hiv感染实验室检测.ppt

艾滋病感染实验室检测 郭志宏 浙江省疾控中心 电话/传真:Email: HIV相关检测目的 l1.临床诊断 l2.安全输血 l3.流行病学调查、高危人群监测 l4.自愿咨询检测VCT l5.抗病毒治疗后效果检测 l6.抗病毒治疗耐药性检测 l7.免疫功能测定 HIV感染的实验室检测方法 常用HIV病原学检测方法: 1. 核酸检测（ cDNA测定-PCR、 RNA测定-病毒载量） 2. 病毒培养分离 3. P24抗原检测 常用HIV抗体检测方法: 初筛：1.酶联免疫吸附法 ELISA：第三代、第四代 2.快速检测 RT：金标、硒标 3.简单法 PA: 明胶颗粒凝集 确证：免疫印迹法 WB:（Western Blot）、RIBA 其他相关检测方法: 免疫功能测定：CD4/CD8检测 （一）HIV核酸检测 l1. HIV核酸定性检测：通常使用PCR或 RT-PCR技术，用于HIV感染的辅助诊断。 l2. HIV核酸定量检测：使用RT-PCR, NASBA, bDNA等技术，常用于监测HIV感染者 的病程进展和抗病毒治疗效果。 核酸检测特点： 能够用于常规不能培养和分离的病毒的检测（如HBV、 HCV、HIV等）； 仅需少量标本或标本中仅含少量病毒也能检测； 在病毒感染的急性期抗体尚未出现之前，病毒感染的诊断 主要依靠NAT，适用于早期诊断； 可对病毒进行定量检测，有助于疗效监测； 可对病毒基因进行基因分型，比血清分型更有价值； 通过对病毒耐药基因的检测，可预测或发现病毒的耐药性 ； 可用于先天性或围产期获得性病毒感染的诊断； 灵敏度高（可达ng甚至fg水平，理论上能检出单个病毒基 因），特异性好、快速、简捷。 定量NASBA技术： 是由一对引物引导的，连续均一的体外特异核苷酸 序列的等温扩增的酶促反应过程。 优点：操作十分简单，只需将制备好的模板直接加到 反应体系中，恒温41培育1.52小时，即可将模板 扩增109倍。 NASBA反应体系包括AMV反转录酶、RNA酶H、 T7RNA聚合酶、核糖核苷三磷酸、脱氧核糖核苷三磷 酸、两个特异的引物及适宜的缓冲液。 NASBA的反应分为两相：循环相和非循环相。 NASBA图解 引物1 逆转录酶 RNA酶H 逆转录酶 引物 2 T7 RNA多聚酶 引物 2 逆转录酶 逆转录酶 RNA酶 H 引物1 liniar phase amplification phase PCR反应图解 bDNA信号扩增技术 主要包括分枝DNA检测（branched DNA assays）和杂交捕获检测（hybrid capture assays）。 检测时病原模板并不扩增，而是通过 对检测信号的放大来实现对病毒核酸的检 测和定量。 bDNA HIV 核酸检测的反应原理 核酸检测主要应用： 1） 早期诊断围产期HIV感染的辅助诊断： 宫内感染（检测定义）： 新生儿出生48小时内，检测到病毒核 酸，或病毒培养阳性，则提示孕期（宫内）感染。 对围产期感染儿童在18月龄前的早期诊断，目前以2次核酸检测 结果作为辅助诊断的依据。2次不同时间的样本核酸检测均为阳性提 示为HIV感染，均为阴性提示未感染。同时18个月时做抗体检测， 当18个月HIV抗体确证阳性方可诊断 HIV感染。 核酸检测主要应用： l2）对18个月婴儿HIV抗体WB试验的不确定（ 或可疑）结果进一步做辅助诊断； l3）在HIV抗体未产生之前（窗口期）辅助诊断 急性原发感染； l4）HIV亚型分析；确定人群中HIV的变异； l5）监测临床抗病毒药物治疗效果； l6）检测病毒的耐药性突变。 （二）HIV病毒分离培养 l 将病人淋巴细胞与正常人的淋巴细胞共同培 养，适当周期培养后测定培养液HIV p24抗原 /RT，从而判断病人的淋巴细胞是否受到HIV感 染。 l 细胞培养与血清学方法相比，专一性很强， 不会出现假阳性。但其敏感性不如血清学或 PCR。 l 必须在P3级生物安全实验室进行。 HIV病毒分离培养的应用 l1.