不同源生物衍生骨支架材料的制备，表征和生物相容性检测创新实验结题报告.doc

大连理工大学大学生创新性实验计划项目结题报告项 目 编 号：2010046项 目 名 称：不同源生物衍生骨支架材料的制备，表征和生物相容性检测项 目 级 别：校级项 目负责人：刘巧钰指 导 教 师：宋克东项目所在院系：化工与环境生命学部大连理工大学教务处制大连理工大学大学生创新性实验计划项目原创性声明本人郑重声明：所呈交的项目结题报告以及所完成的作品实物等相关成果，是本人和项目组其他成员独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果，不侵犯任何第三方的知识产权或其他权利。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。项目负责人签名： 年 月 日 项目指导教师审核签名： 年 月 日 不同源生物衍生骨支架材料的制备，表征和生物相容性检测Investigation of Biological Characteristics of Heterogeneous Antigen-extracted Cancellous Bone-based scaffold摘 要骨组织工程的研究为解决骨缺损的修复问题带来了希望。理想的骨组织工程支架材料应满足以下特性：良好的生物相容性和安全性、良好的生物活性、适宜的力学强度、易加工及处理、合适的孔隙率等。本研究旨在利用传统方法制备去抗原骨基质材料，继而与人脂肪干细胞结合培养并向成骨细胞方向诱导，以验证猪去抗原松质骨材料的生物学特性和探讨其作为组织工程骨支架材料的可行性。关键词：组织工程；支架材料；生物相容性；去抗原骨基质；脂肪干细胞AbstractThe researches of bone tissue engineering offers hope to solve the problem of bone defect. Ideal scaffold for bone tissue engineering should meet the following characteristics: good biocompatibility and safety, good biological activity, proper mechanical strength, appropriate porosity etc. In this research, we used traditional method to make antigen-extracted xenogeneic cancellous bone matrix for cultivation with human adipose stem cells (hADSCs) and differentiate them into osteoblasts, and then investigate the feasibility of using it for bone tissue engineering scaffold material and its biological characteristics.Key Words：tissue engineering; scaffold matter; biocompatibility; antigen-extracted cancellous bone; adipose stem cells1 项目概述1.1 项目成员基本情况负责人姓名院（系）专业班级学号刘巧钰化工与环境生命学部化学工程与工艺（英语强化）0901班200948527参加成员张馨月化工与环境生命学部化学工程与工艺（英语强化）0901班200948510田陆平化工与环境生命学部化学工程与工艺（英语强化）0901班2009485131.2 指导教师基本情况指导教师姓名宋克东职称副教授学位工学博士单位化工与环境生命学部化学工程系联系方式 1.3 项目的选题背景、目的与意义1.3.1 选题背景骨移植经历300多年漫长发展，现在已形成自体骨、异体骨、异种骨、人工合成骨和复合骨等多种骨移植形式，自体骨和异体骨移植仍占主要地位；未来骨移植将进一步优化材料设计，细胞、生长因子与各种支架材料复合构建理想复合骨移植材料，将成为重要发展方向。