纳米医药第6章-脂质纳米粒.doc

第6章 脂质纳米粒脂质纳米粒是以生物相容的脂质材料为载体，将药物或其它的生物活性物质溶解或包裹于脂质核或者是吸附、附着于纳米粒子表面的新型载药系统。脂质纳米粒能够改善药物吸收、改变药物体内过程、具有缓释、控释、提高药物稳定性、增强疗效降低毒副作用等方面的优越性，同时在生物体内及贮存过程中较稳定。现已广泛应用于基因药物、抗肿瘤药、蛋白质和多肽等药物的载体系统。使用途径很广，既可口服、注射，还可以局部应用。现已有脂质体、固体脂质纳米粒、胶束、药质体和脂肪乳等体系供临床使用。本章主要对固体脂质纳米粒、脂质体和药质体等进行介绍。6.1 固体脂质纳米粒6.1.1 概述 固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）是近十几年正在发展的种新型的脂质载药系统1，它以天然的或人工合成的的高熔点固体脂质（如饱和脂肪酸甘油酯、硬脂酸、混合脂质）为载体，将药物吸附或包裹于脂质核中制成的纳米给药体系。和乳剂、脂质体相似，SLN以毒性低、生物相容性好的脂质材料作为载体。同时，固体脂质又使它具有聚合物纳米粒（PNP）的优点，如可以控制药物的释放、避免药物的降解或泄漏以及良好的靶向性等。SLN的水分散系统可以进行高压灭菌或辐射灭菌，具有长期的物理化学稳定性，也可通过冷冻干燥或喷雾干燥制成固体粉末。还可采用高压乳匀法进行规模化生产。固体脂质纳米粒的主要成分有三类：脂质，如脂肪酸甘油酯类（包括三硬脂酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三萮酸甘油酯、Witepsol W 35、 Witepsol H 35、 Witepsol H 42、单硬脂酸甘油酯）及脂肪酸类（如硬脂酸、棕榈酸）等；乳化剂和助乳化剂，如磷脂（包括大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂及磷脂酰胆碱等），Poloxamar, 聚山梨醇，胆酸盐，四丁酚醛等；药物，亲脂性药物和亲水性药物均能制备成稳定的SLN体系，并且载药量和包封率都较高。SLN给药途径和方式较为广泛，主要用于静脉给药，发挥靶向或控释作用；也可口服给药，以控制药物在胃肠道内的释放，还可用于局部或眼部给药。是一种很有发展前景的新型载药系统。6.1.2 固体脂质纳米粒的制备1制备方法（1）高剪切乳匀和超声分散高剪切乳匀和超声分散是药剂学中广为应用的一种分散技术，可用来制备乳剂、脂质体等，也可以用于固体脂质纳米粒分散体系的制备。它们的优点是操作简单，易于控制。缺点是体系中易出现微米级粒子，如果超声时间过长（15min），则可能导致金属的污染。（2）高压乳匀2高压乳匀是目前制备SLN的经典方法。其工作原理是利用高压（10 MPa200MPa）推动液体通过一个狭窄的管道（几个微米），液体通过很短的距离而获得了很大的速度（超过1000km/h），产生的高剪切力和空穴作用力使粒子分裂成纳米级的小粒子。此法的优点是可避免使用对人体有害的附加剂和有机溶剂，尤其适用于对热不稳定的药物。所制得的纳米粒粒径小且分布范围窄，高压乳匀还便于进行大规模生产。乳匀有两种基本的方法：热乳匀和冷乳匀3,4，这两种方法都可以制备SLN，但乳匀之前都需将药物溶解或分散在熔化的脂质中，即初步乳化。一般初步乳化如能得到微米级粒子则更有利于乳匀。 热乳匀热乳匀是指在脂质熔点以上的温度进行操作，将脂质和磷脂等加热至高于脂质的熔点1015左右融化，加入药物，熔融液分散于含有表面活性剂的水相中，初乳化后，通过高压乳匀机循环乳化即得。由于温度升高降低了脂相的粘度，所以原则上讲温度越高得到的产品的粒径就越小。但是并不是温度越高就越好，因为在高温下药物和载体的降解速度也会加快。并且虽然乳匀的步骤可以重复几次，但每次乳匀都会导致体系温度的升高，平均压力每升高50MPa，可使体系的温度增加10。一般在50MPa150MPa压力下重复35次已足够，如果循环次数增多和压力增大反而会使SLN的粒径增大，因为随着体系温度的升高，粒子聚集倾向加大。通过热乳匀最初得到的仅是一种乳液，脂质还处于一种液体状态，必须使其温度降至室温或熔点以下，才能形成SLN。由于粒径小和乳化剂的存在，它会在一定的时间内保持一种过冷熔化状态。 冷乳匀冷乳匀法的制备过程同热乳匀法一样，也需使药物溶解或分散在熔融的脂质中，熔化的样品立即在干冰或液氮中冷却。冷却速度越快，药物在脂质基质中的分布越均匀。再把已凝固的载有药物的脂质碾磨成微米级粒子。由于低温凝固，脂质脆性增加，更易被粉碎，通过球磨或碾钵得到的粒子粒径一般在50m100m。然后将它们和含表面活性剂的冷冻溶液在低于脂质熔点510以下高压匀质。此法适用于对热不稳定的药物和熔点低的脂质，还可以避免热乳匀过程中药物向水相流失以及结晶过程中出现的晶型转变和过冷态。但是该法所制得的SLN粒径较大，且粒径分布范围较宽。（3）乳化蒸发法SLN的制备也可以采用PNP的制备方法，但它的一个明显不足是使用了有机溶剂。将脂质和药物首先溶解于有机溶剂中，然后对有机相和含有表面活性剂的水相进行乳化，将有机溶剂蒸发后，即形成SLN。采用该法所得到的SLN粒径很小5，甚至可达到25nm。