转基因生物第十三周星期五上午.ppt

1 转基因生物 第四章 Transgenic Transgenic biologybiology 龚青 副教授 基因: 是一个特定的DNA片段 ，编码一种 特定的多肽或蛋白质，是遗传信息的功能 单位 n一般说来，从细菌到哺乳动物的全 部生命有机体，它们的基因都是由 DNA构成的。由于所有生物的DNA的 基本结构是一致的，因此，来自两 种生命形态的基因可以融为一体。 n由此可见，基因的DNA共性，是进行 基因工程的重要理论基础之一。 nDNA分子是遗传物质和基因的载体。 基因是细胞中所有的RNA及蛋白质分 子的“蓝图”。 n一旦基因发生突变，那么由它指导 合成的蛋白质也将随之发生变化， 甚至可能导致活性的丧失。 1）转基因：将人工分离和修饰过的基因导入到 生物体基因组中。 2）转基因技术（Transgene technology）：指 利用分子生物学技术，将某些生物的基因转移 到其它物种中，改造生物的遗传物质，并使其 在性状、营养和消费品质等方面向人类需要的 目标转变。 转基因技术 自然选择人工定向改造 转基因技术 将希望转入的基因注射到小鼠的受精卵的细胞核中，使注射 的DNA整合到受精卵的基因组中。然后将该卵细胞注射（移植 ）到宿主鼠的子宫中，使其发育，产下子代小鼠，从子代鼠中提 取DNA样品，检测外源基因（转移基因）是否整合到了子代鼠 中。 成功 移植 不成功 移植 探针检测到转移基因 将注射外源基因的 卵移植到宿主鼠子 宫中 向受精卵 中注射外 源基因 通常都是将提取的DNA用限制性内切酶进行酶切，然 后电泳，将电泳后凝胶上的核酸物质转移到薄膜（硝酸纤 维素薄膜）上，用探针检测是否存在转移基因。探针是能 够与转移基因结合的一段单链DNA或RNA。 著名的转基因鼠实验是让小鼠携带额外的生长激素基 因，结果接受了外源生长激素基因的受精卵发育的小鼠的 体重是正常小鼠体重的两倍。 利用苏云金芽孢杆菌在 西红柿细胞DNA内引入一段 基因，这段基因能够编码出 对毛毛虫有毒性的蛋白，抑 制虫害。 抗毛毛虫西红柿 正 常 鼠 转入生长 激素基因 的小鼠 转基因微生物：分解石油的假单孢杆菌等 转基因动物：转基因牛、猪、鸡、鲤鱼等 转基因植物：转基因大豆、转基因抗虫棉、 转基因玉米、转基因水稻、转基因抗除草剂农作物 等 转基因生物 转基因动物转基因植物 转基因动物：以实验方法将外源基因导入动 物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的 一类动物。 第一节 转基因动物 特点 分子及细胞水平操作，组织及动物整体 水平表达 转基因动物的研究历史 1974年，美国学者Jaenisch首次应用显微镜 注射法获得转基因小鼠。 1981年，美国科学家成功地将外源基因导 入动物胚胎，创立了转基因动物技术。1982 年获得转基因小鼠。 1982年，Palmiter将大鼠的生长激素基因导 入小鼠受精卵中，获得体重是对照组2倍的“超 级鼠”。 1985年，Wagner等利用拼接有新霉素抗性基 因的逆转录病毒感染胚胎干细胞（ES细胞）， 获得嵌合体小鼠，为利用ES细胞制备转基因小 鼠开辟了先河。 转基因超级鼠转基因超级鼠 1982年，英国的自然杂志发表了一篇文章： 有两个美国实验小组利用转基因技术，将大鼠生 长激素重组基因导入到小鼠受精卵中，培育出具 快速生长效应的“转基因超级鼠”。转基因鼠比与 它同胎所生的小鼠生长速度快23倍，体积大一 倍。 1989年，意大利学者用精子作为载体转移目 的基因，成功地获得了纯系转基因小鼠。 1987年，世界上第一只商业化转基因绵羊在 英国著名的罗斯林研究所诞生。这只转基因母 羊的乳汁中可以分泌-抗胰蛋白酶，含量高达 30毫克/升。 1997年2月，英国罗斯林研究所维尔穆特博 士科研组公布体细胞克隆羊“多利”培育成功。 1999年2月，上海遗传研究所宣布转基因试 管牛“滔滔”诞生，其体内被检测到带有人的血 清白蛋白基因，这项成果被评为当年“中国十 大科技进展”之一。 1997年10月，英国罗斯林研究所（Roslin） 宣布已成功克隆出3只携带有人凝血因子基 因转染绵羊。 