 曲霉属(Asprgillus)：曲霉种类繁多、分布广泛，工业上利用曲霉生产各种酶制剂和有机酸。如米曲霉（Asp. oryzae）用于酿酒和L-乳酸生产。制酱油用的酱油曲霉以及制造柠檬酸、草酸、葡萄糖酸和糖化酶、酸性蛋白酶、果胶酶、单宁酶等的黑曲霉(Asp. niger)。,(2) 青霉属（Penicillium）：j既是使果实腐败和实物变坏的有害菌，又是青霉素后葡萄糖酸的产生菌。 (3) 根霉属（Rhizopus）：用于米酒、黄酒生产。此外，广泛用作淀粉糖化菌、有机酸发酵以及甾体转化等许多方面。 (4) 毛霉属（Mucor）：产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力。腐乳、酱油、转化甾族化合物。土曲霉：衣康酸,8,2019,-,三、发酵工业微生物菌种的分离和选育,（一）微生物菌种的分离,9,2019,-,采样原则： 1) 材料来源越广泛，越有可能获得新的菌种。 2) 可寻找已适应各种环境压力的微生物类群。,10,2019,-,1.施加选择性压力选择法,根据筛选的目的在选择环境中加入选择因子。,培养方法： 培养方法可采用分批式富集培养（摇瓶培养）和恒化富集培养（连续培养）。分批式富集培养是将富集培养物转接到新的同一种培养基中，重新建立选择性压力，如此重复转种几次后，再取此富集培养物接种到固体培养基上，以获得单菌落。恒化富集培养是通过改变限制性基质的浓度，来控制不同菌株的比生长速率。,11,2019,-,连续培养菌种的筛选 比生长速率(u):每克菌体每小时增长的菌体量.u=1/XdX/dt.,12,2019,-,基质浓度,B,A,r,比生长速率u,13,2019,-,限制性基质,培养液,当进行流加时基质浓度r时,B菌先被洗出;,固体培养法,14,2019,-,2.随机分离方法 （1）.抗生素产生菌筛选 试验菌的灵敏性，以及与抗生素有关的酶、酶的抑制剂（例如棒酸）、激活剂、抗体等建立起来的高灵敏度、专一的检测技术。 （2）.药理活性化合物的筛选 （3）.生长因子产生菌的筛选 （4）.多糖生产菌的筛选 （5）.免疫激活剂产生菌的分离,15,2019,-,（二） 微生物菌种的选育,防止菌种退化 解决生产实际问题 提高生产能力 提高产品质量 开发新产品,目的:,16,2019,-,1自然选育 自然选育:在生产过程中,不经过人工处理,利用菌种的自然突变而进行菌种的筛选的过程.,自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-810-9,自然突变有两种情况：,一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。,另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。,17,2019,-,自然选育在工业生产上的意义,问题：,高产菌株是正突变高，还是负突变高？,回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变,自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。,18,2019,-,自然选育操作步骤：,一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。,单细胞(孢子)悬液的制备,平板分离,挑选单菌落(注意形态的观察),发酵试验,19,2019,-,整个流程主要包括:诱变和筛选. 诱变育种中的几个注意问题 .出发菌株的选择 出发菌株标准:产量高、对诱变剂的敏感性大、变异幅度大。,（1）诱变育种的基本方法,2诱变育种,20,2019,-,待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的均一性和环境条件。一般要求菌体处于对数生长期，并采取一定的措施促使细胞处于同步生长,这样有利于变异率提高得到很好的重现性。,21,2019,-,.复合诱变因素的使用 出发菌株通常有三种: 从自然界分离得到的野生型; 通过生产选育的菌株即自发突变选育 已经通过诱变选育的菌株. 对于不同出发菌株考虑采用不同的诱变剂进行处理,22,2019,-,.剂量的选择 变异率与致死率有一定的关系,利用致死率作为剂量选择的依据.,（3）变异菌株的筛选,营养缺陷型菌株的筛选,抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株的筛选,组成型突变菌株的筛选,抗性突变菌株的筛选,23,2019,-,抗生素抗性突变菌株的筛选,抗噬菌体菌株的筛选,抗噬菌体的特性实验,1.抗噬菌体性状的稳定性实验 点滴法、双层琼脂法。 2.抗性菌株的产量实验 3.真正抗性和溶原性的区别,24,2019,-,条件抗性突变,敏感突变菌株,3.杂交育种,杂交育种:将两个基因型不同的菌株经吻合(接合)使遗传物质重新组合,从中分离和筛选具有遗传新性状的菌株.,25,2019,-,杂交育种的优点 1.改变遗传物质基础,获得杂种菌株; 2.获得优良菌种,克服由于长期诱变造成的菌株生活能力下降等缺陷; 3.扩大变异范围,改变产品质量和产量,甚至出现新的品种; 4.促进遗传学理论发展.,26,2019,-,（2） 杂交育种的基本程序,选择原始亲本,选择直接亲本,直接亲本亲和力鉴定,杂交,分离培养,筛选重组体,重组体分析鉴定,27,2019,-,1.直接亲本的选择 营养缺陷性:微生物经诱变剂处理,由于基因突变,失去了合成某种物质的能力,不能在基本培养基上生长需要补加一定种类的有机物质后才能生长.,例如 细菌的杂交育种,28,2019,-,细菌的性别： F因子的转移、转化和转导等发生基因重组的方式。 