（4）微乳法6,7 微乳是由油相、乳化剂和辅助乳化剂及水所组成的澄清或带有微弱蓝色乳光的热力学稳定的分散体系。现在人们认为微乳并不是一种由微小液滴形成的真正的乳液，而是一种临界溶液（critical solution）。微乳一方面具有乳液的一些性质（如可以用激光光散射法测量它的粒径），另一方面它又具有真溶液的一些性质（如药物在微乳中有一定的饱和浓度，而不是像乳剂那样具有一定的油/水分配比例）。将微乳加入到水中会导致油相的沉降从而形成极细的颗粒。微乳的制备方法是用低熔点的脂肪酸（如硬脂酸）、乳化剂、辅助乳化剂和水在6570搅拌制成的透明混合液。再在搅拌下向热微乳中加入冷水（23），一般微乳和水的比率为1:25到1:50，其稀释程度取决于微乳的组成。为了使微乳中的油相在室温下是固体，需要在制备时使体系的温度高于脂质的熔点。这样SLN颗粒的大小主要受微乳小粒子沉淀影响，而与搅拌速度关系不大。在微乳中液滴已达到纳米级，所以并不需要额外能量。对于微乳来说，不但配方组成，而且温度下降速度与pH值都能影响制剂的质量。降温速度快可以促使脂质快速结晶并避免纳米粒聚集。2不同制备工艺的比较（1）超声分散和高压乳匀法 Siekmann 等8研究了不同制备工艺对四丁酚醛（w=1.5%）和大豆卵磷脂（w=1%）稳定的三棕榈酸甘油酯（w=3%）纳米粒的影响。当超声时间大于15min时可以得到粒径在30nm180nm之间的纳米粒，但是长时间的超声可增加金属探头造成的金属污染。如果脂质的含量很高时，甚至无法用超声法来乳匀。因此，超声不适用于脂质浓度高的配方。高压乳匀法被证明是行之有效的分散技术，仅一次循环（80MPa）就可以使平均粒径从474nm减小到155nm，循环5次所得到的纳米粒粒径最小。（2）乳化蒸发和高压乳匀法用卵磷脂和甘胆酸钠作为乳化剂和辅助乳化剂，采用乳化蒸发法制备的三棕榈酸甘油酯纳米粒，平均粒径为28nm，而采用高压乳匀法制得的平均粒径为124nm5。这是因为磷脂分子在熔化脂质中的流动性小于在溶剂中的流动性，并且脂质和乳化剂的混合液的粘度大于溶剂，所以乳匀需要更多的能量，导致SLN的粒径增大。但如果用磷脂和非离子型表面活性剂作为乳化剂，则高压乳匀法要优于乳化蒸发法。这些结果表明乳化剂的组成对粒径大小有决定性作用。一般来讲，乳化蒸发法适用于制备粒径小、分布范围窄的SLN；但是脂质在有机溶剂中的溶解度较低（三棕榈酸甘油酯w=0.5%2.5%），限制了乳化蒸发法制备样品的浓度，进而影响该体系的载药性质。此外，和高压乳匀法相比，乳化蒸发法在制备过程中不能避免高温加热和使用有机溶剂，而有机溶剂的残留会导致毒理学的问题。（3）高剪切乳化和高压乳匀 采用高剪切乳化时，乳化剂的浓度对SLN粒子大小的影响较大。平均粒径随着乳化剂的浓度增大而减小，到最适宜浓度（w=2%3%）时最小，以后随着乳化剂的浓度增大粒径反而增大。这可能是因为SLN中脂质体的含量增加或磷脂分子在粒子的表面形成多层。而用高压乳匀制备的SLN结果却相反：增加磷脂的浓度，粒径持续下降。一般来说，用高压乳匀制备的SLN粒径大小是50nm，而用高剪切乳化制备的SLN则在200nm左右。3影响SLN粒径的因素（1）脂质的影响9 脂质对SLN的影响极其复杂，如脂质的结晶速度，脂质的亲水性可影响脂质的自我乳化的性质；脂质晶体的形状可改变其表面积，这点后面还将作进一步讨论。不过有一点值得注意，即所有的脂质实际上都是几种不同化合物的混合物，所以即使同一供应商提供的不同批号的产品，其组成也不会完全相同。这有可能影响SLN的zeta电位，延缓结晶过程等，从而影响SLN的分散性能。脂质分子链越长，油相的粘度越高，得到的SLN粒径相应越大。另外，脂质含量超过了5%-10%，则会导致乳匀效率的降低，粒子聚集增加，所制备产品的粒径较大，其中还含有相当数量的微米级粒子，同时粒径的分布更广。（2）乳化剂和辅助乳化剂的影响通常情况下，粒径随乳化剂用量增加而降低。以三棕榈酸甘油酯、磷脂和甘胆酸钠为辅料经高压乳匀法制备的SLN的平均粒径为205nm；如果以Pluronic F68代替磷脂，SLN的平均粒径为77.9nm；用甘胆酸钠代替磷脂，则粒径为96.8nm。当使用磷脂-甘胆酸钠为乳化剂时，微乳法得到的三棕榈酸甘油酯SLN的粒径远小于熔融-乳匀工艺，但以磷脂-四丁酚醛为乳化剂所制得的SLN粒径远大于高压乳匀法所制得的SLN的粒径，这可能与四丁酚醛在较高温度下乳化能力较强有关10。在较高温度下，以磷脂-四丁酚醛混合物为乳化剂制备的SLN的粒径要小于以磷脂-胆酸盐为乳化剂者。高浓度的乳化剂在乳匀过程中可以降低表面张力和促进粒子的分散。粒子体积的减小会导致表面积的急剧增大，特别是在高压乳匀中，表面积增大更为迅速，因此必须考虑动力学方面的问题。在初步乳匀过程中要有足够的乳化剂分子，以确保它能迅速包裹在新形成的粒子表面。但是如果乳化剂过多，则可能出现其他形式的体系，如增溶分子（乳化剂单体）、胶束（SDS）或脂质体（卵磷脂）等。并且乳化剂再分配过程的时间是不等的。一般来说，SDS和一些能形成胶束的低分子量的表面活性剂能很快达到平衡，而高分子量的表面活性剂（如poloxamer）和卵磷脂则需要很长时间才达到平衡。