能得到最原始的临床毒种，其重要意义在于确认对 WB不确定的可疑感染者及母婴传播、婴幼儿HIV感染 者。对法律纠纷或职业暴露明确毒主株亲缘关系。 l2.毒株可用于抗病毒药物筛选，耐药性及其生物学特 性等研究。 l3.用定量细胞培养法可测定细胞的半数感染单位（ TCID50）和半数抑制药物浓度（IC50）用于抗病毒 药物测定。或消毒杀菌药品的效果评价。 l 本法一般不用于常规诊断。 （三）HIV p24抗原测定及适用范围 ： l 是一种血清学夹心法EIA。 l （1） HIV-1抗体不确定或窗口期的辅助诊断。 l （2）HIV-1抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助诊断。 l （3）第四代HIV抗原/抗体ELISA试剂检测呈阳性反 应，但HIV-1抗体确认试验呈阴性者的辅助诊断。 l （4）监测病程进展和抗病毒治疗效果。 HIV-1 P24抗原检测结果报告和解释 ： l（1）HIV-1 P24抗原的阳性结果必须经过中 和试验确认，若阳性标本的OD值比中和反 应前减少50%以上，才确定为HIV P24抗原 结果阳性。 l（2）HIV-1 P24抗原阳性仅作为HIV感染的 辅助诊断依据，不能据此确诊。 l（3）HIV-1P24抗原阴性结果只表示在本试 验中无反应，不能排除HIV感染。 （四）HIV抗体检测 l 检测抗-HIV抗体是HIV/AIDS诊断的一项重 要指标，抗-HIV抗体测定作为血清学诊断要求 准确、可靠，必须经初筛、复检试验和确认实 验三个步骤。 l 初筛实验方法主要有：酶联免疫试验（ ELISA）、明胶颗粒凝集试验（PA）、快速免 疫（层析或渗滤）试验（RT）。 l 确认试验主要用免疫印迹试验（ WB）。 抗体检测的目的 l1.输血和移植安全（为了接受者的安全） l2.监测(为了知晓人群流行状况) l3.临床HIV疾病的诊断和VCT检测 (为了知晓 个体感染状况） l 为了达到以上的某个目的的HIV 检测可能不适 合其他目的，比如输血服务的检测不适合临床诊 断HIV感染 固相血清标本酶标记物 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 1、酶联免疫吸附法ELISA原理 第一、二代 第三代 第四代 4th 代3rd 代 = = 1st-2nd 代 HIV 抗原IgM 抗体IgG 抗体 检测线 7blfpjsQwUAYE$H*L+15;9 cmgqOuSyVBZF%J)N=27:akeoisQvTzXD!H*L-04.8 cmfpjtRxVBYE$I(M=27bkeoisQwUzXD!H*L+14.8 cmgqjtRxVBZF$I(M=27blfoisQwUAYD!H*L+15.8 cmgqOtRxVBZF%J(M=27blfpisQwUAYE$H*L+15;9 cmgqOuSxVBZF%J)N=26:akeoisQvTzXD!H*L-04.8 clfpjtRxVBYE$I(M=25;9dnhrOuSyWC#G8 cmgqOuSxVBZF%J)M=27blfpjtQwUAYE$I*L+15;9cmgqOuSyVBZF%J)N26:akeoisPvTzXD!H*K-04.8 clfpjtRxVAYE$I(M=25;9dnhqOuSyWC#G%J)N37akeoisQwTzXD!H*L+04.8 cmfpjtRxVBZE$I(M=26:akeoisQvTzXD!H*L-04.8 clfpjtRxVBYE$I(M=25;9dnhrOuSyWC#G8 cmgqOuSxVBZF%J)M=27blfpjtQwUAYE$I*L+15;9cmgqOuSyVBZF%J)N26:akeoisPvTzXD!H*K-04.8 clfpjtRxVAYE$I(M=25;9dnhqOuSyWC#G%J)N37akeoisQwTzXD!H*L+04.8 cmfpjtRxVBZE$I(M=27bkeoisQwUAXD!H*L+14.8 