植物性饲料中植酸磷水解度测定方法的研究.doc

植物性饲料中植酸磷水解度测定方法的研究摘 要:研究了测定植酸酶降解植物性饲料中植酸磷程度的方法。该方法通过钒钼酸铵比色法测定植物性饲料水解液中磷的含量,进而求出其中植酸磷的水解度,并和重量法进行相关性比较,结果表明该方法是一种简便、快捷、准确度和精密度高的方法。关键词:植物性饲料;植酸酶;水解度;植酸磷;钒-钼酸铵比色法;重量法A Study on Determ iningM ethod for Hydrolysis Degree ofPhosphor Phytate in Vegetable FeedsABSTRACT:A method for determining the degradation of phosphor phytate degree in vegetable feeds by phytase was studied. Thephosphor content in digestofvegetable feedswas determined by vanadium ammonium molybdate colorimetry, then the hydrolysis degreeof phosphor phytatewas determined and the relativitywith gravimetricmethodwas compared. The resultshowed that thiswas a simple,rapid, high-accurate and exactmethod.KEYWORDS:vegetable feed; phytase; degree ofhydrolysis; phosphorphytate; vanadium-ammonium molybdate colorimetry; grav-imetricmethod 植物性饲料中磷的40% 80%以植酸磷形式存在1。这样不仅降低单胃动物对磷的有效吸收,还影响动物对饲料中蛋白质和钙、锰、铁等无机微量元素的吸收利用2。据报道,植酸酶添加到植物性饲料中能把植酸最终降解为肌醇和磷酸,增加动物对饲料中磷的吸收,从而降低磷排量,减少对环境的污染3。另外植酸酶还能把螯合在植酸上的营养物质给释放出来,提高饲料能量、蛋白质和矿物质的利用率和动物生产性能4。为了更好地研究植酸酶对植物性饲料中植酸磷的降解,本实验确定一种测定植物性饲料中植酸磷水解度的实验方法。该方法操作简便,准确度、灵敏度、精密度高。1 材料和试剂1.1 主要仪器UV-2102PC型紫外可见分光光度计:上海尤尼柯仪器有限公司;台式离心机:上海安亭科学仪器厂;精密酸度计:上海虹益仪器仪表有限公司; 78HW -1恒温磁力搅拌器,金坛市华峰仪器有限公司;电热恒温水浴锅,天津市泰斯特仪器有限公司。1.2 试剂浓硝酸; (1+1)硝酸溶液: 1体积浓硝酸与1体积蒸馏水混匀; (1+2)硝酸溶液: 1体积浓硝酸与2体积蒸馏水混匀;高氯酸; 6 mol/L盐酸; 1 mol/L盐酸; pH值5. 5的乙酸缓冲液:准确称取34. 02 g无水乙酸钠和0. 1 g吐温20于烧杯中,加入900 ml蒸馏水溶解,用盐酸调节溶液pH值至5. 50?0. 01,移入1 000 ml容量瓶中,并定容至刻度(室温保存2个月有效); 100 g/L钼酸铵:称取钼酸铵10. 00 g,加入浓氨水1. 0 m,l用蒸馏水溶解,移入100 ml容量瓶中并定容至刻度; 2. 35 g/L钒酸铵:准确称取0. 235 0 g偏钒酸铵,加入2. 0 ml(1+2)硝酸并用玻璃棒搅拌使之成细糊状,加蒸馏水溶解,移入100 ml棕色容量瓶中并定容至刻度(避光保存1周有效);显色剂: 2份(1+2)硝酸溶液, 1份钼酸铵溶液,1份钒酸铵溶液混合即得; 50 mmol/L基准磷酸二氢钾:准确称取0. 680 4 g在105e烘至恒重的基准磷酸二氢钾,用pH值5. 5的乙酸缓冲溶液溶解,并定容至100 m;l喹钼柠酮试剂:称取钼酸钠70 g,加蒸馏水150 ml溶解,为溶液,称取柠檬酸60 g,加水150 ml和浓硝酸85 ml溶解,在搅拌下将溶液倒入其中,为溶液,量取蒸馏水100 m,l加浓硝酸35 ml和喹啉5 m,l将该混合液缓缓倒入溶液中,放置24 h,过滤于1 000 ml的容量瓶中,加丙酮280 m,l用蒸馏水定容至刻度,混匀后贮存于塑料瓶中(有效期半年)。1.3 原料植物性饲料(米糠粕):市场上购得;植酸酶:夏盛实业集团有限公司, 5 000 U/g。2 分析方法2.1 测定原理植酸酶属于磷酸单酯水解酶,在弱酸条件下可以把植酸磷水解成肌醇和正磷酸盐,得到的正磷酸盐在酸性条件下可以与钒钼酸铵反应生成黄色钒钼磷酸,可比色测定其中的无机磷,进而求出植物性饲料中植酸磷的水解度。2.2 水解液的制备准确称取6份50 g(精确至0. 000 1)植物性饲料,分别与150 g水混匀,用6 mol/L盐酸调pH值为4. 0,然后分别加入相对植物性饲料0、0. 02%、0. 05%、0. 08%、0. 12%、0. 15%的植酸酶,在温度50e条件下反应4. 