微生物降解石榴单宁为鞣花酸的研究-科技项目申报书.doc

项目类别研究类别编 号资助经费项目基础研究山东省高等学校科技计划项目申请书（A） 学科名称：生物技术 学科代码：0710 项目名称：微生物降解石榴单宁为鞣花酸的研究 项目负责人：杨露 所在学校：枣庄学院 填表日期：2015年2月10日山东省教育厅制填 表 说 明1.申请书为山东省高等学校科技计划项目的主要文件，是评审、立项和签订合同书的依据。各项内容须认真填写，表内栏目不能空缺，无此项内容时填“/”。2.填写申请书前，请认真查阅山东省高等学校科技计划管理办法。申请书各项内容应实事求是，表达要明确、严谨。外来语要同时用原文和中文表达，第一次出现的缩写词，须注出全称。“项目名称”（中文）要准确、简明、具体，字数（含符号）不得超过30个汉字。3“学科名称” 和“学科代码”请按照学位授予与人才培养学科目录（2005年12月更新版）填写，封面上填写该项目所属的一级学科及代码，项目基本信息表中填写该项目所属二级学科及代码。4.封面右上角的“项目类别”和“研究类别”与项目基本信息表相同。5.“人才计划”指获得省部级以上人才计划资助者。6.申请书及附件等书面材料均用A4纸双面打印，左侧装订，封面装订为纸质。 一、项目基本信息项目概况项目名称微生物降解石榴单宁为鞣花酸的研究 项目类别AA. 资助经费项目B. 自筹经费项目研究类别AA.基础研究B.应用研究申请经费0.1万元学科名称生物技术学科代码 071005 起止年限2015 年 3 月 至 2016年 3 月项目负责人姓 名杨露性 别女出生年月1993.10身份证 位学位授予时间 职称人才计划联系电-所在科技创新平台枣庄学院生命科学学院所在单位学校名称枣庄学院所在院系生命科学学院合作单位一合作单位二项目组情况总人数其中：教师职称情况其中：学生情况合 作单位数高级中级初级博士生硕士生41主要参加人员姓 名职 称身份证号工作单位项目分工签 名张立华教庄学院指导老师杨庄学院单宁提取含量测定，微生物培养正交实验杨荣庄学院微生物培养正交实验姜胜庄学院单宁提含量测定，微生物培养实验主要研究内容及技术经济指标（限200字）研究内容：筛选出能够降解石榴皮单宁为鞣花酸的微生物2-3种，并初步探索单宁降解酶的活性，研究不同条件下微生物对石榴皮单宁的降解效果，从而得出微生物降解石榴皮单宁为鞣花酸的最优条件。技术指标：1、微生物对石榴皮单宁的降解率达到70%以上。2、鞣花酸产率达20%以上。主题词（不超过3个）石榴皮；单宁；鞣花酸 二、立项依据（包括项目研究意义，国内外研究现状、水平和发展趋势，并附主要参考文献）项目研究意义：植物单宁的利用涉及林化、制革、食品、制药、石油等众多行业，然而石榴作为枣庄市的特色农产品，栽培面积已达到15万亩，年产量13万吨。石榴皮渣为石榴加工的副产物，多被废弃，或低价销售给一些企业进行简单加工，利用率不高。目前研究表明石榴皮中除含有较高的单宁，本项目拟在得到筛选驯化得到可降解石榴皮单宁为鞣花酸的优质菌种，以提高石榴皮资源的利用率。国内外研究现状、水平和发展趋势： 单宁(tannin)又称为鞣质，广泛存在于植物的叶、壳和果实以及树皮中，属于次级代谢产物。具有收敛性的涩味。BateSmith曾将单宁定义为：“单宁是分子量在5003000的能沉淀生物碱、明胶及其它蛋白质的水溶性酚类化合物。”单宁可与粘膜或唾液中的蛋白质生成沉淀或聚合物，产生口腔组织粗糙褶皱的收敛或干燥的感觉，单宁还可以与多种金属离子结合生成难溶性物质。单宁具有很大的横截面，易与蛋白质发生疏水结合，同时还含有许多能转变为醌式结构的苯酚基，能与蛋白质发生交联作用，而这些结合产物都会产生涩感。植物单宁的开发利用，涉及林化、制革、食品、制药、石油等众多行业。