二、基本原理 获取外源目的基因 实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中 目的基因整合到基因组中 再植入受体动物输卵管(子宫) 揭示外源基因的功能 显微注射等 基因转移方法 发育成携带有外源基因的转基因动物 培育优良的动物品种 转基因技术操作的具体流程 （一）目的基因的设计 转基因可分为随机整合型基因和基因敲除（gene knockout）型载体基因。随机整合型基因要求结构完 整，包括5上游启动子区和3下游区等，多用基因 组文库筛选或人为改造基因，改造基因可选择不同的 启动子来控制外源基因表达的组织特异性。基因敲除 （gene knockout）型载体基因要设计与待剔除基因 的同源性的载体基因。 三、转基因的基本方法三、转基因的基本方法 （二）重组载体的构建 选择合适的基因载体，要求载体序列不干扰外源 基因的表达、能接受外源DNA、稳定、对宿主细胞无 威胁。 （三）重组载体的体外验证（in vitro） 重组载体的正确性验证，如拷贝数、连接方向等。 对于连有组织特异性启动子或局部体细胞转染的载体 需先在同类型的体外离体培养细胞中初步验证表达特 性。 （四）基因转移 1）化学法 2）物理法 3）生物法 （五）转基因动物模型的验证 从基因组、mRNA、蛋白质和整体表型各个层次进行 验证。用核酸杂交、聚合酶链反应、免疫印迹杂交、 酶联免疫法、免疫荧光法和Western杂交法等多种方 法，筛选出有外源基因整合的阳性动物，传代后检测 外源基因在转基因动物中的表达情况，对外源基因表 达产物的生物活性和生化性质进行鉴定，以及检查转 基因动物的生理功能和是否出现某些疾病症状的表型 等。 （六）组建转基因系 第一代转基因动物是半合子转基因动物，因为 外源基因仅在一条染色体上稳定整合。只有通过选 种选配，将两个半合子转基因动物成功交配，才能 得到纯合子转基因动物，建立转基因动物家系，外 源DNA才能在后代中稳定遗传。 1、显微注射法：以单细胞受精卵为靶细胞， 利用显微注射技术将构建好的外源DNA直接注 射到受精卵的原核内，再把接受注射的受精 卵移入假孕母体输卵管，使之发育成正常的 幼仔，获得转基因动物个体。 目前应用较广泛，最早最经典的方法。 操作技术性很强，受过严格训练的专业人 员操作，发育成转基因动物的受精卵也只占 注射卵的5。因此用增大微注射受精卵的数 目的办法提高成功率。 转基因的主要技术 1）显微注射法 microinjection 它是创造转基因 动物的有效途径 。 microinjection n 显微注射法将外源基因导入生殖细胞和体系胞 后，在染色体上的整合位置是随机的 n 外源基因甲基化程度在胚胎发育过程中会影响 其活性 n 某些外源基因的表达程度可受到个体细胞正常 调节机制的控制 n 由于受到宿主组织分化的影响，外源基因还具 有一定的组织特异性 显微注射法获得转基因鼠的成活率 优点： 外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；导入 过程直观； 无需载体 缺点： 设备昂贵、环节较多 对操作人员有较高的技术要求 效率低（尤其是大家畜） 对卵子伤害大，胚胎存活率低 转基因沉默 2、胚胎干细胞（ES细胞）法 ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外 培养建立起来的多潜能细胞系。 它是一种含正常二倍体染色体的具有 发育全能性的细胞。 可以在体外进行人工培养，扩增，并 能以克隆的形式保存。 将携带有外源基因的ES细胞注射入动 物的早期胚胎内，将来出生的动物的生殖 系统就有可能整合上外源基因。再通过杂 交繁育得到纯合目的基因的个体，即为转 基因动物。 目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应 用比较成熟，在大动物上应用较晚。 优点： 1.外源基因整合情况的可控性高,可预先在细胞水 平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平 及插入的稳定性 2.外源基因导入ES细胞的方法多样，如逆转录病 毒感染法、电击法等，细胞鉴定及筛选方便 缺点： 1. ES细胞系建立及培养困难 2. 