核酸化学课件

第三章 核酸化学,Nucleic Acid chemistry,主要内容： 介绍核酸的分类和化学组成，重点讨论DNA和RNA的结构特征，初步认识核酸的结构特征与其功能的相关性；介绍核酸的主要理化性质和核酸研究的一般方法。,思考,核酸的结构与功能,第一节 核酸的研究历史和重要性 第二节 核酸的分类和基本结构单位核苷酸 第三节 DNA的分子结构 第四节 RNA的分子结构 第五节 核酸的某些理化性质及核酸研究常用技术 第六节 DNA研究进展,核酸的研究历史和重要性,1869 Miescher从脓细胞的细胞核中分离出了一 种含磷酸的有机物，当时称为核素（nuclein）,后称为核酸（nucleic acid） 1944 Avery 等通过肺炎球菌转化试验证明DNA是遗传物质 1953 Watson和Crick提出DNA结构的双螺旋模型 1958 Crick提出遗传信息传递的中心法则 70年代 建立DNA重组技术 80年代以后 分子生物学、分子遗传学等学科突飞猛进发展，实施人类基因组计划（HGP）,核酸分类和分布,脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）:遗传信息的贮存和携带者，生物的主要遗传物质。在真核细胞中，DNA主要集中在细胞核内，线粒体和叶绿体中均有各自的DNA。原核细胞没有明显的细胞核结构，DNA存在于称为类核的结构区。每个原核细胞只有一个染色体，每个染色体含一个双链环状DNA。 核糖核酸（ribonucleic acid, RNA）：主要参与遗传信息的传递和表达过程，细胞内的RNA主要存在于细胞质中，少量存在于细胞核中，病毒中RNA本身就是遗传信息的储存者。另外在植物中还发现了一类比病毒还小得多的侵染性致病因子称为类病毒，它是不含蛋白质的游离的RNA分子，还发现有些RNA具生物催化作用（ribozyme）。,核酸的基本结构单位核苷酸,1 核酸分子中核苷酸的化学组成与命名 (1) 核苷酸 (2) 常见（脱氧）核苷酸的基本结构与命名 (3) 稀有核苷酸 (4)核苷酸、核苷、碱基、五炭糖的概念和关系 2 细胞内游离核苷酸及其衍生物,多磷酸核苷酸 环核苷酸 辅酶类核苷酸 其它核苷酸衍生物,5-磷酸核苷酸的基本结构,Nitrogenous base,Pentose sugar,Phosphate,核糖和脱氧核糖,基本碱基结构和命名,Adenine (A),Guanine (G),Cytosine (C),Uracil (U),Thymine (T),pyrimidine,核苷酸（nucleictide）,H,腺嘌呤核苷酸（ AMP） Adenosine monophosphate,脱氧腺嘌呤核苷酸（dAMP） Deoxyadenosine monophosphate,常见（脱氧）核苷酸的结构和命名,鸟嘌呤核苷酸（GMP）,尿嘧啶核苷酸（UMP）,胞嘧啶核苷酸（CMP）,腺嘌呤核苷酸（AMP）,脱氧腺嘌呤核苷酸（dAMP）,脱氧鸟嘌呤核苷酸（dGMP）,脱氧胞嘧啶核苷酸（dCMP）,脱氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP）,核苷酸的组成,几种稀有核苷酸,cAMP cGMP,FAD,NAD、NADP,HSCoA,辅酶,UDPG的结构,腺苷酸及其多磷酸化合物,AMP Adenosine monophosphate,ADP Adenosine diphosphate,ATP Adenosine triphosphate,第三节 DNA的分子结构,一、 DNA 一级结构 二、 DNA的二级结构 三、 DNA的三级结构,DNA 的一级结构, DNA分子中各脱氧核苷酸之间的连接方式（3-5磷酸二酯键）和排列顺序叫做DNA的一级结构，简称为碱基序列。一级结构的走向的规定为53。不同的DNA分子具有不同的核苷酸排列顺序，因此携带有不同的遗传信息。 