DNA提取及常见问题分析.ppt

核酸提取及常见问题分析 （一）DNA 主讲人：张蕾 09年8月12日 第二部分：DNA提取方法简介 第三部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策 内容 第一部分：前言 核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物 信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因 此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要 、最基本的操作 。 前言前言 第二部分：DNA提取方法简介 DNADNA提取的几种方法提取的几种方法 q 基因组DNA的提取 CTAB法 SDS法 其它 q 线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法 基因组基因组DNADNA CTABCTAB法法 q CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。 该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。 注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热。 q CTAB提取缓冲液的经典配方 组组份 Tris- HCl （ pH8.0） EDTA （pH8.0 ） NaCl CTAB -巯巯基乙 醇 终浓终浓 度 100 mM 20 mM 1.4M 2%(W/ V) 0.1%（ V/V）使用 前加入 Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； -巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 基因组基因组DNADNA CTABCTAB法法 q CTAB提取缓冲液的改进配方 组组份 Tris-HCl （pH8.0 ） EDTA （pH8.0 ） NaC l CTAB PVP40 -巯巯基乙 醇 终浓终浓 度 100 mM 20 mM1.4M 3%(W/ V) 5%(W/ V) 2%（V/V ）使用前 加入 vPVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶 的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能 和多糖结合，有效去除多糖。 基因组基因组DNADNA CTABCTAB法法 q CTAB法流程图 植物材料裂解液 上层溶液 液氮研磨抽提 细胞裂解干燥溶解 离心洗涤 酒精沉淀 DNA溶液 基因组基因组DNADNA CTABCTAB法法 q SDS法原理 基因组基因组DNADNASDSSDS法法 SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。 组组份 Tris-HCl （pH8.0 ） EDTA （pH 8.0 ） NaCl SDS 终浓终浓 度 10 mM 20 mM 0.4M 2% q SDS法DNA提取缓冲液 q SDS法流程图 （以动物组织为例） 动物组织 细胞裂解 上层溶液组织匀浆 抽提 干燥溶解 离心洗涤 酒精沉淀 DNA溶液 基因组基因组DNADNASDSSDS法法 基因组基因组DNADNA其它方法其它方法 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法 、冻融法 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 生物方式：酶法 q 根据细胞裂解方式的不同有： 基因组基因组DNADNA其它方法其它方法 吸附材料结合法： q 根据核酸分离纯化方式的不同有： 硅质材料 阴离子交换树脂 磁珠 高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。 磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的 物，从而达到分离目的。 基因组基因组DNADNA其它方法其它方法 浓盐法： 有机溶剂抽提法： 密度梯度离心法： 利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离 有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用 利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物 细胞器细胞器DNADNA差速离心法差速离心法 q 差速离心法原理 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进 行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 从而得以分离。 线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋 白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度 也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各 种组分分级分离出来。 第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策 第三部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策 DNADNA提取的基本步骤提取的基本步骤 I.材料准备 II.破碎细胞或包膜内容物释放 III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中 材料准备材料准备 最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融 提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞） 组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解 含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集 基因组DNA的提取 细胞裂解细胞裂解 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： 植物材料液氮研磨 动物组织匀浆或液氮研磨 组培细胞蛋白酶K 细菌溶菌酶破壁 酵母破壁酶或玻璃珠 高温温浴时，定时轻柔振荡 基因组DNA的提取 核酸分离、纯化核酸分离、纯化 采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体 系 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方 法 基因组DNA的提取 核酸分离、纯化核酸分离、纯化 q 蛋白质的去除： 酚/氯仿抽提 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 蛋白酶处理 q 多糖的去除： 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体 积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可 以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入 200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。 核酸分离、纯化核酸分离、纯化 q 多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、 抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它 们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合 核酸分离、纯化核酸分离、纯化 q 盐离子的去除： 70的乙醇洗涤 核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解 当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充 分 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀 沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase pH值为8.0，可防止DNA发生酸解 基因组DNA的提取 1.DNA中含有蛋白、多 糖、多酚类杂质 2.DNA在溶解前，有酒 精残留，酒精抑制 后续酶解反应 3.DNA中残留有金属离 子 1.重新纯化DNA，去除蛋 白、多糖、多酚等杂 质（具体方法见前） 2.重新沉淀DNA，让酒精 充分挥发 3.增加70乙醇洗涤的 次数（2-3次） DNADNA提取常见问题提取常见问题 q问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。 原 因 对 策 1.材料不新鲜或反复冻 融 2.未很好抑制内源核酸 酶的活性 3.提取过程操作过于剧 烈，DNA被机械打断 4.外源核酸酶污染 5.反复冻融 1.尽量取新鲜材料，低温保存材 料避免反复冻融 2.液氮研磨或匀浆组织后，应在 解冻前加入裂解缓冲液 3.在提取内源核酸酶含量丰富的 材料的DNA时，可增加裂解液 中螯合剂的含量 4.细胞裂解后的后续操作应尽量 轻柔 5.所有试剂用无菌水配制，耗材 经高温灭菌 6.将DNA分装保存于缓冲液中， 避免反复冻融 DNADNA提取常见问题提取常见问题 q问题二：DNA降解。 对 策 原 因 1.实验材料不佳或量少 2.破壁或裂解不充分 3.沉淀不完全 4.洗涤时DNA丢失