（3）乳匀压力与循环次数的影响如果以Poloxamer188为稳定剂制备三月桂酸甘油酯SLN, 最佳条件为50MPa3次,以后粒径随乳匀压力和循环次数的增加反而明显变大；使用Lipoid S75为乳化剂，操作压力应提高，最佳条件为150MPa3。溶解于水的Poloxamer分子迁移速度较快，能够迅速覆盖在乳匀过程中新生成的油水界面上，而磷脂分子溶解或以胶团形式分散在高粘度的脂质中，需经高压解聚才能充分发挥表面活性剂的作用。（4）温度的影响如果高压乳匀时操作温度低于二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和三月桂酸甘油酯的相转变温度，制备后容易出现相分离和较大的粒子。而在高于相变温度时制得的SLN更稳定，因为此时磷脂的脂肪酸链能自由伸展，更充分地发挥作用11。4灭菌注射给药需要灭菌。常用灭菌的方法有湿热蒸汽灭菌法，滤过灭菌法和射线灭菌法等。灭菌过程不能改变样品的物理稳定性、化学稳定性和药物释放动力学性质。滤过灭菌要求加压操作并且样品的直径不能大于0.25m，这对SLN 来讲是比较困难的。湿热灭菌法是一种常用且可靠的灭菌方法，它曾经用于脂质体的灭菌，发现加温导致样品物理稳定性的下降，经灭菌后都出现了不同程度的团聚。灭菌的温度越高，粒子的团聚越明显。乳化剂的正确选择对样品在高温下的稳定性至关重要。升高温度使所有乳化剂的流动性和水溶性都发生了改变。湿热蒸汽灭菌可以导致o/w乳剂的组成发生改变。研究发现，卵磷脂是最合适的表面活性剂，灭菌后粒径仅有微小的增大，检测到的微米级的粒子也很少。而poloxamer 188的情况恰好相反，湿热蒸汽灭菌后粒径有显著的增加。这种情况是由于乳化剂poloxamer空间稳定性下降引起。众所周知，这种类型的乳化剂，温度升高使乙二醇链脱水，导致了粒子保护层的厚度减小，粒子容易聚结12。灭菌能使包封药物的SLN的稳定性降低。5%丁卡因poloxamer 188/Compritol SLN经湿热蒸汽灭菌后，粒径分布增大（多分散指数PI从0.08增加到0.25），平均粒径也增大（160nm增加到260nm），而当丁卡因的浓度升至10%时粒子的粒径甚至增大到500nm以上。这些结果表明药物的加入，不但能降低体系的稳定性，而且改变了乳化层的性质。Cavalli 等13研究了湿热蒸汽灭菌对微乳法制备的SLN的粒径和Zeta电位的影响。SLN脂质（w=7.35%）由硬脂酸、廿二碳烷酸或Acidan N12（单硬脂酸单柠檬酸甘油二酯）组成，乳化剂由Epikuron 200（95%大豆卵磷脂）和牛去氧胆酸盐组成，将SLN分散在2%海藻糖溶液或2% poloxamer 188溶液中，在121下湿热蒸汽灭菌15min。发现Acidan N12 SLN的平均粒径没有改变，廿二碳烷酸SLN的平均粒径从70nm增大到135nm，硬脂酸SLN的平均粒径从55nm增大到110nm。一年以后所有体系的粒径均增大，Acidan N12 SLN增大到350nm，廿二碳烷酸SLN增大到120nm，硬脂酸SLN增大到450nm，但是没有微米级的粒子出现。湿热蒸汽灭菌对粒子的zeta电位影响不大。射线照射适用于对温度敏感的样品。用湿热蒸汽灭菌，卵磷脂体系比poloxamer体系稳定，但是对于射线灭菌，两者没有显著区别。湿热蒸汽灭菌的温度控制在121时，粒径增大的幅度比射线照射的要大；但在110时，粒径增大的幅度比射线照射的要小14。射线照射法由于射线的能量很高，在照射过程中会产生自由基，这些自由基与没有经过修饰的样品重新结合或发生副反应而使样品的结构发生化学改变。药物降解的程度和化学反应有关。分子高流动性（半固体或液体）和氧也能促进射线照射导致的降解反应。因此样品经照射后，可能出现脂质双层组成的改变。对湿热蒸汽灭菌和射线照射所导致的化学降解研究并不多，但需要指出的是，降解并不总是表现为粒径的增大。有的配方如某些磷脂或自由脂肪酸对粒子有保护作用，但是会引起毒性。围绕SLN的化学稳定性方面的研究至关重要，这对解决SLN体系的灭菌问题提供帮助。5干燥尽管有文献报道SLN的水溶液分散体的粒径能稳定1236个月，但由于SLN分散体是热力学不稳定体系，通常在短时间里就出现粒径的增大、粒子聚合甚至胶凝的现象。为了提高SLN的化学和物理稳定性，保持其原有的的粒径，阻止Ostwald熟化和避免水解，常用的方法是将SLN分散液干燥成固体。另外SLN分散液干燥后，可将药物制成固体制剂如片剂、胶囊等，可以增加药物的给药方式和给药途径。由于SLN的特殊性质，常用的干燥法有冷冻干燥和喷雾干燥。（1）冷冻干燥法样品经冷冻干燥变成固态后，具有更好的化学和物理稳定性。但是在冻干过程中有两种相变会影响其稳定性。第一，在冷冻干燥过程中从水性分散体变成粉末时，由于样品的渗透压和pH值的改变，可能会引起不稳定问题；第二，再增溶作用，粒子由于处在一个低含水量、高粒子浓度、高渗透压的环境中，易发生聚合。冷冻干燥法将降低表面活性剂的保护作用。已经发现，当SLN分散体的脂质含量不超过5%时，脂质粒子的直接接触减少，有更高的升华速度和更高的比表面积，可以有效抑制粒子的聚合。冷冻防护剂15，16的加入可以减少粒子的聚合，还能使得到的干燥产品具有更好的再分散特性。