分子生物学研究法（下）

1,基因功能研究技术,分子生物学研究法下,2,分子生物学研究方法（下）,基因功能研究技术,3,61 基因表达研究技术,基因表达系列分析技术（serial analysis of gene expression，SAGE）是一种以测序为基础定量分析全基因组表达模式技术，能够直接读出任何一种类型细胞或组织的基因表达信息。,61 .1 基因表达系列分析技术,4,原理：根据理论上任何长度超过910(49=262144)个碱基的核苷酸片段可代表一种转录产物的特异序列（转录本），因此，选择特定的限制性内切酶分离转录产物中这些代表基因特异性910个碱基的核苷酸序列并制成标签，将这些序列标签连接、克隆和测序，根据其占总标签数的比例即可分析其对应编码基因的表达频率。,5,SAGE程序:,分离提取mRNA,逆转录合成cDNA,4bp碱基的锚定酶（AE）,以与生物素相连的寡聚dT为引物,分离与抗生物素及微磁球相连的3 端cDNA,提取总RNA,6,3 端cDNA分两份,分别与连接子1和连接子2连接,标签酶（TE）切割,DNA聚合酶(Klenow)补平,含有914个碱基的标签,标签1,标签2,9,612 RNA选择性剪切,RNA选择性剪接是指用不同的剪切方式（选择不同的剪切位点组合）从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。选择剪接使一个基因翻译为多种蛋白质序列，是基因表达多样性的重要表现形式。,10,11,检测方法,RT-PCR,cDNA,以两端特异序列设计引物,观察PCR产物大小是否存在差异,存在差异,有选择性剪切,提取不同组织的总RNA,分离mRNA,PCR,不存在差异,无选择性剪切,12,613 原位杂交技术,原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）是用标记的核苷酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。 分RNA原位杂交和染色体原位杂交两大类。,13,FISH的是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。,荧光原位杂交技术 FISH （fluorescence in situ hybridization）,14,与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点 目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。,15,荧光原位杂交显示的着丝粒卫星DNA,荧光原位杂交显示的端粒,荧光素标记探针DNA,染色体,DNA,检测荧光素来确定与探针DNA序列杂交的互补序列在染色体或DNA上的位置,16,6.1.4 定点突变技术,定点突变（sitedirected mutagenesis）是重组DNA进化的基础，该方法通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于研究某个（些）氨基酸残疾对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、维修表达载体、引入新的酶切位点等。,17,体外定点突变的具体方法有三种： （1）寡聚核苷酸介导的定点突变； （2）双引物法定点突变（重叠延伸技术）； （3）大引物诱变法。 以上三种方法虽不同，但原理都一致。,18,1、寡聚核苷酸介导的DNA突变技术,已知序列的环状DNA,人工合成一段引物,变性,模板,定点突变,细菌转化,延伸诱变寡核苷酸引物,DNA聚合酶,筛选引入突变的环状DNA,19,2、重叠延伸技术,正向诱变引物FM,反向引物 R2,正向引物 F2,反向诱变引物RM,已知序列DNA模板,在重叠区发生退火,PCR3,使用引物F2和R2扩增,PCR4,全长突变DNA片段,形成全长双链突变DNA,反向互补,产物,产物,2,1,P C R,20,3、大引物诱变法,PCR1产物,正向诱变引物（M）,反向引物（R1）,双链大引物,退火和野生型基因复性,PCR2,正向引物（F2）,退火温度PCR2PCR1,已知序列DNA模板,全长突变DNA片段,21,（1）易错PCR技术为代表的无性进化,无性突变是向单一酶分子基因内随机引入突 变，制造突变酶库以便筛选 易错PCR在采用Taq酶进行PCR扩增目的基 因时，通过调整反应条件，例如提高酶离子 浓度，改变dNTP的浓度等，改变Taq酶的突 变频率,非定点突变,22,（2）DNA改组技术为代表的有性进化,DNA改组又称为有性PCR，基本操作过程是从正突变基因库中分离出来的DNA片段用酶随机切割，得到的随机片段经过不加引物的多次PCR循环，循环过程中随机片段互为模板和引物进行扩增，直到获得全长的基因，这导致来自不同基因的片段重组。 该策略将亲本基因群中的优势突变尽可能组合在一起，最终酶分子某一性质进一步进化。,23,24,622 基因敲除技术,概念： 基因敲除技术（gene knockout)又称基因打靶（gene targeting）。这种技术是通过基因工程的方法将一个结构已知但功能未知的基因去除，或用其他序列相近的基因取代（又称基因敲入），然后从整体观察实验动物，从而推测相应基因的功能。这种人为地把实验动物某一种有功能的基因完全缺失的技术称为基因敲除技术。,25,基因打靶的必备条件,打靶需要两个必备条件：一是子弹，二是靶子。同样的，基因打靶也需要其必备条件：一是要有将外源基因导入宿主细胞的载体；另一种就是能接受外源基因的受体（常用的是胚胎干细胞）,26,打靶载体（targeting vector）,通常，我们将外源基因DNA片段通过相应载体导入ES细胞中。一个好的载体应具备以下特点： 能在宿主细胞中稳定存在； 具有一个以上的遗传标志，,27,LoxP recombination sites: 942; 12211254,Human U6 promoter ( PU6): 52308,Chloramphenicol (Cmr ) open reading frame : 1192533,SacB negative selection marker: 12633173,Ampicillinresistance gene:start codon: 33093311; stop codon: 41674169 -,pUC origin of replication: 43174960,T7 RNA polymerase promoter: 50715089,28,胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）,ES细胞是取自小鼠胚胎早期的内细胞团。