例如： F因子的转移：（Hfr),F+,Hfr,+,中断杂交,29,2019,-,有杂交现象的微生物为数不多，在有工业价值的微生物中更少，而且即使发生杂交，遗传重组的频率亦不高，这影响了基因重组在微生物中的应用。,30,2019,-,4.原生质体融合技术,原生质融合:把亲本的细胞壁在酶的作用下瓦解,形成原生质体.两个原生质体在高渗环境条件下,在助融剂的作用下,发生细胞融合,基因组通过接触到交换,从而实现遗传重组.,31,2019,-,2.6.4.1原生质融合的优点 1.诱变、遗传转化、原生质体融合效率高; 2.能够得到多种类型的重组子; 3.重组频率高 4.可以和其他育种技术相结合 5.便于提高筛选效率,32,2019,-,标记菌株筛选,原生质体制备,融合,再生,融合子选择,实用菌株筛选,33,2019,-,、选择亲株 为了获得高产优质的融合子，首先应该选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株。同时，为了能明确检测到融合后产生的重组子并计算重组频率，参与融合的亲株一般都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型或抗药性等。可以通过诱变剂对原种进行处理来获得这些遗传标记。在进行原生质体融合前，应先测定菌株各遗传标记的稳定性，如果自发回复突变的频率过高，应考虑该菌株是否适用。,34,2019,-,、原生质体制备 去除细胞壁是制备原生质体的关键。一般都采用酶解法去壁。根据微生物细胞壁组成和结构的不同，需分别采用不同的酶，如溶菌酶，纤维素酶，蜗牛酶等。有时需结合其它一些措施，如在生长培养基中添加甘氨酸、蔗糖或抗生素等，以提高细胞壁对酶解的敏感性。,35,2019,-,一些微生物的去壁方法,一些微生物的去壁方法,36,2019,-,影响原生质体制备因素,在菌体生长的培养基中添加甘氨酸，可以使菌体较容易被酶解。甘氨酸的作用机理并不十分清楚，有人认为甘氨酸渗入细胞壁肽聚糖中代替D-丙氨酸的位置，影响细胞壁中各组分间的交联度。 不同菌种对甘氨酸的最适需求量各不相同。在菌体生长阶段添加蔗糖也能提高细胞壁对溶菌酶的敏感性。蔗糖的作用可能是扰乱了菌体的代谢，最适的蔗糖添加浓度随不同菌种而变化。,甘氨酸,青霉素,青霉素能干扰肽聚糖合成中的转肽作用，使多糖部分不能交联，从而影响肽聚糖的网状结构的形成，所以，在菌体生长对数期加入适量青霉素，就能使细胞对溶菌酶更敏感。,菌龄,菌龄也是影响溶壁的因素之一。一般处于对数生长中期细胞的细胞壁中肽聚糖含量很低，对溶菌酶敏感。,渗透压,原生质体对渗透压极其敏感，低渗将引起细胞破裂。一般是将原生质体放在高渗的环境中以维持它的稳定性。,对于不同微生物，原生质体的高渗稳定液组成也是不同的。如细菌的稳定液常用SMM液(用于芽孢杆菌原生质体制备和融合，其主要成分是蔗糖0.5M, 顺丁烯二酸0.02M, MgCl20.02M)和DF液(用于棒状杆菌原生质体制备和融合，主要成分是蔗糖0.25M, 琥珀酸0.25M, EDTA0.001M, K2HPO40.02M, KH2PO40.11M , MgCl2 0.01M)。在链霉菌中用得较多的是P液(主要成分蔗糖0.3M, MgCl20.01M, CaCl20.25M及少量磷酸盐和无机离子)。真菌中广为使用的是0.7M NaCl或0.6M MgSO4溶液，高渗稳定液使原生质体内空泡增大，浮力增加，易与菌丝碎片分开。,37,2019,-,原生质体融合与再生,原生质体再生就是使原生质体重新长出细胞壁 ，恢复完整的细胞形态结构。不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，甚至一些非常接近的种，最适再生条件也往往有所差别，如再生培养基成分及培养温度等。但最重要的一个共同点是都需要高渗透压。,原生质体融合通过化学因子或电场诱导的方法。,能再生细胞壁的原生质体只占总量的一部分。细菌一般再生率为3-10%。但有资料报道，在再生培养基中添加牛血清白蛋白，可使枯草杆菌原生质体的再生率达100%。真菌再生率一般在20-80%。链霉菌再生率最高可达50%。,为获得较高的再生率，在实验过程中应避免因强力使原生质体破裂。 涂布时，原生质体悬液的浓度不宜过高。因为若有残存的菌体存在，它们将会率先在再生培养基中长成菌落，并抑制周围原生质体的再生。 另外，菌龄、再生时的温度、溶菌酶用量和溶壁时间等因素都会影响原生质体的再生。,38,2019,-,筛选优良性状融合重组子,原生质体融合后，来自两亲代的遗传物质经过交换并发生重组而形成的子代称为融合重组子。这种重组子通过两亲株遗传标记的互补而得以识别。如两亲株的遗传标记分别为营养缺陷型A+B-和A-B+，融合重组子应是A+B+或A-B-。,重组子的检出方法有两种：直接法和间接法。 直接法将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子的高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子； 间接法把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株和重组子都再生成菌落 ，然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出重组子。,39,2019,-,5. DNA重组技术 DNA重组技术：按照人的意志，将某一（供体）的遗传信息在体外经人工与载体相接（重组），构成重组DNA分子，然后转入另一生物体（受体）细胞中，使被引入的外源DNA片段在后者内部得以表达和遗传。 