常用的冷冻防护剂有山梨醇、甘露糖、海藻糖、葡萄糖和聚乙烯吡咯烷酮等。冷冻防护剂可以占据离散的脂质纳米粒之间的空间位置，从而阻止其相互接触；还能和表面活性剂的活性位点发生作用，形成一层假性水化壳。一般来讲，冷冻防护剂的浓度在10%15%之间， SLN的平均粒径和粒径分布在冷冻干燥再分散试验后，平均粒径一般增大1.52.4倍，没有冷冻防护剂的样品的粒径增大得更多。冷冻防护剂的保护作用由大到小为：海藻糖蔗糖葡萄糖和麦芽糖。以海藻糖的效果最好，它可以充分阻止粒子的聚合和药物的渗漏。冷冻防护剂加入的时间也会影响最后产品的性质。冷冻防护剂在乳匀之前加入效果最好，平均粒径在冻干过程中几乎不发生改变。冷冻防护剂和脂质的重量比为2.63.9较合适。载药的SLN通过冷冻干燥有可能使其稳定性大大降低，这可能与游离的药物分子有关。载药纳米粒Zeta电位降低，渗透压和pH值改变进而导致粒子的稳定性下降。因此提高药物的包封率尤为重要17。冷冻的过程会影响晶体的结构和冻干粉的性质。冷冻的的速度取决于特定的样品和条件。快速冷冻会导致小型和异质晶体出现，增加了非晶型的含量，降低冷冻效果。晶体的大小是影响冷冻干燥过程中升华速度的关键因素。大量小晶体和非晶区的出现导致形成非常紧密的冻干粉网，因而降低了升华速度。缓慢冷却可以形成大晶体和自由的升华物，但是常常会增强冷冻所导致的不稳定现象。此外，对冷冻的SLN分散体进行预处理（-22处理2h，接着降至-40处理2h）可能会提高冻干粉的质量。（2）喷雾干燥喷雾干燥比冷冻干燥法经济，但较少用于SLN体系。主要是由于高温、高剪切力和脂质的部分熔化，易造成粒子的团聚。只有当脂质熔点大于70，冷冻防护剂和脂质都能在喷雾干燥过程中保持SLN粒径大小不变时才考虑采用此法18。6.1.3 SLN的性质1过冷态及过冷分散体的形成由一些短链的三脂肪酸甘油酯如三肉豆蔻酸甘油酯（Tm=56）和混合脂肪酸酯如Witepsol H42 (Tm=41)采用热熔法所制得的纳米粒，在室温或在冰箱中储存，DSC和X-射线衍射并未检测到特征峰。通过定量的高分辨1H-NMR19测定发现，当熔融乳化纳米粒冷却到其结晶温度以下时，脂肪酸酯分子仍有很强的流动性。这些结果表明，三脂肪酸甘油酯制成纳米粒后，其结晶温度降低2030，所以三肉豆蔻酸甘油酯或Witepsol H42等熔点较低的脂质采用热乳匀法所制得的纳米粒，在室温下以过冷态的形式存在。三月桂酸甘油酯（Tmelt=47）纳米分散体于冰箱中保存数年后，仍然保持过冷态形式（储存两年后，发现仅有2的结晶体）。人们对三脂肪酸甘油酯过冷现象的研究已有几十年的历史。对于胶体体系，三脂肪酸甘油酯的熔化与结晶的温度与单脂肪酸甘油酯不同，混合脂肪酸甘油酯和高熔点的脂肪酸酯的纳米粒形成过冷态的倾向较小。这是因为长链脂肪酸可作为结晶中心使过冷态的结晶温度提高。加入药物也会影响过冷现象。就微米体系而言，三脂肪酸甘油酯乳滴结晶的温度比纳米粒要高，其结晶温度降低值与乳滴粒径对数成线性关系，当粒径在1m10m范围内时，结晶温度降低值在1525之间。而对纳米体系来讲，其结晶的温度要低，并且粒径对结晶的温度影响也小。这说明要想获得稳定的三脂肪酸甘油酯的过冷分散体，必须要制备纳米粒。2多晶型转化及老化现象制备固体脂质纳米粒时，纳米分散体的温度必须降低到三脂肪酸甘油酯结晶温度以下，在形成纳米混悬液时，结晶并不是最后步骤，因为三脂肪酸甘油酯胶体分散体结晶后通常还要经过一个多晶型转化过程。例如，三棕榈酸甘油酯纳米粒首先形成型结晶，随后同块体材料一样转变成稳定的-型。然而，多晶型的转变可严重影响纳米分散体的性能。单脂肪酸甘油酯胶体体系比块体材料转变成-型的速度更快，可能是由于较小的结晶区域具有更大的体表面积之比而导致晶格弛豫。另外，由于胶体分散体具有较高的能量，能够提供其晶型转化所需要的能量。这些同样能够解释三棕榈酸甘油酯-型小纳米粒比大纳米粒不稳定的现象。同块体材料相比，短链脂肪酸甘油酯纳米粒晶型转变的速度比长链脂肪酸甘油酯快20。三脂肪酸甘油酯，混合脂肪酸酯纳米粒的多晶型行为与单脂肪酸甘油酯不同。例如脂肪酸酯Witepsol H42、Witepsol E85 晶型最稳定，中间态1或2型也被认为是稳定的。型脂肪酸酯转变成型通常需要数月乃至一年的时间。室温下，三脂肪酸甘油酯纳米粒比块体材料更容易转变成稳定的晶型，这表明胶体分散体具有更高的动力学特性。同块体材料相比，将脂肪酸酯纳米粒结晶转变成较稳定的-型时间较长，但结晶后，其立即转变成型，表明脂肪酸酯具有较低的结晶温度。当脂肪酸酯结晶温度明显低于-型熔化温度时，-型被认为是最稳定的。就长链脂肪酸甘油酯或混合脂肪酸酯来讲，SLN结晶后其变化过程持续几天甚至几周。除了多晶型现象，老化过程对脂质的晶型也有影响21。上述结果表明，SLN无论从熔化到重结晶还是固化后晶型转变及老化现象，都具有很高的可变性，贮存期间SLN的晶型并不能从本体的晶型来推断，因为二者晶型转变的动力学过程完全不同。脂质结晶的完全程度及晶型转化与药物的包封和释放有密切的联系。按以下的顺序，热力学稳定性依次增加，脂质的密度依次增加，药物的包封率依次降低：过冷熔融物晶型 晶型晶型因为粒子的粒径特别小，而且存在乳化剂，脂质的结晶和晶型的转变受到很大的阻碍。