cmgqjtRxVBZF%I(M=27blfoisQwUAYE!H*L+15.8 cmgqOuRxVBZF%J)M=27blfpjsQwUAYE$I*L+15;9 cmgqOyWC#G8 cmgqOuSxVBZF%J)M=27blfpjtQwUAYE$I*L+15;9cmgqOuSyWBZF%J)N26:akeoisQvTzXD!H*K-04.8 clfpjtRxVAYE$I(M=25;9dnhrOuSyWC#G%J)N37akeoisQwTzXD!H*L+04.8 cmgpjtRxVBZE$I(M=27bleoisQwUAXD!H*L+14.8 cmgqjtRxVBZF%I(M=27blfoisQwUAYE!H*L+15;8 cmgqOuRxVBZF%J)M=27blfpjsQwUAYE$I*L+15;9 cmgqOuyWC#G8 cmgqOuSxVBZF%J)M=27blfpjtQwUAYE$I*L+15;9cmgqOuSyWBZF%J)N26:akeoisQvTzXD!H*K-04.8 clfpjtRxVAYE$I(M=25;9dnhrOuSyWC#G%J)N37akeoisQwTzXD!H*L+04.8 cmgpjtRxVBZE$I(M=27bleoisQwUAXD!H*L+14.8 cmgqjtRxVBZF%I(M=27blfoisQwUAYE!H*L+15;8 cmgqOuRxVBZF%N37:akeoisQvTzXD!H*L-04.8 cmfpjtRxVBYE$I(M=27bkeoisQwUzXD!H*L+14.8 cmgpjtRxVBZF$I(M=27bleoisQwUAYD!H*L+15.8 cmgqOtRxVBZF%J(M=27blfpisQwUAYE$H*L+15;8 cmgqOuSxVBZF%J)N=27blfpjtQwUAYE$I(L+15;9cmgqOuSyWBZF%J)N26:akeoisQvTzXD!H*K-04.8 clfpjtRxVBYE$I(M=25;9dnhrOuSyWC#G%J)N37akeoisQwUzXD!H*L+04.8 cmgpjtRxVBZE$I(M=27bleoisQwUAXD!H*L+14.8 cmgqOtRxVBZF%I(M=27blfpixUAYE$I(M=15;9dnhqOuSyWC#F%J)N37:akeoisQvTzXD!H*L-04.8 cmfpjtRxVBYE$I(M=27bkeoisQwUzXD!H*L+14.8 cmgpjtRxVBZF$I(M=27bleoisQwUAYD!H*L+15.8 cmgqOtRxVBZF%J(M=27blfpisQwUAYE$H*L+15;8 cmgqOuSxVBZF%J)N=27blfpjtQwUAYE$I(L+15;9cmgqOuSyWBZF%J)N26:akeoisQvTzXD!H*K-04.8 clfpjtRxVBYE$I(M=25;9dnhrOuSyWC#G%J)N37akeoisQwUzXD!H*L+04.8 cmgpjSyVBZF%J)N=27:akeoisQvTzXD!H*L-04.8 cmfpjtRxVBYE$I(M=27bkeoisQwUzXD!H*L+14.8 cmgpjtRxVBZF$I(M=27bleoisQwUAYD!H*L+15.8 cmgqOtRxVBZF%J(M=27blfpisQwUAYE$H*L+15;9 cmgqOuSxVBZF%J)N=27bkeoisQwUAXD!H*L+14.8 cmgqjtRxVBZF%I(M=27blfoisQwUAYE!H*L+15.8 cmgqOuRxVBZF%J)M=27blfpjsQwUAYE$I*L+15;9 cmgqOuSyVBZF%J)N=27:akeoisQwTzXD!H*L-04.8 cmfpjtRxVBYE$I(M=27bkeoisQwUzXD!H*L+5;9cmgqOuSyVBZF%J)N26:akeoisPvTzXD!H*K-04.8 