近年来，植物单宁的表面活性、与蛋白质、生物碱和多糖的反应、与金属离子的络合、对微生物和酶的抑制、抵御农作物病虫害。预防牲畜瘤胃臌胀病嘲、抗氧化及抗紫外等一系列重要的属性越来越多地被认识。目前，关于植物单宁应用基础以及开发利用的研究正日趋活跃。而对于其它高附加值精细化学品的研发和应用还不够深入，植物单宁及其衍生物的生物活性及其利用、植物单宁精细化产品的开发、植物单宁的降解与利用等，正成为国内外植物单宁研究领域的前沿性问题。已有的研究表明，植物单宁的利用与其分子量密切相关。分子量较大的单宁化合物收敛性强、颜色较深，适宜于作为制革鞣剂、粘合剂等使用；分子量较小的单宁化合物收敛性较温和，而且颜色浅淡、渗透性好，往往表现出更高的化学反应活性和生物活性。某些小分子酚类物(如桔酸、鞣花酸、花青素、儿茶素及其衍生物等)被较多地应用于化妆品、保健品、药物、食品等领域。因此，通过化学或生物降解获取高活性小分子多酚类化合物是植物单宁精细化利用的重要途径。石榴的综合利用研究，是目前国外学者研究的一个热点。石榴皮含多种活性成分，以鞣质、类黄酮及齐墩果酸为主，其中鞣质含量最高，约10%15%，类黄酮的含量约为5%6%，齐墩果酸含量约为0.5%。石榴皮中提取的鞣质成分可用于鞣制皮革，但产品的附加值相对较低。而鞣花酸(ellagic acid, EA)为石榴皮鞣质成份之一，具有抵抗肺癌、食管癌、抗氧化等作用。对人体免疫缺陷病毒、鸟的成髓细胞瘤病毒(AMV)的逆转录酶和 -及 -细胞 DNA 聚合酶的抑制性。石榴皮鞣质中游离的鞣花酸含量约为0.2%1%，其余为鞣花酸的衍生物，即鞣花单宁。有研究表明鞣花单宁在酸性条件下可被水解为鞣花酸，鞣花酸的得率可达石榴皮干重的3.5%5%。鞣花酸可作为医药、保健品、化妆品的原料，以石榴皮为原料制取鞣花酸可以大大提高产品的附加值。单宁的化学或生物降解，可以获得具有更大应用价值的小分子活性物质。虽然化学降解具有降解速率快的优点，但降解程度不易控制，副产物多，产物的精细化利用受到限制。相反，生物降解具有条件温和及特异性强等特点，具有化学降解无可比拟的优势，可以获取理想的单宁降解产物。单宁酶全称单宁酰基水解酶，是一种用途较广泛的水解酶，在开发茶饮叶新产品和改善天然食品的风味方面尤受重视。单宁酶用途广泛，它既可以水解单宁酸的酯键和缩酚酸键产生没食子酸和葡糖糖，也可以把没食子酸和丙醇合成没食子酸丙酯，还能水解茶叶中的酯型儿茶素，制备儿茶素单体，还可以作为食品添加剂用于开发茶饮料等。主要参考文献：规范格式：如：张立华,孙晓飞,张艳侠,等.石榴花化学成分及生物活性研究进展J.山东农业科学,2009,40(3):33-35.微生物降解塔拉单宁为棓酸的研究分泌涩柿单宁酶的微生物筛选及其酶特性的研究黄文,石碧,李庆,等.利用多菌种共培养降解橡椀单宁制备鞣花酸J.林产化学与工业,2002,01:21-24.三、研究目标、研究内容和拟解决的关键问题研究目标：采用梯度驯化法得到对石榴皮单宁耐受较高的优质菌种，研究在不同条件下微生物对石榴皮单宁降解为鞣花酸的特性，从而得到本实验条件下石榴皮单宁降解为鞣花酸的较优条件。研究内容：（1）石榴皮单宁降解菌的培养与纯化野生菌种的获得：将自然环境中的石榴皮在恒温箱中培养得到野生菌种。将得到的野生菌种多次划线培养直到得到纯菌种。（2）石榴皮单宁降解菌的筛选与驯化将得到的微生物首先接种在含有溴酚蓝的1%的石榴单宁的培养基上进行菌种初筛，筛选的到的菌种接种在不同浓度的石榴单宁浸提物培养基中驯化，根据测量培养基的相关组分的变化和微生物的生长情况得到对石榴单宁耐受浓度较高的优质菌种。（3）微生物降解石榴单宁为鞣花酸的工艺通过正交实验对比温度、PH、碳源氮源补充等因素对石榴单宁降解和鞣花酸产率的影响，得到较优条件。（4）石榴皮单宁降解酶的纯化与特性分析分离纯化石榴皮单宁降解酶，掌握该酶的一些理化特性。