晶型的转变有时会极缓慢。DSC和X-射线衍射广泛地应用于考察脂质的内部结构。DSC应用的原理是不同的脂质晶型具有不同的熔点和熔解焓。通过示差热扫描，我们可以判断脂质晶格中不同孔隙的长度。3表面活性剂的影响表面活性剂的加入能显著影响三脂肪酸甘油酯的晶型转变。例如，制备三棕榈酸甘油酯SLN时，当用Cremophor EL 作为稳定剂，-晶型消失；如果用甘胆酸钠为稳定剂时，则该体系主要以-晶型形式存在。当以亲水性表面活性剂作为稳定剂时，它主要分布在水相和粒子表面上。因此，表面活性剂不但对纳米粒的粒径和稳定性有影响，而且对粒子的内部结构也有重要影响。但对其界面的相变动力学的影响对比核的影响更大。由于甘胆酸钠稳定的SLN -晶型的稳定性较高，因此可以用来研究经过多晶型转化后基质的结构及粒子的形状。例如tripalmin-SLN，采用热匀法制备时，当缓慢冷却到室温时，其以普通的-晶型形式存在，SAXD和WAXD显示衍射峰较强，迅速冷却时，所得到的-晶型WAXD强而SAXD弱。电镜显示，-型同转变后的-型相比，粒子较小并且内部结构不均一，-晶型粒子为球形，核不规则。这些性质对于研究该胶体体系的稳定性及药物的包封率有很重要的意义22。4粒径的影响正如脂质在块体材料和胶体体系中理化性质发生改变一样，在胶体体系中，粒径的大小同样能影响脂质的性质。DSC曲线显示粒径越小，其特征峰越宽，并向低温方向位移；对于粒径较小的单脂肪酸甘油酯胶体体系来讲，在低温范围内还出现了一些较强的特征峰。这些吸收峰是不连续的。如果该体系含有其他的化合物，则这些吸收峰变宽，并且不易检测到（图6-123）。对于胶体分散体系来讲，粒径和熔化温度的关系可用Gibbs-Thomson方程来描述：T是粒径为r时的熔化温度，T0为脂质在相同外压下的熔化温度，sl为固液的界面张力，VS为固体的体积，Hfus为熔化焓。但是该方程对于那些离散的熔化转变和当出现一系列尖锐的特征吸收峰（超过10个）时不能很好的解释，以及那些逐步熔化过程中所出现的一些细微变化也不适用。三脂肪酸甘油酯SLN粒径减小时X射线衍射曲线也发生改变，小角X衍射峰变宽，且向小角位移。广角衍射在0.44和0.40nm0.41nm 的范围变化显著。在0.44nm，0.41nm和0.37nm有较强的反射；另外在大多数情况下，在0.40nm处有一个小的衍射峰（图6-223）。图6-1 不同粒径的四丁酚醛稳定的三肉豆蔻酸甘油酯SLN的DSC图t / 图6-2 不同粒径的四丁酚醛稳定的三肉豆蔻酸甘油酯SLN的X-射线衍射图强 度 通 道 5形成凝胶同脂质o/w乳液相比，SLN体系中脂质的含量很高（5%10）。因此单独使用磷脂作为稳定剂并不能使该体系稳定。在冷却贮存过程中，它容易形成半固体导致胶凝。但在一般情况下，该体系中加入适量的粒子型或者非离子型表面活性剂，如甘胆酸钠、四丁醛或poloxamer则可防止胶凝。DSC和X-射线衍射研究表明，凝胶是由三硬脂酸甘油酯的三维网状结晶所构成24。6几种胶态共存几种胶态种类的出现是一个重要的、值得深思的现象，但是这方面还没有被引起足够的重视。稳定剂并不仅仅局限于作用在脂质表面，也可作用于水相。因此表面活性分子（如SDS）会以三种形式出现，即：在脂质的表面；形成胶束；表面活性剂单体的形式。卵磷脂可以形成脂质体，并且在纳米乳中能检测到。甘胆酸盐和卵磷脂稳定的体系以及其它相关的体系中也发现有混合胶束。胶束、混合胶束和脂质体因为有选择性药物结合位点，因此可以增加药物的溶解度。在最近的一项十六酸鲸蜡（醇）酯SLN的电子自旋共振（ESR）的研究中发现，亲脂性的硝基化合物只位于胶束中，而不是在脂质中。仅仅描述几种胶态是不足以表征胶态脂质分散体结构的，因为就药物的稳定性和药物的释放来说，胶态之间的动态变化非常重要。所以应对不同胶态分配过程的动力学进行深入的研究。如易水解的药物分子在水中比在脂质中更容易溶解，更容易富集在粒子的表面。药物降解动力学由药物的化学活性和药物在水相或脂/水界面上的浓度等因素决定。不稳定的药物与水接触后很快水解，因此药物在不同环境下的分配平衡很容易改变。载药系统只有抑制药物的再分配，才能对药物起到保护作用25，26。提高基质的粘度能降低药物在载体中的扩散系数，因此SLN比纳米乳更有优势。但是对于胶态药物载体来说，影响药物稳定性的因素很多，而且在相同条件下，SLN分散体的表面积比纳米乳要大的多，这是因为SLN粒子的形状是非球形的。有人用ESR研究了乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA）和几种脂质基质，结果表明PNP能更有效的稳定药物分子。从ESR谱可以得知，扩散系数的范围大约在10-11cm2.s-1或更高，这就意味着被包裹的分子最多几秒钟就能到达界面。但这并不是说SLN不能保护药物不受降解，因为适当的表面活性层就能对药物起到很好的保护作用。6.1.4 SLN的体内行为纳米粒进入体内后，被机体视为异物，人体产生抗体与之吸附。血浆中的多种成分如血浆蛋白、脂蛋白、免疫蛋白、补体C蛋白等也吸附到纳米粒上，参与调理过程。从而加速网状内皮系统（RES）的识别，最终被巨噬细胞吞噬而从体循环中被清除掉。