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成 高滴度病毒颗粒，人为感染着床前后的胚胎（也 可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细 胞共同培养以达到感染目的), 获得转基因动物 的方法。 目前这种方法主要应用于鸡胚胎操作。 3、逆转录病毒感染法 反转录病毒感染法的载体的构建 提取病毒未整合的环状形式DNA； 将环状DNA克隆到适当的载体中； 选择适当的酶将病毒结构蛋白编码区切除； 将外源目的基因克隆到载体中 通过物理方法将重组DNA分子转入包装细胞 反转录病毒载体的工作原理：寄生在受体细胞中的重组病毒由 于没有包装信号，能生产病病毒RNA和所有蛋白质，但不能 包装成病毒颗粒；病毒载体转化受体细胞后，载体上的包装信 号将使包装蛋白把载体包装成为侵染生的病毒颗粒。 优点： 受精卵携带外源基因的阳性率高 外源基因多单拷贝整合 操作简单，避免注射法对卵子的损害 宿主范围广 可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高 缺点： 容纳大小有限 潜在致癌性,载体复杂 整合率不高,胚胎自我保护机制对其有抗性 4、体细胞核移植方法 ： 将外源基因导入到体细胞中，将外源基因导入到体细胞中，筛选、培养、扩增 ，用这种细胞的细胞核进行用这种细胞的细胞核进行核移植，核移植，即即把把体细胞核核 植入一个植入一个去了核的卵母细胞去了核的卵母细胞中，融合并激活，将中，融合并激活，将重重 构胚胚胎进行体外培养或者植入同步化的假孕动物的进行体外培养或者植入同步化的假孕动物的 输卵管。输卵管。 1997年2月17日英国Roslin研 究所的Wilmut从1只六岁母羊 的乳腺上皮细胞成功的克隆 到了一只绵羊一多利(Dolly) 。这是人类第一次采用分化 的体细胞作为供体细胞，它 的成功是20世纪生物学重大 突破之一。 学术意义在于证明分化的 体细胞甚至是分化终端的体 细胞核仍有全能性。 优点： 转基因效率显著超过显微注射 可以方便的建立生产畜群 可以预测基因表达水平 可以使用定点整合目标基因的技术 对体细胞进行基因改造后，用于核移植可以提高转 基因的效率，具有“ES细胞途径”的全部优点，且物 种适用面广。 缺点： n 技术上难度大，成功率极低， n 胚胎死亡率高， n 非一般实验室可以开展。 直接以精子为载体的转基因方法：将成熟精子与 外源共培养，成熟精子与外源DNA预培养之后 使精子有能力携带外源DNA进入卵子中，使之受精， 并使外源DNA整合到染色体中。 目前国际上只有1例成功模型，国内也很少有相 关报道，精子载体法很少被应用。 5、精子载体法 染色体及基因水平：斑点杂交、 Southern杂交、PCR 转录水平：Northern杂交 蛋白质水平：Western印迹 转基因动物中外源基因的检测 转基因动物研究存在的问题 转基因动物的低效性 转入基因造成宿主基因突变问题 转入基因的表达问题 病毒转基因研究存在的问题 转基因动物模型与预期不符问题 乳腺生物反应器的问题 社会问题 转基因动物研究出现的问题 1、制作转基因动物效率低：如显微注射法生产转基因 动物小鼠、大鼠、兔、牛、猪、绵羊，转基因阳性率 分别为26%、44%、15%、0.7%、0.9%,0.9%。 2、外源基因在宿主基因组中的行为难以控制：转基因 随机整合于动物基因组中，有可能引起宿主细胞染色 体的插入突变，可造成插入位点的基因片段的丢失及 位移，也可能激活正常情况下处于关闭的基因。其结 果导致转基因阳性个体出现不育、胚胎死亡、流产、 畸形等异常现象。 3、转基因表达水平低：许多转基因的表达水平受到宿 主染色体上整合位点的影响，出现异位表达，影响转 基因的表达能力，从而使大部分转基因表达水平较低 转基因动物的应用 一、转基因动物在生命科学基础研究中的应用 研究基因的结构与功能 研究基因的组织特异性表达 研究发育相关基因的表达与调控 克隆在发育中起重要作用的基因 基因多级调节系统的研究 细胞功能研究 基因敲除（gene knock out），是指对一个结构已知但功 能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或 用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测 相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分 观察整体推测功能的三部曲思想相似。 