一级结构的表示法,DNA一级结构的表示法,DNA酶法序列分析的原理,酶反应,电泳方向,5,3,引物,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddATP,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddTTP,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddGTP,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddCTP,A C G T,DNA的二级结构,（1） DNA的双螺旋结构(Watson-Crick模型) DNA双螺旋结构特征及意义 （2） DNA双螺旋的多态性 （3）某些其它DNA螺旋结构 DNA回文结构 、 三链DNA 、四链DNA,DNA的双螺旋结构的形成,DNA的双螺旋模型特点, 两条反向平行的多聚核苷酸链沿一个假设的中心轴右旋相互盘绕而形成。 磷酸和脱氧核糖单位作为不变的骨架组成位于外侧，作为可变成分的碱基位于内侧，链间碱基按AT，GC配对(碱基配对原则，碱基互补, Chargaff定律)。糖环平面与中轴平行，碱基平面与纵轴垂直。 螺旋直径2nm，相邻碱基平面垂直距离0.34nm,螺旋结构每隔10个碱基对（base pair, bp）重复一次，间隔为3.4nm,3.4nm 10个核苷酸,2nm,由于碱基对排列的方向性，使得碱基对占据的空间是不对称的，因此，在双螺旋的表面形成大小两个凹槽，分别称为大沟和小沟，二者交替出现,Chargaff定则（1950s,E. Chargaff发现）,DNA碱基组成符合： A=T；G=C； A+G=T+C。 不对称比率：A+T/G+C； 物种不同，DNA碱基组成不同； 物种亲缘愈接近，碱基组成也愈接近，该比 率越相近似。 .具有种的特异性，没有器官和组织的特异性，年龄、营养状况、环境的改变不影响DNA的碱基组成。,提出DNA双螺旋结构模型的根据,Rosalind Franklin (1920 - 1958),James Watson (1928 ) & Francis Crick (19162004),DNA XRD diffraction patterns obtained by Franklin,Published paper by Watson & Crick, 氢键横向稳定性. 碱基堆集力纵向稳定性 碱基处于疏水环境中 磷酸基上负电荷被胞内组蛋白或正离子中和,DNA的双螺旋结构稳定因素,DNA的双螺旋结构的意义,双螺旋结构的理论促进了近代核酸结构功能的研究和发展，是生命科学发展史上的杰出贡献，被认为是现代分子生物学诞生的标志。其深刻意义在于：1、确立了核酸作为信息分子的结构基础，提出了碱基配对是核酸复制、遗传信息传递的基本方式，从而最终确定了核酸是遗传的物质基础。2、提出了作为遗传功能分子的DNA的复制方式，半保留复制是生物体遗传信息传递的最基本方式。,DNA双螺旋的不同构象,三种DNA双螺旋构象比较,A B Z,外型 粗短 适中 细长,螺旋方向 右手 右手 左手,螺旋直径 2.3nm 2.0nm 1.8nm,碱基直升 0.255nm 0.34nm 0.37nm,碱基夹角 330 360 60.00,每圈碱基数 11 10 12,轴心与碱基对关系,2.46nm 3.32nm 4.56nm,碱基倾角 200 00 70,糖苷键构象 反式 反式 C、T反式，G顺式,大沟 很窄很深 很宽较深 平坦,小沟 很宽、浅 窄、深 较窄很深,DNA回文序列及几种结构形式,回文序列（反向重复序列）,发夹式结构,十字形结构,中心区域,DNA二级结构的多样性,Holliday结构,嘌呤-嘌呤-嘧啶型（Pu-Pu-Py型） 即：AAT；GG C 嘧啶-嘌呤-嘧啶型（Py-Pu-Py型） 即：TAT；C G C,三股螺旋DNA即三链DNA,quadruplex DNA,DNA的三级结构,在细胞内，由于DNA分子与其它分子（主要是蛋白质）的相互作用，使DNA双螺旋进一步扭曲形成的高级结构. 实例：超螺旋 染色体（ chromosome） 病毒（virus）,DNA超螺旋结构的形成,1）超螺旋是指双螺旋进一步扭曲或再螺旋的构象。 2）正超螺旋（变紧，过旋）和负超螺旋（变松，欠旋）。