纳米粒的表面电荷、亲水亲油性、粒径大小决定了纳米粒被血浆中特异性IgG及C3b片段吸附或包裹的数量，进而决定在体内的代谢过程。一般而言，极性微粒不易被吞噬，电位越高，吞噬越少；表面双亲或亲水性的纳米粒在血中循环时间长。另外粒径大小与靶向性有关，大于5m的粒子被肺的毛细血管床捕获，小粒子被RES吞噬；大于250nm的纳米粒靶向脾，小于250nm的纳米粒靶向体循环，小于150nm的纳米粒靶向骨髓。SLN的给药途径较灵活，包括胃肠道的和非胃肠道的。但是研究最多的还是静脉注射。这可能是由于一方面比较易于监控SLN在血液中的行为以及它们可能被组织摄取，另一方面它也是治疗中最常用的给药途径之一。口服给药主要是通过派伊尔结进入体循环，这样必须考虑纳米粒在胃肠道的稳定性问题，防止被胃酸以及脂肪酶和酯酶降解。此外，SLN还可以局部给药和肺部给药27。1注射给药SLN最初是为静脉注射的靶向控释药物而设计。脂质液滴（纳米乳）转变成为固体（SLN）以后，药物的扩散系数减小，从而减慢了药物的释放。粒径的分布对于静脉注射用药来说是一个关键问题，它可以导致毛细血管堵塞，造成脂肪栓塞等致死性的严重问题。最细毛细血管的管径为9个微米，从安全的角度考虑，粒径必须全部在亚微米级范围内。人体可以耐受一定数量的微米级的大液滴，但是这种情况不能适用SLN，因为SLN不能变形，一旦粒径超过毛细血管直径，血管栓塞现象必然发生。低粘度的SLN分散体在注射针头内会发生凝胶化，迅速变成一种高粘度的、含有会对人体造成危险的大粒子的混悬液。固体脂质的不可变形性，以及在注射过程中可能发生凝胶化现象，是SLN分散体用于静脉注射给药时在临床上遇到的主要问题。所以在制备注射给药的SLN 时必须严格控制粒径及乳化剂和辅助乳化剂的比例，防止胶凝。大鼠经静脉注射阿霉素SLN后，药代动力学研究表明，和普通阿霉素注射液相比，血药浓度更高；药物在体内的分布方面，SLN在肺部，脾脏和脑中的浓度较高，而普通阿霉素注射液主要分布在肝脏和肾脏。喜树碱受酸碱影响有两种存在形式：有抗肿瘤活性的内酯型与无活性的羧酸盐型。杨时成等以Poloxamer188为隐性修饰剂，制备了197nm的喜树碱-硬酯酸SLN。小鼠静注后,靶向效率从大到小依次为：心、脑、全血、肝、脾、肾和肺。在pH7.4的磷酸盐缓冲液和人血浆中，喜树碱内酯环的开环半衰期分别为：23.8min和10.6min。SLN在体外释药154h后，纳米粒内的药物仍以原形存在，说明SLN可提高药物的稳定性。纳米粒与普通溶液相比，药时曲线下面积（AUC）提高5倍，平均滞留时间（MRT）延长4倍，在RES与非RES器官的分布均明显提高。2口服给药SLN的口服剂型包括水性的分散体和含SLN的传统剂型形式，如片剂、丸剂或胶囊剂等。通过优化乳化剂和脂质的种类和剂量，可以得到在胃肠道中稳定的SLN。一般认为，酸性的、高离子强度的胃液微环境，易导致纳米粒聚合。但是实际上纳米粒的聚合并不是决定因素。许多实验数据表明，即使SLN在一定程度聚合后，其生物利用度仍然很高。Yang等28研究了小鼠口服喜树碱-硬脂酸SLN后的药代动力学，发现体内血循环和组织中药物浓度出现两个峰，5min15min出现的第一个峰为突释效应所致，3h后出现的第二个峰为随着硬脂酸的降解及SLN被转运至胃肠道壁而逐渐释出的药物峰。同时发现，组织中药物AUC和MRT显著高于普通溶液，尤以脑部药物浓度上升幅度最大。采用溶剂-扩散法制备环孢素A-硬脂酸SLN，粒径316.1nm，包封率88.36%。大鼠口服后，达峰时间(4.0h)较Sandoz公司的Sandim-munNeroalOR(1.75h)显著延长，相对生物利用度为80%29。3透皮吸收固体脂质纳米粒局部给药具有很大的开发潜力和市场前景。SLN被认为是替代脂质体的新一代载药系统。和脂质体相似，SLN是由生物耐受性良好的材料组成，其最突出的优点在于它具有固态基质，这样可以保护化学性质不稳定的物质不被分解破坏，并可以调节药物的释放。SLN的粒径很小，具有一定的生物粘附性，比较容易粘附到皮肤上形成薄膜，它可以修复皮肤表面破损的脂质层，并且具有一定的屏蔽作用。载药量低和低粘度对于透皮制剂来说都是不利的。在大多数情况下，SLN分散体被制备成软膏或凝胶等剂型，确保使用的方便，而这个制备过程使SLN的浓度进一步减小。SLN分散体的固体脂质含量升高后，会变成一种半固体，凝胶样的性状，它可以直接涂抹在皮肤上，不需要做进一步的处理。一般来讲，脂质含量的增加会导致粒径的增大。但是鲸蜡醇十六酸酯制成的SLN在脂质含量高达30%40%时，竟然保持了胶态粒子的大小，且系统的可塑性也有很大增加。这种体系的流变学特性和传统的皮肤用药相似。以上结果表明，可以一步生产出脂质含量高、粒径小的透皮用SLN体系。可稀释制备成膏剂，不须制备成凝胶剂。SLN的一个明显优点是组成成分都是生物相容性原料，避免了对皮肤的刺激和毒性。还可以调节药物在皮肤中的释放，从而提高药物在特定皮肤层中的分配。SLN在皮肤上涂布后，随着水分的损失和脂质的变形，SLN的结构将发生改变。电子显微镜表明SLN分散体在32干燥后变成一层致密的膜，这和前面提到的球形结构不同。这种致密膜的形成可以促进皮肤的闭合作用，提高药物对皮肤的穿透率。