clfpjtRxVAYE$I(M=25;9dnhqOuSyWC#G%J)N37akeoisQwTzXD!H*L+04.8 cmfpjtRxVBZE$I(M=27bkeoisQwUAXD!H*L+14.8 cmgqjtRxVBZF%I(M=27blfoisQwUAYE!H*L+15.8 cmgqOuRxVBZF%J)M=27blfpjsQwUAYE$I*L+15;9 cmgqOuSyVBZJ)N37akeoisQwUzXD!H*L+14.8 cmgpjtRxVBZF$I(M=27bleoisQwUAYD!H*L+14.8 cmgqOtRxVBZF%J(M=27blfpisQwUAYE$H*L+15;8 cmgqOuSxVBZF%J)M=27blfpjtQwUAYE$I*L+15;9cmgqOuSyWBZF%J)N26:akeoisQvTzXD!H*K-04.8 clfpjtRxVAYE$I(M=25;9dnhrPvTzWC#G9 cmgqOuSxVBZF%J)N=27:akeoisQvTzXD!H*L-04.8 clfpjtRxVBYE$I(M=27akeoisQwUzXD!H*L+14.8 cmgpjtRxVBZF$I(M=27bleoisQwYE$I(M+15;9dmgqOuSyWCZF%J)N36:akeoisPvTzXD!H*K-04.8 blfpjtRxVAYE$I(M=25;9dnhqOuSyWC#G%J)N37:akeoisQwTzXD!H*L+04.8 cmfpjtRxVBZE$I(M=27bkeoisQwUAXD!H*L+14.8 cmgqjtRxVBZF%I(M=27blfoisQwUAYE!H*L+15.8 cmgqOuRxVBZF%J(M=27blfpjsQwUAYE$H*L+159dnhrOuSyWC#G%J)N37akeoisQwUzXD!H*L+04.8 cmgpjtRxVBZE$I(M=27bleoisQwUAXD!H*L+14.8 cmgqOtRxVBZF%I(M=27blfpisQwUAYE!H*L+15;8 cmgqOuRxVBZF%J)M=27blfpjsQwUAYE$I*L+15;9cmgqOuSyVBZF%J)N27bleoisQwUAYD!H*L+15.8 cmgqOtRxVBZF%J(M=27blfpisQwUAYE$H*L+15;8 cmgqOuSxVBZF%J)N=27blfpjtQwUAYE$I(L+15;9cmgqOuSyWBZF%J)N26:akeoisQvTzXD!H*K-04.8 clfpuRxVBZF%J)M=27blfpjsQwUAYE$I*L+15;9 cmgqOuSyVBZF%J)N=27:akeoisQwTzXD!H*L-04.8 cmfpjtRxVBYE$I(M=27bkeoisQwUzXD!H*L+14.8 cmgqjtRxVBZF$I(M=26:akeoisPvTzXD!H*K-04.8 clfpjtRxVAYE$I(M=25;9dnhqOuSyWC#G%J)N37akeoisQwTzXD!H*L+04.8 cmfpjtRxVBZE$I(M=27bkeoisQwUAXD!H*L+14.8 cmgqjtRxVBZF%I(M=27blfoisQwUAYE!H*L+15.8 cmgqOuRxVBZF%J)M=27blfpjsQwUAYI(M=27akeoisQwUzXD!H*L+14.8 cmgpjtRxVBZF$I(M=27bleoisQwUAYD!H*L+14.8 cmgqOtRxVBZF%J(M=27blfpisQwUAYE$H*L+15;8 cmgqOuSxVBZF%J)M=27blfpjtQwUAYE$I*L+15;9cmgqOuSyWBZF%J)N27blfoisQwUAYD!H*L+15.8 cmgqOuRxVBZF%J(M=27blfpjsQwUAYE$H*L+15;9 cmgqOuSxVBZF%J)N=27blfoisQwUAYE!H*