酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体课件

酶联免疫吸附试验检测 伤寒O抗体方法的建立,小组成员：王哲鉴、钟 鑫 陈 阳、刘一宁 指导教师：綦 霞 所在院系：检验医学院,Company Logo,目录,致 谢,Company Logo,摘要,目的：检测伤寒O抗体一般采用肥达实验（直接凝集实验），在临床诊断中有重要的意义。能否建立一个用酶联免疫吸附法检测血清中抗伤寒“O”抗体的实验体系，提高临床诊断效果是本实验要解决的关键问题。,原理：以伤寒O抗原免疫动物，制备出抗伤寒O抗体，将后者纯化，与酶连接制备成酶标抗体，以伤寒O抗原包被酶标板，以制备的伤寒酶标抗体为竞争抗体，可以构成竞争法检测伤寒抗体的酶联免疫实验。,摘要,摘要,结果：成功建立了一个酶联免疫吸附试验检测伤寒O抗体的实验体系 结论：酶联免疫吸附法可以检测血清中抗伤寒“O”抗体,实验方法,实验材料： 实验动物：家兔（1.性格温顺，一般不咬人，但其爪锐利，挣扎时易抓伤操作人员 2.与伤寒沙门菌种属差异大，可保证产生抗体 3.体重大，血量多，得到的血清可保证实验顺利进行） 实验试剂：饱和硫酸铵溶液 PBS透析液 辣根过氧化物酶(HRP) NaIO4溶液 2.5%乙二醇溶液 硼氢化钠溶液 包被稀释液 酶标抗体 待测抗体 稀释液 洗涤液 底物液 实验器材：兔笼 透析膜 离心机 加样器 酶标板,Company Logo,Company Logo,实验步骤,1,2,3,4,制备伤寒O抗体,纯化 抗体,酶与抗体的连接,ELISA 竞争检测 伤寒O抗 体（预实验 和正式实验）,制备伤寒O抗体,纯化抗体,1份血清（5ml）+ 1份生理盐水 + 2份饱和硫酸铵 置试管中 2000转离心20min 弃上清 1.52ml NS 溶解沉淀 透析24h 收集、标记、冰冻 5管,缓缓摇动 ,室温2h（1.5h）,盐析法,酶与抗体的连接,实验原理：NaIO4是强氧化剂，能将HRP的甘露糖部分（与酶活性无关的部分）的羟基氧化成醛基，然后与抗体的氨基结合，形成酶标抗体，反应式如下：,实验方法： 标记过程： 1.将HRP 5mg溶于0.5 ml PH5.6 HAC-NaAc 缓冲液中（老师做）。 2.滴入NaIO4 0.25ml,此时酶的颜色由黄变绿。4作用30min。,酶与抗体的连接,3.加入2.5%乙二醇溶液0.5ml（稳定剂）终止反应，室温30min 。 4.加入待标Ab1.52.0ml,用pH9.5碳酸盐缓冲液调整反应液的pH至 9.0左右，4过夜。 5.加入0.1ml硼氢化钠，42小时。 6.pH7.4 PBS液透析过夜，收集、标记成酶标记抗体和冻存,酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体,（一）.酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体预实验 1.包被Ag：抗原（伤寒）用包被液稀释，每孔加入100l，置37作用4h或4作用24h。 2.洗涤：弃去孔中液体，洗涤液洗涤3次，每次1min，于吸水纸上充分拍干。 3.加入样品：每孔加入酶标Ab及Ab各100l，放入37恒温箱中孵育30min。（如图1） 4.洗涤：同上 5.加入底物液：每孔加入底物液A1滴、B1滴，避光放置约5-15min，密切观察。 6.终止反应,酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体,（图1）,选择每一排阴阳色差最明显者为最佳工作浓度,酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体,稀释方法： 1.酶标抗体 1:251200ul(牛奶）+50ul（酶标）=1250ul 1:50600ul(牛奶）+600=1200ul 1:100 600ul(牛奶）+600=1200ul 1:200600ul(牛奶）+600=1200ul,酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体,2.待测抗体 1:5600ul(牛奶)+150ul(待测)=750ul 1:25600ul(牛奶)+150ul=750ul 1:125600ul(牛奶)+150ul=750ul,酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体,（二）酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体正式实验,选取预实验所选定的最佳工作浓度对酶标抗体及待测抗体进行稀释，验证该检测方法的可行性。方法如下： 1.包被 2.洗涤 3.加样(如图2) 4.洗涤 5.显色 6.判断检出率,酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体,图(2),经洗涤显色后,根据颜色深浅判断检出率,若待测组颜色更接近于阳性对照,则记为“+”，反之则记为“-”。,结果讨论,（一）实验结果 阴 阳,结果讨论,以酶标抗体1：100稀释和待测抗体原液为最佳工作浓度做正式实验，得到以下结果，待测1“+” ,待测2“+” ,待测3“+” ,待测4“+” ;4组待测抗体均被成功检出，检出率100%。,结果讨论,（二）实验讨论 伤寒，由伤寒杆菌引起，检测伤寒O抗体在伤寒杆菌感染的诊断中具有重要意义，采用肥达实验可对抗体进行半定量检测。但近年来发现，随着轻型和亚型病人的增多，伤寒杆菌变异株增多，或发病早期大量使用抗生素，抑制伤寒沙门菌或应用肾上腺皮质激素等免疫抑制剂抑制抗体的形成，肥达实验阳性率有下降的趋势，难以满足临床要求。ELISA法检测伤寒杆菌抗原或