4肺部给药 迄今为止，脂质纳米粒的肺部给药研究报道不多。为了证明脂质纳米粒肺部给药的可行性，有人将脂质纳米粒混悬液雾化后，再收集雾化后的颗粒并分析其中纳米粒的粒径分布。结果表明雾化前和雾化后纳米粒的粒径分布几乎相同，仅有轻微的粒子聚集现象发生，这对肺部给药没有影响。另外，脂质纳米粒粉末可以制成干粉吸入剂，在喷雾干燥过程中，可以使用乳糖作为保护剂。 脂质纳米粒的优点在于它可以控制药物在肺部的释放，延长药物在肺部的释放时间。与聚合物纳米粒相比，脂质纳米粒的降解速度较快。另外，脂质纳米粒的体内耐受性很好，适于装载对肺巨噬细胞靶向的药物。肺部的粒子易于被巨噬细胞吞噬，因此可以用脂质纳米粒来治疗RES系统的感染。 6.1.5 SLN 药物的释放影响SLN载药量的因素很多，其中主要有：药物在熔融油相中的溶解度；药物熔融物和脂质基质熔融物的可混合性；固态脂质基质的物理和化学结构；脂质材料的晶型等。获得足够载药量的先决条件是药物在脂质熔融物中溶解度足够大19。一般来讲，药物在熔融物中的溶解量要高一些，因为当熔融物温度下降时溶解的药物量会随之减少，脂质凝固后药物的溶解度甚至更低。可以通过加入增溶剂来增加药物在脂质熔融物中的溶解度，某些脂质如甘油单酯和双酯，也可以促进药物的溶解。脂质的化学结构也很重要，因为结晶性良好的脂质可以形成严密的晶格，这样导致药物的溢出。复杂的脂质如甘油单酯、甘油双酯和甘油三酯混合物含有不同长度的脂肪酸链，它们可以形成具有大量缺陷的晶格，从而形成很多可以容纳药物的空间。和脂质化学性质相关的脂质晶体结构无疑是决定脂质载药量的决定性因素，它决定在脂质晶体形成过程中，药物是被排除在晶体之外还是被包封在晶体里。因此，通过NMR，X-射线衍射和其它新技术深入了解脂质的各方面性质，可以帮助我们获得载药量更高的SLN。 多晶型脂质的晶型也是决定载药量的一个重要因素。纳米粒中脂质的晶型和常规状态下不太一样。纳米粒中脂质结晶部分为构型，而常规状态下的结晶大部分为构型，并很快转变为构型。脂质转变为更稳定的晶形后，晶格变得比较完整，包封药物的效率变得很低。一般来说，长链脂肪酸的晶型转变速度比短链脂肪酸慢。SLN体系中脂质结晶存在一定数量的构型，保存期内仍然保持一定的数量。通过调节温度或减少SLN中的水分，促使纳米粒中脂质晶体构型的转变，使其晶型由变为，促使药物释放，从而把一个普通的SLN变成一个智能的药物载体系统。 人们对SLN如何包封药物已经进行了很多研究，但是对SLN 药物释放机理的研究却很少。大多数体外释放机理的研究都是由Mehnert 等31-33以丁卡因和依托度酸为模型药物完成的。根据他们发表的数据（图6-3），固体脂质纳米粒载药方式具有以下三种模型：1 固态溶液：冷匀法没有采用表面活性剂或采用对药物没有增溶作用的表面活性剂，制得的脂质纳米粒是一种固态溶液（即药物以分子分散于脂质基质中）；2 核-壳结构，药物富集于壳中：当药物的沉淀速度小于脂质结晶的速度，这时会形成一个药物富集的壳；3 核-壳结构，药物富集于核中：药物溶解在脂质熔融物中的量达到或接近于它的饱和药物量时，冷却时药物的沉淀先于脂质的结晶，就会形成一个药物富集的核。纳米乳的冷却会导致药物在脂质中产生过饱和现象，进而药物先于脂质沉淀下来，进一步的冷却会使脂质重新结晶，包围含药的核形成膜的结构。脂质膜的药物浓度等于结晶温度时脂质中药物的溶解度。这样形成的脂质纳米粒具有一个脂质壳和药物富集的核。固态溶液载药壳脂质核药物分子分散体 脂质核药物/载药核 图6-3 药物在SLN中的分布模型图 在脂质纳米粒的研究中遇到的主要问题是药物的突释问题。不管制备方法是热匀法还是冷匀法，制备的含丁卡因和依托度酸的纳米粒都会遇到药物突释的问题。但以脱氢皮质醇为模型药物时，可以制备具有一定缓释作用的纳米粒。这证明SLN可以应用于药物的缓控释制剂，并通过改变脂质、表面活性剂浓度和制备时的一些参数（如温度）来调节药物释放特性。在体外，纳米粒持续释放药物的时间可长达57周。在脱氢皮质醇纳米粒中，药物被缓慢释放而无明显的突释效应，但是释放曲线上开始仍会有一个释放较快的阶段，随之是一个相对缓慢的阶段。释放初期的突释剂量对药物的快速起效是有利的。值得注意的是，纳米粒粒径对药物释放的影响很小，药物释放曲线形状主要受制备材料和制备条件的影响，如表面活性剂浓度、制备温度和脂质基质的性质。用热匀法制备的纳米粒与用冷匀法制备的纳米粒相比，药物释放具有很大的突释效应，但两者的药物后期释放速率相似。用热匀法制备纳米粒时，油相中的药物会重新溶解在水相中。药物在水中的溶解度越大，则重新溶解到水相中的药物量越多。这意味着温度越高、表面活性剂浓度越大，纳米粒的载药量越低。将制得的初乳冷却，随着水相温度的降低，药物在水中的溶解度也随之下降，这时部分药物又会重新分配到油相。当温度下降到脂质结晶温度时，脂质基质和溶解在其中的药物开始形成固态的脂质核，从而制得固态脂质纳米粒。降低分散体系的温度会进一步降低药物在水相中的溶解度，已经结晶的脂质核不能够再容纳药物，药物则在脂质核的外层或表面聚集。聚集在脂质核外层或表面的药物以药物突释的形式释放出来，分散在脂质核内的药物则缓慢地释放。因此，药物突释的程度可以通过制备过程中的温度和表面活性剂的浓度来调节，温度增加或表面活性剂浓度的增大会使药物的突释效应增强。