实现快速骨整合和生理性骨重建是骨移植的发展趋势。随着骨组织工程研究的不断深入，目前，硬组织支架材料的研究重点逐渐转移到寻找类似人体骨组织天然结构和性能的材料上。制备这类材料的研究思路主要有两条：一条是用陶瓷材料、可降解高分子材料或它们的复合物，按照仿生原理设计并制造有优异性能和结构的材料；另一条是对天然骨进行处理制成衍生材料。目前对前种材料的研制尚在起步阶段，而生物衍生骨材料在国外已有产品问世。20世纪以来出现了冻干骨（Boplan骨）、煅烧骨（Py-rost骨）和脱蛋白骨（Kiel骨、Bio-Oss骨和Oswestry骨）等不同类型异种骨，并在临床应用中取得很好效果。理想的组织工程支架材料需满足下列基本要求：良好的生物相容性和生物稳定性；足够的力学性能和良好的生物机械性能；溶出物和可渗出物含量低；材料来源广泛，价格低廉，便于加工、灭菌和消毒。良好的生物相容性是骨组织工程生物支架材料的先决条件，因此长期植入机体的材料必须进行生物相容性评价。目前组织工程骨采用人工材料，如聚乙酸、聚乳酸、羟基磷灰石等作为细胞支架较多，但因其有细胞相容性差、立体空间结构紊乱、无成骨诱导因子存在等特点，而使其应用受到限制。同种异体骨是仅次于自体骨的骨移植替代材料，它不仅具有骨传导作用，同时还具有一定的骨诱导能力。但新鲜异体骨有较强的抗原性，其抗原性主要来自骨髓细胞表面，其次为骨膜和软组织，容易引发以细胞免疫为主的免疫反应。同种异体骨经冷冻、脱脂、去细胞、去抗原和去蛋白等程序处理，即为我们所要制备的生物衍生骨支架材料。1.3.2 目的与意义生物衍生骨支架材料能否长期存留体内并发挥功能值得研究。支架材料是组织工程研究的重要内容之一，也是该技术成功的关键。而生物相容性一直是生物材料用于临床医疗的中心话题之一，生物相容性是植入的支架材料能否长期存留体内并发挥功能的决定性因素。但生物衍生骨材料的可塑性差在大规模生产过程中会出现质量难以控制、性能与结构变化不成比例等缺点，且目前的处理方法尚不完善，仍处在起步阶段，因此对其制备及性能控制有待进一步研究。本项目将制备不同源生物衍生骨支架材料，并结合体外细胞接种和工程化骨组织的构建研究，评价其组织相容性，为组织工程支架材料的选择提供实验依据和物质基础。1.4 项目实施过程的人员工作分配和完成情况本创新实验项目的主要任务是查阅相关文献，并在宋克东老师的指导下进行不同源生物衍生骨支架材料的制备，结合体外细胞接种和工程化骨组织的构建研究，并评价其组织的生物相容性。项目内容负责人员前期计划及相关材料撰写刘巧钰文献查阅及制备过程刘巧钰 张馨月 田陆平表征、性质检验及分析刘巧钰 张馨月 田陆平后期报告撰写刘巧钰 张馨月1.5 实验过程收获和体会本次创新实验项目历时一年之久，是我们大学期间第一次真正意义上参与的科研活动。尽管缺乏科研经历，专业知识也不够丰富，但凭借着坚韧不拔的毅力和吃苦耐劳的精神，还是从创新实验中收获良多。首先，我们深刻认识到了团队的重要性。科研，是一项庞大的工程，仅仅凭借个人的聪明才智，能力是十分有限的，这就显示出了团队的重要性。在我们的实验过程中，团队是取得成功的关键因素。由于本科学业和其他的一些活动，我们都无法将时间全部投入到实验中，但由于我们协调分工，合理分配时间，使得实验可以有较快的进度，提高了效率。