拟解决的关键问题：（1）获得降解石榴皮单宁能力强的菌种。（2）研究探索单宁降解酶的理化特性。四、研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析研究方法与实验方案： 1、单宁提取：酸提取法，有机溶剂回收。2、野生菌种的获得：将自然环境中的石榴皮培养获得的野生菌种反复划线培养，直至得到纯菌种。3、菌种驯化：将得到的纯菌种接种在含有溴酚蓝的1%的石榴单宁培养基上培养进行菌种初筛，筛选得到的菌种接种在不同浓度的石榴单宁浸提物培养基中驯化，测定保温培养后培养液中的COD值，计算COD的变化值，得出COD的变化率，以COD的去除率作为衡量单宁降解程度的指标，对菌种进行筛选，选取COD去除率较高的菌株。4、先通过单因素试验确定石榴单宁浓度、氮源补充、培养温度、PH各因素与单宁降解率鞣花酸产率之间的关系；再选用7因素2水平正交表，以石榴单宁、鞣花酸的含量为考察指标，确定最优的培养条件。5、培养基中的鞣花酸的纯化：单宁降解后续产生的沉淀用热吡啶溶解，冷却结晶，将结晶用冷水、热水、丙酮反复洗涤，然后真空干燥、称重，计算产率。技术路线： 粗单宁提取，含量测定野生菌种培养，纯化 单宁浓度、氮源补充、培养温度、PH单因素实验1%没食子酸培养基筛选耐受单宁的菌种23种四因素两水平正交实验。确定各菌种降解单宁的最优条件可行性分析：石榴皮单宁中的鞣花酸具有极强的抗氧化作用，具有防癌及抑制病毒的作用，在制药、生化、日化、食品以及精细化工等高科技领域具有广阔的应用前景，市场需求量大。随当前“追求自然”消费观念的兴起，从石榴皮中制取的植物源的鞣花酸倍受消费者的欢迎，也具有广泛的利用价值，市场前景十分广阔。 五、项目创新点本项目针对石榴皮利用效率低的现象，研究以石榴单宁为原料通过微生物降解获得鞣花酸的方法，相对于以往的化学降解法具有降解产物易控制，降解过程绿色无污染等优点，充分提高石榴皮的利用效率，大幅度提高产品附加值。六、项目负责人简历与已具备的研究基础、研究条件项目主持人杨露，枣庄学院在校本科生，实验操作认真、严谨，做事负责，曾获得枣庄学院生命科学学院首届生化技能大赛三等奖。项目组指导老师为枣庄市石榴工程技术研究中心研究人员，多年来一直从事石榴研究开发，在石榴研究面积累了丰富经验。项目组成员均为枣庄学院在校本科生，曾分别获得枣庄学院生命科学学院首届生化技能大赛一等奖、三等奖。品德良好、勤奋吃苦、成绩优异，对实验报有严谨负责的态度 七、项目进度安排及提供成果形式和水平2015年03月 至05月完成预实验，整理分析实验数据，根据实验中存在的问题寻找更进一步的解决方法。2015年06月至07月重复完成23次实验，得到更为优化的实验数据，整理分析数据。2015年08月至9月完成论文。 八、经费概算（单位：万元） 申请经费申请省教育厅经费0.1学校配套经费其他自筹经费总经费支 出 科 目预 算用 途1.实验材料费0.1原材料及提取、分析化学试剂2.仪器设备费/3.实验室改装费4.信息费5.调研费6.会议费7.图书资料费8.协作费9.成果鉴定费10.劳务费11.项目管理费合 计其中：仪器设备材料名 称规格型号数 量预 算/九、项目负责人承诺我确认本申请书及附件内容真实、准确。如果获得资助，我将严格按照山东省高等学校科技计划管理办法和本申请书的规定，认真履行项目负责人职责，积极组织开展研究工作，合理安排研究经费，按时报送有关材料并接受检查。若申请书及附件内容失实或在项目执行过程中违反管理办法的规定，本人将承担全部责任。 负责人签字： 年 月 日十、项目依托单位承诺已经按照山东省高等学校科技计划管理办法与项目申报要求对项目申请人的资格及项目申请书内容进行了审核。项目如获资助，我单位将根据项目申请书内容，落实项目研究所需配套经费及其他条件；按照