基因敲除的技术路线如下： （1）构建重组基因载体 （2）用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体 细胞核内 （3）用选择培养基筛选已击中的细胞 （4）将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物， 对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。 二、转基因动物在医药研究领域中的应用 研究病毒性疾病 研究建立人类疾病的转基因动物模型 转基因动物与基因治疗 生产天然活性药物蛋白 1、转基因动物是对多种生命现象本质深入 了解的工具。如研究基因的结构与功能的关 系、细胞发育的潜能性、细胞核与细胞质的 相互关系、胚胎发育调控、肿瘤、神经与发 育等。 n2、可用来建立多种疾病的动物模型，进而 研究这些疾病的发病机理及治疗方法。如 代谢病高歇氏(Gaucher)病转基因小鼠的应 用。 n3、转基因动物技术可由于改造动物的基 因组而改良其经济性状，提高经济效益。 n4、转基因动物可作为医用或食用蛋白的 生物反应器。如转基因山羊抗凝血酶III 、转基因绵羊1-抗胰蛋白酶、转基因兔 的-葡萄糖苷酶。 n5、通过转基因动物可以生产人体或动物进行 器官或组织移植时所需的器官和组织。如家畜 胎儿神经细胞可替代人类神经细胞用于帕金森 症的治疗。 n第三军医大学西南医院将转基因乳猪皮用于皮 肤移植。猪器官的体积和形状以及DNA基本与 人类相似，是理想的肾、心、肝等器官供应者 ，但存在免疫排斥，可通过转基因技术和克隆 技术培育大量不含免疫排斥的转基因克隆猪的 器官。 n乳腺生物反应器的研究 1987年，Gordon首次报道小鼠乳腺中表达 tPA蛋白。至今国际上转基因羊、转基因牛等 的成功报道实例已有10多种，生产出抗胰蛋白 酶、乳铁蛋白、人凝血蛋白因子、蛋白质C 等药用蛋白。国外经济学家预期，10年后，转 基因动物生产的药物销售额超过250亿美元。 基因药物生产 n基因药物生产第一阶段是细菌基因工程，第二 阶段是动物细胞基因工程，第三阶段是转基因 动物乳腺生物反应器。 n 三、转基因动物研究进展 n1、英格兰罗斯林研究所(Roslin)1997年成 功培育转基因绵羊，其乳汁中含有人的凝 血因子IX，用来治疗血友病；含有的-抗 胰蛋白酶可治疗北美肺气肿。 n2、日本培育的转基因鸡含有白血病阻止因子 ，可能成为生产抗癌药品的“动物工厂”。 n3、湖北省农科院魏庆信研究员2000年培育转 基因猪，能合成人血清白蛋白，为治疗因失血 、创伤、癌症等引起的休克、水肿等提供医用 血清白蛋白开辟了新途径。 n4、华中农业大学和中国农业大学合作，用转 基因小鼠乳腺表达人瘦蛋白的研究。 n5、用转基因技术生产的基因工程小鼠已经达到 很高的水平。如将特定的外源基因插入小鼠的基 因组，可得到转基因小鼠(transgenic mice)； 将小鼠的基因组中特定内源基因定点突变，可得 到基因剔除小鼠(gene knockout mice)；将小 鼠的基因组中特定内源基因进行定向重组，可得 到基因替换小鼠(gene knockin mice)。为医 学研究提供了丰富的动物模型。如BALB/C-HSF1 用于热休克研究、Smad3用于研究粘膜免疫缺陷 和骨性关节炎等。 n6、转基因研究已经渗透到医学、遗传学、发育 生物学、畜牧学等领域。 转基因动物的应用前景转基因动物的应用前景 1、研究外源基因在动物整体水平的表达调控 规律。 2、转基因动物疾病模型可用来进行疾病发病 学和治疗性研究 3、改善动物生产性能，提高动物育种效率。 4、改变动物基因使其表现型更适合人类需要 ，用转基因动物生产一些人类所需的生物活性 物质。 第二节 转基因植物 n转基因植物(transgenicplant)：是指利用 重组DNA技术将克隆的优良目的基因导入植 物细胞或组织中进行表达，从而获得新性状 的植物。 