其次，我们也通过本次创新实验过程深刻感受到创新的必要性。通过查阅各种文献，我们发现，我国与西方发达国家的科研水平还有一段距离，主要的差距就在于创新。最后，我们衷心感谢宋克东老师在整个实验过程中给予我们的指导和帮助。2 项目预期成果完成情况和创新点2.1 项目预期成果完成情况2.1.1 项目的预期成果本项目将制备不同源生物衍生骨支架材料，并结合体外细胞接种和工程化骨组织的构建研究，评价其组织相容性，为组织工程支架材料的选择提供实验依据和物质基础。2.1.2 完成情况完成了不同源生物衍生骨支架材料的制备和表征（大体观察、扫描电镜观察、热重分析及孔隙率的计算），并通过结合人脂肪干细胞体外共培养进行了生物相容性的检验。2.2 创新点制备不同种属的生物衍生骨支架材料；研究其生物安全性和生物相容性，从而为骨组织工程提供最适宜的支架材料。3 项目说明3.1 实验方法设计及方案实验前期以查阅资料为主，重点查阅关于不同源生物衍生骨支架材料研究和脂肪干/祖细胞体外培养的文献，通过阅读文献以对研究内容以及所涉及的问题有了清晰的概念，使得我们对自己的研究方向有明确的认识。中期主要是进行不同源生物衍生骨支架材料的制备与表征。后期我们的任务主要是将制备好的不同源生物衍生骨支架材料，结合人脂肪干细胞进行体外共培养。最后对实验数据和结果进行分析与总结。3.2 实施过程3.2.1 不同源生物衍生骨支架材料的制备1) 取市售猪松质骨(髂骨)，以37生理盐水浸泡，洗尽表面，剔除表面软组织、骨膜和密质骨。修整成1cm3大小骨块，以37生理盐水冲洗，使骨表面完全清洁。2) 将骨块放入30%双氧水中，置于恒温箱中72h，每间隔24h更换双氧水。3) 取出骨块以37的双蒸水反复清洗，用氯仿-甲醇(体积比为31)溶液浸泡4h。4) 37的双蒸水反复清洗骨块后，放入0.16mol/L盐酸溶液中，室温下浸泡72小时。双蒸水反复清洗后，室温下真空干燥4小时。5) 骨块干燥后置液氮中24h，取出干燥后，以60Co照射(照射剂量为35Gy)消毒灭菌待用。(注：步骤5也可用浓度0.3 mol/L HCl 内脱钙处理5 min，再用双蒸水冲洗至pH 6.0，冷冻干燥，密封包装。)3.2.2 不同源生物衍生骨支架材料的表征1) 大体观察2) 扫描电镜观察及孔隙率计算 将异种骨支架材料用扫描电子显微分析仪分别在SEM80和SEM160条件下进行形貌观察，并用CA6300型图像处理分析系统对其孔径大小和孔隙率进行测定，测定方法：天平秤支架材料质量Ms,盛满乙醇的比重瓶质量M1,乙醇充分充盈于支架材料空隙并加满乙醇后的质量M2，取出支架后剩余乙醇与比重瓶质量M3，则孔隙为可用以下公式计算： 。3) 热重分析 分别将新鲜干燥未处理猪骨和经脱脂去蛋白处理后的猪骨进行热失重分析，绘制热重分析曲线（TG曲线）及微商热重分析曲线（DTG曲线）。3.2.3 不同源生物衍生骨支架材料的生物相容性检测1) 将分离所得的人脂肪干细胞进行原代培养及传代，分别向脂肪细胞方向和成骨方向诱导，进行对照碱性磷酸酶染色和Von Kossa钙结节染色，并绘制人脂肪干细胞生长曲线。2) 将异种骨支架材料结合人脂肪干细胞进行体外共培养，取静态及三维动态培养的复合物经扫描电镜观察细胞在支架上的生长情况。方法如下：将材料用3%戊二醛固定30min，双蒸水洗去固定液，叔丁醇逐级脱水，CO2临界点干燥，离子溅射镀膜仪将样品表面喷金镀膜，然后进行扫描电镜观察。3) 将人脂肪干细胞在异种骨支架材料上向成骨细胞方向进行诱导分化。方法如下：取复合物，将材料用3%戊二醛固定30min，双蒸水洗去固定液，叔丁醇逐级脱水，CO2临界点干燥，离子溅射镀膜仪将样品表面喷金镀膜，然后进行扫描电镜观察。