,核小体盘绕及染色体示意图,组蛋白与DNA的结合,真核生物染色体DNA组装不同层次的结构,DNA （2nm）,核小体链（ 11nm，每个核小体200bp）,纤丝（ 30nm，每圈6个核小体）,突环（ 150nm，每个突环大约75000bp）,玫瑰花结（ 300nm ，6个突环）,螺旋圈（ 700nm，每圈30个玫瑰花）,染色体（ 1400nm，每个染色体含10个玫瑰花200bp）-人的染色体压缩8000-10000,噬菌体T2结构,DNA,动物病毒切面模式图,被膜（脂蛋白、碳水化合物）,衣壳（蛋白质）,核酸,突起（糖蛋白）,病毒粒,（DNA或RNA）,第四节 RNA的分子结构,一、RNA一级结构 、特点、类别 二、tRNA 的分子结构 三、rRNA的分子结构 四、mRNA的分子结构,RNA的一级结构,RNA分子中各核苷之间的连接方式（3-5磷酸二酯键）和排列顺序叫做RNA的一级结构,RNA的结构特点类别,信使RNA（messenger RNA，mRNA）：在蛋白质合成中起模板作用； 核糖体RNA（ribosoal RNA，rRNA）：与蛋白质结合构成核糖体（ribosome）,核糖体是蛋白质合成的场所； 转移RNA（transfor RNA，tRNA）：在蛋白质合成时起着携带活化氨基酸的作用。 其它RNA 1.分子较小； 2. 多为单链结构，少数局部形成螺旋（发夹结构）； 3.碱基组成：A、G、C、U （AU/GC）； 4. 稀有碱基较多，稳定性较差，易水解。,tRNA 的结构,二级结构特征： 单链 三叶草叶形 四臂四环,三级结构 特征： 在二级结构基础上进一步折叠扭曲形成倒L型,酵母tRNA Ala 的二级结构,3,5,密码子tRNA反密码子氨基酸是对号入座的,tRNA的三级结构,tRNA 的特点,约占总RNA的10-15%，分子最小。 已知每一个氨基酸至少有一个相应的tRNA。 它在蛋白质生物合成中起翻译mRNA信息，并将相应的氨基酸转运到核糖体，参与蛋白质体的合成。,rRNA的分子结构,特征： 单链，螺旋化程度较tRNA低 约占全部RNA的80-85%，含量最多。 与蛋白质组成核糖体后方能发挥其功能特征,rRNA的分子结构,原核生物 16S rRNA 真核生物18S rRNA,mRNA的分子结构,原核生物mRNA特征： 先导区+翻译区（多顺反子）+末端序列 真核生物mRNA特征： “帽子”（m7G-5ppp5-N-3p）+单顺反子+“尾巴”（Poly A）,原核细胞mRNA的结构特点,真核细胞mRNA的结构特点,特点,约占总RNA的3%-5%，含量最少，种类最多。 成熟mRNA不含内含子，hnRNA含有。 mRNA从DNA转录遗传信息，并作为蛋白质合成的模板，决定蛋白质的氨基酸顺序。,第五节 核酸的某些理化性质及 核酸研究常用技术,一、核酸的两性解离性质和等电点 二、核酸的水解 三、核酸的紫外吸收特性(max=260nm) 四、核酸的沉降特性 沉降系数(s) 五、核酸的变性、复性和分子杂交,核酸的水解,核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。 DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。室温条件下，DNA在碱中变性，但不水解，RNA水解。 在细胞内核酸分子受DNA酶作用。,加热,部分双螺旋解开 无规则线团 链内碱基配对,变性：是在物理或化学因素作用下核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的氢键断裂，变成单链结构的过程。,过量酸，碱pH(11.3或4.0) ;加热;低离子强度;变性试剂如尿素、甲酰胺、甲醛等有机溶剂,DNA变性的特征,变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。 变性改变了DNA的二级结构，一级结构(碱基顺序)保持不变。 紫外吸收值明显增加，即增色效应。 DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。 DNA熔解温度 粘度降低，沉降系数增加。,Tm：熔解温度（melting temperature）,当50%的DNA变性时的温度称为该DNA的解链温度，即增色效应达到一半时的温度；一般DNA的Tm值在70-85C之间。 Tm的大小与DNA均一性、溶液盐浓度、G和C的含量有关（经验公式计算： G+C)%=(Tm-69.3)X2.44）。,1,2,3,DNA的紫外吸收光谱,天然DNA 变性DNA 核苷酸总吸收值,1 2 3,复性：变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，其物理性质和生物活性随之恢复，这一过程称为复性。 对于热变性的DNA，在缓慢冷却的条件下可重新结合恢复双螺旋结构，称为退火。,加热,缓慢冷却,加热,缓慢冷却,DNA的复性条件,1.将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。