室温下制备纳米粒可以避免药物从水相到油相的反复分配过程，因此药物的突释效应很小。为了避免药物的突释效应，还可以不采用表面活性剂或采用对药物没有增溶作用的表面活性剂。6.1.6 SLN的毒性SLN是用毒性低，生物相容性好的脂质材料为载体，同聚合物纳米粒相比，SLN的毒性大大降低。以HL60细胞和人粒性白细胞的生存情况为指标，考察不同纳米载药体系的体外细胞毒性，发现SLN的毒性比PLGA纳米粒的毒性低90%，比PBCA纳米粒低99%。PLA纳米粒、PLGA纳米粒和SLN使人粒性白细胞的存活率降低50%的浓度分别为0.30%，0.15%，和大于10%，这说明SLN的毒性最低34,35，更适合作为静脉给药系统药物的载体。当使用亲水性的Poloxamine 908 和Poloxamer 407 对SLN进行表面修饰后静注给药，可降低RES巨噬细胞的吞噬，延长药物在血液中的循环时间，与同样进行过表面修饰的聚苯乙烯纳米粒相比，可使RES的吞噬作用降低8%15%。综上所述看出：SLN的明显优点是其成分都是生物相容的，制备方法快速有效，可以大规模生产，避免使用有机溶剂和有可能生产出高浓度的产品等方面。但是它的缺点也很多，包括载药量低，不同胶态结构的出现（胶束，脂质体，混合胶束，药物纳米结晶），脂质的物理状态复杂（不同晶型之间的转变，过冷熔化物的出现）以至在储存（凝胶化，粒径的增大，药物的渗漏）和使用过程中的不稳定。样品的稀释或溶剂的蒸发会改变共存胶态体系之间的平衡和脂质的物理状态。物理稳定性差、对脂溶性差的药物包封率低都是制约SLN应用的瓶颈。包封率受多种因素的影响，如：药物在熔融脂质中溶解度、药物与载体在熔融时的相容性、SLN的理化结构、脂质多晶型、匀质温度、水相乳化剂浓度等。为了揭示这种表面活性剂/脂质分散体复合物的特性，除了需测量SLN粒径外，还要采用其它的表征方法。进一步的研究重点需要了解SLN进入体内后与体内的生物环境之间的相互作用（吸附/解吸附过程，酶解，聚合，和内源性的脂类载体系统之间的作用）。SLN可用于不同的给药途径，但是静脉注射要求SLN粒径绝对在安全范围内，这在实际应用中会有许多困难。6. 2 脂质体6.2.1 概述早在60年代初，英国Bangham等发现，磷脂分散在水中能形成多层微囊，每一层均为磷脂双分子层，各层之间被水相分开，这种具有类似生物膜的磷脂双分子结构称为脂质体。近年来，由于脂质体在基础理论及应用上有重要意义，它能够改变许多生物活性物质如抗肿瘤药、抗炎药、免疫调节剂、基因类药物等的体内转运过程，因此引起人们极大的兴趣。同其他的药物载体系统相比，脂质体具有以下作用特点36：1靶向性：靶向性是脂质体作为药物载体最突出的一个优点。脂质体的靶向性主要有天然靶向性、隔室靶向性、物理靶向性和配体专一靶向性，因此可以提高药物在靶部位的浓度，增强药物疗效，降低对其他非作用靶位的毒副作用，提高治疗指数。2长效性：脂质体作为药物的载体具有长效作用。脂质体作为药物的储库，可使被包封药物缓慢释放，从而使药物在血液中或局部位点维持较长时间的有效浓度。3保护性：药物被脂质体包封后，受到脂质体双层膜的保护，可以显著提高稳定性，同时，还免受体内的降解酶和免疫系统的分解，提高药物在体内的稳定性。4广泛性：脂质体可以和细胞相互作用或被细胞吞噬、摄取，从而使那些理化性质不稳定的药物（如DNA分子）进入胞内成为可能。5扩大性：如果药物是抗原，脂质体还可作为疫苗的免疫佐剂。6.2.2 脂质体的分类同其它载药系统相比，脂质体具有独特的结构与理化性质可变性。研究人员可以根据不同的目的对脂质体进行修饰。近年来，脂质体主要分为以下四大类： 普通脂质体， 阳离子脂质体，长循环脂质体，免疫脂质体等（图6-4）。从图中可以看出它们的一些基本特点，普通脂质体一般呈中性，阳离子脂质体带正电荷，通过单键、双键和多重键结合；长循环脂质体主要由高分子物质或葡萄糖醛酸等物质修饰；免疫脂质体是含有抗体或抗体片段的长循环脂质体。普通脂质体长循环脂质体免疫脂质体阳离子脂质体图6-4 脂质体的类型及其结构简图脂质体的体内行为除了与决定膜的理化性质如流动性、电荷密度和渗透性等的各种化学成分相关外，还与脂质体的大小和形状等特性能有关。脂质体的直径约在25nm1000nm范围内，甚至更大。它们可由单层双分子膜组成，也可由多层双分子膜组成。根据用途对脂质体粒径的特定要求，不同大小脂质体常可以采用不同的制备方法。按脂质体的大小和脂质双层数目可将脂质体分为以下几类：（1）多层脂质体（multilamellar vesicles，MLV） 它是由双分子层与水交替形成的囊泡。这些脂质体大小范围较宽，一般从100nm1000nm不等，组成MLV的磷脂双分子层有五层或更多，层数较少的的有时也称为少层脂质体（oligolamellar liposomes）。MLV的主要缺点是包封率低。（2）小单层脂质体（small unilamellar vesicles，SUV） 这是具有脂质双分子层的最小单位，其大小根据介质的离子强度和膜的脂质组成不同而不同，因此作为药物的载体受到限制。一般在生理盐水中，单纯由蛋黄卵磷脂组成的脂质体直径约15nm，由DPPC