开辟了一个分子育种的新领域-分子育种,40,2019,-,分子育种：利用基因工程技术、原理和设备，在分子水平上改良菌种。 优越性： 1.增加生物合成基因量而增加抗生素的产量； 2. 导入强启动子或抗性基因增加抗生素产量； 3.两种不同基因在体外重组后再导入受体内可以合成杂交抗生素； 4.激活沉默基因 5.把异源基因克隆到宿主中表达，以期彻底改变生产工艺。,41,2019,-,DNA重组技术的基本过程 1.目的基因的取得 有三种途径： 从供体中直接提取 通过反转录取得cDNA 化学合成特定功能的目的基因,42,2019,-,2.优良载体的选择 具有一个自我复制能力的复制子 能在受体细胞内大量繁殖； 最好只有一个限制性内切核酸酶的切口； 必须有一种选择性遗传标记,43,2019,-,3.目的基因与载体DNA的体外重组 采用限制性酶切或人为地在DNA的3端接上polyA和polyT可以使重组的两个DNA分子产生“卯眼”似的粘性末端。然后两者在56下“退火”形成新的双链，在连接酶的作用下形成重组载体,44,2019,-,4.重组体导入受体细胞 5.重组受体细胞的筛选和鉴定,筛选类别,遗传学直接筛选法：抗药性、噬菌斑形成能力等,分子生物学间接法：酶切相对分子量的大小、分子杂交等,45,2019,-,举例抗药性变化检测：,质粒,Apr,Tcr,Apr,+,含氨卞青霉素培养基,含四环素培养基,46,2019,-,6.工程菌的大规模培养,基因工程菌不稳定具体表现 质粒的丢失 重组质粒发生DNA片段脱落 表达产物不稳定,47,2019,-,解决不稳定性对策 组建适当载体(质粒上插入 特殊DNA片段) 选择适当宿主 施加选择压力（抗生素添加法、抗生素依赖变异法、营养缺陷型法） 控制基因过量表达 控制培养条件 改良质粒 固定化工程菌,48,2019,-,四、发酵工业微生物菌种的退化、复壮和 保存,（一）微生物菌种的退化及原因,1.菌种退化,菌种退化：生产菌种或优良菌株由于传代或保存之后，群体中某些生理特性或形态特征逐渐减退或完全丧失的现象。,集中表现：产量下降，有的发酵力和糖化力下降。生长代谢来说孢子变得更少 或更多、生长 能力过快或过慢。,49,2019,-,例如：土霉素产生菌（stroptomycesrimusus),草帽型 高产,龟鳖开型或梅花型 产量下降1-2倍,2.引起菌种退化的原因,（1）基因突变主要原因,（2）变异菌株的性状分离,（3）连续传代是加速菌种退化的直接原因,单核,双核或多核,准性生殖,50,2019,-,4）培养条件和保存条件可以从多个方面影响菌种的性状,（二）防止菌种退化和退化菌种的复壮,（1）控制传代次数,（2）选择合适的培养基和培养条件,（3）利用不同类型的细胞进行传代,（4）选择合适的保存方法,（5）经常进行菌种纯化,51,2019,-,（三）菌种的保藏,菌种保藏的原理和方法 菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平，缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。 一种好的保藏方法，首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变。,52,2019,-,3. 菌种保藏的方法,（1）斜面低温保藏法,适用于：细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌,条件控制：一般要求培养基成分相对贫乏，氮源略高于碳源，避免pH降低；放线菌和霉菌适当控制生长速度，以有利于孢子形成。,优点：简单、方便存活率高,缺点：保存时间短、易变异,53,2019,-,（2）石蜡油封保存,适用菌种：部分霉菌、酵母菌、放线菌，不适宜细菌及降解烃类的微生物。,（3)砂土管保存法,（4）冷冻干燥法,冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。 通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。 冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。,54,2019,-,（5）超低温保存法,要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60以下进行保藏。 在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是： 1离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞； 2用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3加入等体积的20甘油或10二甲亚砜； 4混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70超低温冰箱中保藏。,55,2019,-,第二节 工业微生物种子的扩大培养,56,2019,-,定义：菌种的扩大培养就是把保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培养物称为种子。