n这一技术使基因交流的范围无限扩大，可将 从细菌、病毒、动物、远缘植物、人工合成 的基因导入植物，所以其应用前景十分广阔 一、基本方法 获取外源目的基因，克隆到表达载体 培养受体细胞，如培养悬浮细胞 将转化细胞进行适当培养 筛选阳性转化细胞 转基因植株的鉴定 电击法、基因枪法、显微注射法 培植阳性转化植株 抗 虫 基 因 1. 技术路线 目的基因分离植物表达载体的构建 受体材料的准备 遗传转化 转化组织 组织脱分化转化植株筛选 炼苗 1.目的基因的分离 n（1）已知基因的获得 n化学合成法 nPCR扩增 n（2）未知基因的获得 n构建基因组文库，筛选目的基因 n构建cDNA文库，筛选目的基因 nmRNA差异显示技术筛选差异表达基因 n差异蛋白质谱表达技术筛选功能基因 n pGEM-T 银杏叶银杏叶RNARNA提取提取 反转录cDNA 全长cDNA的克隆 克隆及测序 两端引入酶切位点 双酶切 定向克隆 导入农杆菌 2.植物表达载体的构建 例 pBI121-chs构建 pBI121图谱 3.遗传转化 n（1）间接转化法农杆菌介导转 化法 n（2）直接转化法 n A、 基因枪转化法 n B、 电击法 n C、花粉管通道法 n D、 PEG介导基因转化法 v根癌农杆菌 v(Agrobacterium tumefaciens),是一种革兰氏阴性土壤杆菌,它含有Ti质粒, 能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤,即诱发冠瘿瘤.Ti质粒(包括Ri质粒)上有一段 转移DNA,在农杆菌侵染宿主植物时,这段DNA可以转移进植物细胞,并稳定地保 留在植物细胞染色体中,变为植物细胞新增加的一群基因,最终能通过有性世代遗 传给子代 。 v基因枪转化法由美国Cornell大 学的Sanfor (1987)提出,它的主要 原理是将包含目的基因的载体包 被在微小的金属微粒(钨粒或金粒) 表面,通过高压驱动力加速微粒穿 透植物细胞壁,导入受体组织细胞 内,然后通过组织培养再生出完整 的植株.微粒上的外源DNA进入细 胞后,整合到染色体上并得到表达, 从而实现基因的转化。 v电击法的主要原理是将原 生质体在溶液中与DNA混合 ,然后利用高压电脉冲作用, 使原生质体膜的某些部位被 击穿而产生可回复的小孔,外 源DNA可通过小孔进入原生 质体内,而且不影响经电击处 理的原生质体再生植物的能 力. v花粉管通道法是利用开花植 物授粉后形成的花粉管通道,直 接将外源目的基因导入尚不具 备正常细胞壁的卵、合子或早 期胚胎细胞,实现目的基因转化 . nPEG介导基因转化的主要原理是聚乙二醇(PEG)、多 聚-L-鸟核苷酸(pLO)、磷酸钙及高pH值条件下诱导 原生质体摄取外源DNA分子。PEG可促使细胞膜与DNA 间接触与粘连,并通过引起膜表面电荷的紊乱及干扰 细胞间的识别,利于细胞膜间的融合以及外源DNA进 入原生质体. 表1 几种植物转基因方法比较 转基因方法转化的优点转化的缺点 DNA间接转化 法 农杆菌介导基 因转移 受体种类，可以在原生 质体、蛋细胞和细胞团 、组织器官或整株等多 级水平上进行，方法成 熟可靠，简便易行，周期 短，转化率高； 转化双子叶植物为主 。大多数单子叶植物和 裸子植物对农杆菌的 侵入不敏感，限制了该 法在禾谷类作物中的 应用。 转化体常出现“嵌合” 现象，需在严格条件 下加以选择以淘汰未 转化细胞 DNA直接转化法 1）基因枪转 化法 2） 电击 法 3） PEG介导基因 转化法 4）花粉管通道法 无宿主限制，适用于各种 单、双子叶植物，操作 简单 转化效率低，需要专 门设备 （电击仪 、显 微操作仪或基因枪） ，多数需要原生质体与 愈伤组织 ，周期太长 （电击法） 4.转化组织 农杆菌介导之叶盘转化法 带有转化基因的农杆菌活化 受体植物 叶盘 侵染 共培养 筛选培养 诱导成苗 预培养叶盘， 或愈伤组织 5.炼苗 6.转基因苗的筛选与鉴定 培养过程中利用标记基因筛选 标记基因 选择标记基因(Slective gene) 报告基因(Report gene) 抗生素类选择基因 抗除草剂类选择基因 生物安全性标记类选择基因 -D-葡萄糖酸苷酶基因(Gus) 荧光素酶基因(Luc) 氯霉素乙酰转移酶基因(Cat) 绿色荧光蛋白基因(Gfp) 例 Gus检测 原理：葡萄糖酸苷酶基因（Gus）， 催化葡萄糖苷酯类物质水解。其中很 多水解产物具有发色团或形成