即淬火。 2.将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性。退火温度Tm25 3.分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，DNA的复性需要一定的盐浓度，也与它本身的组成和结构有关。,分子杂交的原理示意图,变性（加热）,分子杂交的原理示意图,不同来源的DNA单链间或单链DNA与RNA之间只要有碱基配对的区域，在复性时可形成局部双螺旋区，称核酸分子杂交（hybridization）。制备特定的探针（probe）通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究。 实例：southern印迹法,第六节 DNA研究进展,一、人类基因组计划简介 （Human Genome Project，HGP） 二、DNA芯片技术简介 （DNA chip）,人类基因组计划简介 （Human Genome Project，HGP）,该计划是美国科学家在1985年率先提出，1990年正式启动。美、英、德、法、日先后参加了此项工作，1999年我国成为 HGP的第六个成员国。 HGP旨在阐明人类基因组DNA所具有的3109核苷酸的序列，发现所有的人类基因并阐明其在染色体上的位置，破译人类的全部遗传信息，使得人类第一次在分子水平上全面地认识自我。 到目前为止，已完成了人类基因组的框架图，测序的工作已基本完成。 HGP的实施，揭开了生命科学新的一页，它可以造福于人类，但也面临的伦理的挑战。,1994年，我国HGP在吴旻、强伯勤、陈竺、杨焕明的倡导下启动，最初由国家自然科学基金会和863高科技计划的支持下，先后启动了“中华民族基因组中若干位点基因结构的研究”和“重大疾病相关基因的定位、克隆、结构和功能研究”，1998年在国家科技部的领导和牵线下，1998年在上海成立了南方基因中心，1999年在北京成立了北方人类基因组中心，1998年，组建了中科院遗传所。1999年7月在国际人类基因组注册，得到完成人类3号染色体短臂上一个约30Mb区域的测序任务，该区域约占人类整个基因组的1。,青山衬托之下，是一片金灿灿的中国水稻梯田。2002年4月5日以中国梯田为封面的 Science杂志以14页篇幅率先发表了一个重大成果中国人独立完成的论文水稻（籼稻）基因组的工作框架序列，显示对中国科学家成就充分肯定。,COVER Photograph of the Honghe Hani rice terraces in Yunnan Province, China. In this issue, two separate research groups report draft sequences of two strains of rice-japonica and indica. In addition, the Editorial, News Focus, Letters, and Perspectives highlight the significance of the rice genome to the worlds population. Image: Liwen Ma and Baoxing Qiu, Beijing Genomics Institute,HGP取得的成就, 完成了人类基因组工作草图绘制,揭示了人类基因组若干细节 基本上测定了人类基因组上的碱基序列 一些模式生物(果蝇、拟南介等)和作物（如水稻）基因草图绘制成功，测序基本完成 促进了生物信息学、蛋白质组学、糖组学的迅猛发展 人类基因组草图绘就，中国科学家功不可没,HGP面临的挑战, 基因的隐私权问题 基因组图谱和信息的使用与人的社会权利问题 基因资源问题 基因知识的滥用问题,DNA芯片技术简介,DNA芯片(DNA chip)技术是采用寡核苷酸原位合成或显微打印手段，将数以万计的DNA探针片段有序地固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品的快速、并行、高效地检测或诊断。 由于常用硅芯片作为固相支持物，且在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术，所以称为DNA芯片技术。,人类将进入生物经济时代,基因操纵生命的工具 基因组潜藏着巨大的经济价值 基因技