,一、菌种扩大培养的任务,57,2019,-,种子扩培的目的,接种量的需要,菌种的驯化,缩短发酵时间、保证生产水平,58,2019,-,菌种细胞的生长活力强，接种后在发酵罐 中能迅速生长 生理性状稳定 菌体总量和浓度能满足大容量发酵罐的要 求 无杂菌污染（不带杂菌） 生产能力稳定,种子必须具备的条件,59,2019,-,二、种 子 制 备 过 程,实验室种子制备阶段：琼脂斜面至固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培养等或液体摇瓶培养 生产车间种子制备阶段：种子罐扩大培养,60,2019,-,不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。,1.种子扩大培养的流程,2.实验室种子制备,61,2019,-,在砂土管或冷冻干燥管内保藏的菌种以无菌的方式接至适合的斜面培养基上，培养成熟后挑选正常的菌落再接一次试管斜面并至摇瓶。,62,2019,-,培养物选择的原则,目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为四类：,63,2019,-,对于产孢子能力强的微生物,斜面到固体培养基培养获得孢子，孢子作为种子罐种子,便于操作，但需要更仔细的控制。,64,2019,-,对于不产孢子的微生物 获得一定数量和质量的菌丝体,对于不孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如镰刀赤霉菌生产赤霉素的种子培养。,65,2019,-,产孢能力不强 斜面获得孢子，然后再接入液体摇瓶培养获得菌丝体，提供给种子罐。,对于细菌 斜面培养然后液态摇瓶培养获得生长能力旺盛得对数期细胞。,66,2019,-,2、培养基选择的原则,培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。,在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。,67,2019,-,3、起始接种物的传代问题,细菌,保藏斜面 活化斜面,产孢子,保藏 母斜面 子斜面,目的：使菌种的传代次数尽可能的少。,68,2019,-,母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。 所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。,子瓶: 大量繁殖，得到大量孢子。 接种：从母斜面上点接种，选取生长好的单菌落 接种时密一点，得到大量的孢子。,孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月,孢子培养,69,2019,-,1、斜面 (AS1.299),培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2,培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细,培养条件：32，生长18-24小时,生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次,70,2019,-,2. 一级种子（摇瓶）,培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32培养12小时。,培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%,培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基,一般以微孔接种法、火焰接种法,71,2019,-,3、生产车间种子制备阶段,1、培养物的选择原则,在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。,缩短发酵时间,有利于获得好的发酵结果,菌丝体比孢子要有利：,生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。,72,2019,-,种子罐级数的确定,种子罐的级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数 对于生长快的细胞，种子用量的比例少，即需要的接种量少，所以相应的种子罐也少,73,2019,-,3. 二级种子罐,培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%）， 32培养7-10个小时,培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替， 浓度为2.5%,培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基,74,2019,-,75,2019,-,发酵级数：种子罐级数加一。 注意小型发酵罐称为一级发酵例如，5升发酵罐。 例如：50m3的发酵罐。,76,2019,-,发酵级数确定的依据,级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响,级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级。,在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面,77,2019,-,接种种龄和接种量,接种龄 （对数期） 种子罐中培养的菌体从开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间 接种过于年轻：前期生长缓慢，发酵推迟，甚至菌