ES 细胞的特点：能在体外培养，并保留发育的全能性。 因此，在体外进行遗传操作后，将它重新植回胚泡，它就可以发育成胚胎的各种组织，将胚胎移植入母鼠子宫内，使ES细胞有机会发育成小鼠或某种组织。,29,一般认为，基因的同源重组只发生在一条染色体上，当一条染色体上的同源基因被同源顺序置换后，另一条染色体上的等位基因不再发生置换，因此，经同源重组后只能得到嵌合体小鼠（chimeric mouse）。 然后经过杂交育种，按孟德尔遗传规律，其后代中有四分之一的几率为纯和子，这样经过将嵌合体小鼠和正常小鼠进行交配，就可以得到基因敲除的纯系小鼠，即基因 敲除小鼠。,30,1、完全基因敲除,完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性。,31,基本原理:,构建与靶基因同源 (1015kb)的载体,外显子插有新霉素抗性基因 （neor）作为正选择的标志,疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因作为负选择,体外培养,新霉素(G418)和致死核苷类似物(GANC)作双重筛选,将重组体导入ES细胞,存活的ES细胞,32,方法,表型分析,构建载体,同源重组,筛选X被敲除的ES细胞,显微注射,回交得到X被敲除的动物,33,2、条件型基因敲除,条件型基因剔除是指某一特定细胞类型或细胞发育的特定阶段剔除某一特定基因的技术。,常用的条件型基因敲除有： 噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统 酵母细胞的FLP/FRT系统、R/RS系统,34,构建打靶载体,同源重组,筛选中靶ES,显微注射,杂交删除neor基因,特定阶段诱导Cre酶 切除目的片段,动物观察分析,Cre-loxP 重组系统进行条件性基因剔除的程序：,体外培养,35,基因敲除技术的应用 1、研究基因调控和基因功能； 2、建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供材料； 3、改造动物基因型，鉴定新基因和/或其新功能，研究发育生物学； 4、治疗遗传病，即基因治疗。 5、改造生物、培育新的生物品种。,36,6.3.1 酵母单杂交法,酵母单杂交（yeast onehybrid system)是一项常用于研究DNA与蛋白之间的相互作用的方法。 特点：通过该方法可以识别稳定结合于DNA上的蛋白质，可在酵母细胞内研究真核生物DNA与蛋白之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。,6.3 蛋白质及其RNA相互作用技术,37,转录激活结构域 （activation domain，AD）,DNA结合结构域 （DNA binding domain，BD）,基本原理：,顺式作用元件,报告基因得到表达,激活Pmin启动子,真核生物转录因子基本构件,38,基本操作过程为:,cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD）融合,导入酵母细胞,基因产物 （蛋白质）,顺式作用元件,激活Pmin启动子,报告基因得到表达,筛选阳性克隆,测序分析,cDNA替换了编码结合结构域(BD)蛋白基因,39,应用领域： 主要用于确定某个DNA分子与某个蛋白质之间是否存在相互作用； 用于分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功能编码基因； 验证反式转录调控因子的DNA结合结构域； 准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序列。,40,6.3.2 酵母双杂交系统,酵母双杂交系统（Yeast twohybrid system）巧妙地利用了真核生物转录调控因子的组件式结构（modular）特征，因为这些蛋白质往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中DNA结合结构域（DNA binding domain，BD）和转录激活结构域（activation domain，AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。单独的BD能与特定基因的启动区结合，但不能激活基因的转录，而由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。,41,酵母双杂交技术的基本原理,已知蛋白编码基因X,编码BD基因,cDNA不同片段Y,编码AD基因,诱饵,猎物,转化酵母细胞,报告基因,表达,不表达,X与Y编码蛋白有无相互作用,有,无,42,43,Dicer酶,双链RNA,siRNA （21 25个核苷酸的小片段双链RNA）,siRNA中的反义链指导合成一种被称为RNA诱导的沉默复合体（RISC）的核蛋白体,切割目的mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域,RISC,6.3.2 RNA技术及其应用,44,RNAi技术的应用：,与传统的同源重组基因敲除技术相比 高稳定性 高效率 易于操作 可实现多种基因突变,主要用于基因功能研究或基因治疗,45,RNAi技术的优缺点,RNAi最根本的特点是特异性 RNAi具有特殊的穿越能力,如将双链RNA注射在线虫性腺里,它也会干扰到体细胞里的基因表达,而且干扰作用会传给后代; RNAi对一些低水平表达的基因的RNAi现象并不明显,而且几个有相同或相似序列的基因, RNAi也会同时作用与它们.,46,反义RNA,反义RNA是由基因的负链编码,可与正义RNA (sense RNA)或DNA 编码顺序结合,干扰mRNA 的转录,加工和转运,调