3.3 数据分析处理3.3.1 大体观察图1 大体观察图大体观察可见，经处理后的异种骨支架材料呈淡黄白色，疏松多孔（图1），可见材料中脂肪等软组织已基本去除，材料呈多孔海绵状。3.3.2 扫描电镜观察图2（SEM，80）图3（SEM，160）扫描电镜可见，处理后的异种骨支架材料呈多孔状，孔壁光滑，孔隙均匀，脂肪等软组织已基本被清除。3.3.3 热重分析图4 新鲜干燥未处理猪骨的热失重分析曲线图5 经脱脂去蛋白处理后的猪骨热失重分析曲线图4是新鲜干燥未处理猪骨的热失重分析曲线，图5是经脱脂去蛋白处理后的猪骨热失重分析曲线。图中，a曲线表示随时间延长，温度升高，重量损失百分比的变化，即热重分析曲线（TG曲线），b曲线表示热重曲线对时间的一阶导数曲线，即微商热重分析曲线（DTG曲线），DTG曲线表明的是质量变化速率，由图中可以看到，未处理骨的DTG曲线出现两个强峰，而且重量损失百分比很大，这是骨中大量有机物所造成的。而未处理骨和处理骨的DTG曲线都在350左右出现了强峰，这是骨中羟基磷灰石的晶化造成的，未处理骨的DTG曲线仅出现这一个峰，表明其中的脂肪等有机物已基本除去。3.3.4 孔隙率的计算经测算，10组骨支架材料的平均孔隙率为72.56%。3.3.5 人脂肪干细胞的原代培养及传代分离所得的细胞经培养24h后即可见细胞贴壁生长，多为似成纤维细胞的梭形细胞，其间可见数量不一的脂肪颗粒（图6），经传代后的细胞呈梭形，排列紧密，已观察不到脂肪颗粒（图7）。 图6 原代培养的人脂肪干细胞 图7 第五代人脂肪干细胞3.3.6 人脂肪干细胞向脂肪细胞方向诱导图8 成脂诱导14天的人脂肪干细胞胞浆中可见脂滴出现，染色呈橙红色。3.3.7 人脂肪干细胞向成骨细胞方向诱导A.培养第7天碱性磷酸酶染色： 图9 对照组 图10 实验组可见，对照组经染色后未见明显变化，而实验组染色后可见明显的黑色颗粒存在。B.培养第14天Von Kossa钙结节染色： 图11 对照组 图12 实验组可见，对照组经染色后未见明显变化，实验组染色后可见明显深棕色结节状钙化结节形成。3.3.8 人脂肪干细胞生长曲线的测定生长曲线见图13。可见，第1天细胞生长较缓，从第2-3天进入对数增长期，第4天以后进入平台期。图13 生长曲线3.3.9 异种骨支架材料结合人脂肪干细胞体外共培养于培养第7、14天取静态及三维动态培养的复合物经扫描电镜观察细胞在支架上的生长情况。方法如下：将材料用3%戊二醛固定30min，双蒸水洗去固定液，叔丁醇逐级脱水，CO2临界点干燥，离子溅射镀膜仪将样品表面喷金镀膜，然后进行扫描电镜观察。结果如下： 图14 静态培养 图15 动态培养由图可见，在培养第7天，于骨支架材料表面已可见梭形脂肪干细胞生长，细胞形态良好，但数量不多。 图16 静态培养 图17 动态培养由图可见，培养第14天，骨支架表面已可见大量梭形脂肪干细胞生长，且连接成片。3.3.10 人脂肪干细胞在异种骨支架材料上向成骨细胞方向诱导分化于培养第7、14天取复合物，将材料用3%戊二醛固定30min，双蒸水洗去固定液，叔丁醇逐级脱水，CO2临界点干燥，离子溅射镀膜仪将样品表面喷金镀膜，然后进行扫描电镜观察。结果如下： 图18 图19由图18、19可见，于培养第7天，骨支架材料表面可见成骨细胞于骨支架材料上贴附生长，并向四周伸出伪足，但数量不多。 图20 图21由图20、21可见，于培养第14天，骨支架材料表面可见大量成骨细胞生长，伪足相互融合相连，成片生长，形态良好。4 项目总结不同源生物衍生骨支架材料孔壁光滑，孔隙均匀，制备过程相对简单，与人脂肪干细胞体外共培养体现出良好的生物相容性，为组织工程支架材料提供了全新的选择方向和广阔的应用前景。5附录5.1 参考文献目录1 R. 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