0 h后灭酶,稀张如意:植物性饲料中植酸磷水解度测定方法的研究/2009年第5期49 释至1 000 m,l干过滤,所得水解液备用。2.3 标准曲线的制作把50 mmol/L基准磷酸二氢钾稀释至2 mmol/L,然后取0. 11. 3 ml于25 ml比色管中,加3. 0 ml显色剂,用蒸馏水稀释至25 ml混匀,室温静置20 min,测350 nm处的吸光度,并绘制标准曲线,结果见图1。其回归方程为:A=0.373 0C+0.009 2, (1)式中,A为吸光度;C为磷的质量浓度,Lg /m;l相关系数R2=0. 997 2。图1 磷的标准曲线2.4 水解度的测定准确称取1 g左右(精确至0. 000 1)的植物性饲料,放入250 ml烧杯中,加1 mol/L盐酸20 m,l使之混匀,室温静置10 min后,加浓硝酸20 m,l放在电炉上加热至沸,沸腾34 min后稍冷,加高氯酸20 m,l继续放在电炉上加热消化,消化至溶液完全透明后冷却定容至250 m,l然后进行干过滤。所得滤液即是植酸磷完全降解液。对完全降解液进行适当稀释,取0. 30. 5 ml稀释液于25 ml比色管中(使测定值在图1的线性范围内),加显色剂3. 0 m,l用蒸馏水稀释至25 ml混匀,室温静置20 min,测350 nm处的吸光度。通过式(1)和稀释倍数算出所测滤液中的磷含量,进而求出植物性饲料中总磷的含量,以P1表示。对2. 2所得水解液适当稀释,取0. 10. 4 ml稀释液于25 ml比色管中,加显色剂3. 0 m,l用蒸馏水稀释至25 ml混匀,室温静置20 min,测350 nm处吸光度。通过式(1)和稀释倍数算出所测水解液中的磷含量,进而求出植物性饲料中无机磷和降解植酸磷中磷的总含量,以P2表示。准确称取2 g(精确至0. 000 1)植物性饲料,放入200 ml容量瓶中,加入蒸馏水浸泡56 h后定容至刻度,然后干过滤,对所得滤液进行适当稀释,取稀释液5. 0 7. 0 ml于25 ml比色管中,加显色剂3. 0 m,l用蒸馏水稀释至25 ml混匀,室温静置20 min,测350 nm处吸光度。通过式(1)和稀释倍数算出所测滤液中的磷含量,进而求出植物性饲料中无机磷的含量,以P3表示。按式(2)计算植酸酶降解植物性饲料中植酸磷的水解度:DH=(P2-P3)A(P1-P3)100%。(2)3 结果与分析3.1 回收率与精密度试验为了验证此种方法的精密性、准确性及可行性,我们采用该方法对2. 2中的6份植物性饲料水解液进行了DH精密度、磷回收率的试验,并与重量法5进行了相关性分析。其结果分别见表1、表2和图2。表1 DH精密度试验批次DH%平均值%标准偏差%变异系数%1 0 0 0 0228. 15 28. 37 28. 9128. 25 28. 31 29. 1728. 53 0. 38 1. 32341. 47 41. 49 41. 4241. 46 41. 56 41. 4041. 47 0. 05 0. 12447. 40 47. 52 47. 4147. 48 47. 44 47. 3747. 43 0. 05 0. 11567. 46 67. 57 67. 4867. 44 67. 59 67. 4567. 50 0. 06 0. 09689. 42 89. 40 89. 4989. 53 89. 51 89. 4089. 46 0. 05 0. 06表2 磷的回收率试验批次滤液中磷的质量浓度g#L-1加入量g#L-1测得量g#L-1回收率%1 0. 038 2 0. 620 0 0. 677 1 103. 052 0. 255 2 0. 620 0 0. 881 6 101. 033 0. 376 3 0. 620 0 1. 010 2 102. 244 0. 423 4 0. 620 0 1. 037 5 99. 055 0. 586 3 0. 620 0 1. 223 9 102. 846 0. 764 5 0. 620 0 1. 378 7 99. 06图2 钒-钼酸铵比色法测植酸磷水解度与重量法的相关性3.2 试验结果分析由表1可知,该法测得的结果精密度较高好,用于测定植物性饲料中植酸磷的水解度稳定性较高。从表2得知,该法测得磷的回收率为99. 05% 103. 05%,结果准确。另外由图2可知,该方法与重量法的测得结果较为一致。4 结论利用钒钼-酸铵比色法测定植物性饲料水解液中磷的含量,进而求出植物性饲料中植酸磷的水解度,不仅具有较高的准确性和精密性,而且还具有简便、快速的特点。因此,该方法可以用来研究植酸酶降解植物性饲料中植酸磷的程度,为植物性饲料的合理利用提供依据。参考文献1 苏 琪,陆肇海,段玉琴.植物饲料中植酸磷的含量及测定J.饲料研究, 1983(4): 1113.2 廖明星,顾振新.植酸酶基因工程及开发利用研究J.食品科学, 2003, 24(1): 155158.3 Gentile JM, RonekerK R, Crowe S E, PondW G, LeiX G. E-ffectiveness of an ExperimentalConsensusPh