《转基因植物》word版.doc

第五章 转基因植物是指利用基因工程技术，在离体条件下，对不同生物的DNA进行加工，并按照人们的意愿和适当的载体重新组合，再将重载体转入受体中，并使其在体内表达的植物。转基因植物通常具有高产优质、抗病虫、环境抗性、抗除草剂、耐储存、提高某些成分的含量等优良性状。第一节 植物转基因技术一、植物细胞培养技术 植物组织培养的重要理论基础是植物细胞的全能性。植物细胞全能性(totipotency)，就是植物体细胞或性细胞，在人为控制的培养条件下都具有再生成新个体的潜能，因而在适宜的条件下可以被诱导生长分化形成完整植株。 二、植物转基因技术的基本路线1.目的基因的分离2.载体构建3.导入细菌并利用细菌繁殖扩增重组DNA4.对植物组织或细胞进行转化5.植株再生6.转基因植株的鉴定7.转基因植株的种植三、转基因的受体系统1植物组织受体系统： 受伤的细胞容易受到病毒或质粒的感染。这些病毒或质粒上的某些DNA通过各种不同的方式转移到受伤的植物细胞，并形成愈伤组织。愈伤组织可以培养成完整的转化植株。该受体系统转化率高，可获得较多的转化植株，取材广泛、适用性广。但再生植株无性系变异较大，转化的外源基因稳定性差，嵌合体多。2原生质体受体系统： 是植物细胞除去细胞壁后的部分，是一个质膜包围的“裸露细胞”。原生质体在合适的条件下具有分化、繁殖并再生成完整植株的能力，具有全能性。原生质体在体外比较容易完成一系列细胞操作或遗传操作，互相之间可以发生细胞融合，而且还可以直接高效的捕获外源基因，嵌合体少。但缺点是遗传稳定性差，培养周期长，难度大，再生频率低。3生殖细胞受体系统： 它是以植物生殖细胞如花粉细胞、卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统。目前主要以两条途径利用生殖细胞进行基因转化：一是利用组织培养技术进行花粉细胞和卵细胞的单倍体培养，诱导愈伤组织细胞，进一步分化发育成单倍体植株，从而建立单倍体的基因转化系统；二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法、花粉粒浸泡法、子房微针注射法等。由于该受体系统与其它受体系统相比有许多优点，如：具有全能性的生殖细胞直接为受体细胞，具有更强的接受外源DNA的潜能，一旦将外源基因导入这些细胞，犹如正常的受精过程会收到“一劳永逸”的效果；利用植物自身的受粉过程，具有操作方法方便、简单。不足之处是利用该受体系统进行转化受到季节的限制；只能在短暂的开花期进行，且无性繁殖的植物不能采用。4.叶绿体转化系统 外源基因可以在叶绿体中得到稳定表达，而且还具有许多优点：（1）便于外源基因定位整合（2）基因为多拷贝，表达量高（3）导入的外源基因性状稳定性高（4）能直接表达原核基因四、外源基因导入植物的方法（一）DNA直接转移法1.化学刺激法 植物原生质体借助一些化学试剂（如PEG、氯化钙等）的诱导能吸收外源DNA、质粒等遗传物质，并有可能整合到植物染色体上去。 此法对细胞伤害少，可避免嵌合体产生，易于选择转化体，受体细胞不受种类限制。2.电击法 首先是将原生质体在溶液中与DNA混合，利用高压电脉冲作用在原生质体膜上“电激穿孔”，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。此法在动物细胞中应用较早并取得很好效果，现在这一方法已被广泛用于各种单、双子叶植物中，特别是在禾谷类作物中更有发展潜力。不但原生质体而且完整的单细胞也可利用此法，这对于那些难以从原生质体再生植株的植物或许有更大意义。3.显微注射法 显微注射进行基因转化是一种比较经典的技术，其理论和技术方面的研究都比较成熟。特别在动物细胞或卵细胞的基因转化，核移植及细胞器的移植方面应用很多，并已取得重要成果。植物细胞的显微注射在以前使用很少，但近年来发展很快，并在理论技术上有所创新。4.基因枪法 克莱因（Klein）等1987年首次用基因枪轰击洋葱上表皮细胞，成功地将包裹了外源DNA的钨弹射入其中，并实现了外源基因在完整组织中的表达。这一方法要使用一种防枪结构的装置基因枪，枪管的前端是封口的，上面只有直径1mm左右的小孔，弹头不能通过。其具体操作是将直径4um左右的钨粉或其它重金属粉在外源DNA中形成悬浮液，则外源DNA会被吸附到钨粉颗粒的表面，再把这些吸附有外源遗传物质的金属颗粒装填到圆筒状弹头的前端，起爆后，弹头加速落入枪筒，在枪筒口附近被挡住，而弹头前端所带的钨粉颗粒在惯性作用下脱离弹头，以高速通过1mm的小孔直接射入受体，其表面吸附的外源DNA也随之进入细胞。也可以用高压放电或高压气体使金属粒子加速。5.脂质体介导法 脂质体是由磷脂组成的膜状结构，将磷脂悬浮在水中，在适当条件下，受到高能声波处理时，磷脂分子群集在一起形成密集的小囊泡状结构，称为脂质体。用脂质体包裹一些DNA、RNA分子就成了一种人工模拟的原生质体，它的外膜相当于人造的细胞质膜。然后与植物原生质体共保温，于是脂质体与原生质体膜结构之间发生相互作用，而后通过细胞的内吞作用而将外源DNA导入植物的原生质体。这种方法具有许多方面的优点，包括可保护DNA在导入细胞之前免受核酸酶的降解作用，降低了对细胞的毒性效应，适用的植物种类广泛，重复性高，包装在脂质体内的DNA可稳定地贮藏等。6.微激光束法 是利用激光脉冲引起细胞膜可逆性穿孔，从而将外源DNA导入受体细胞。 可在荧光显微镜下找出合适的细胞，然后用激光光源替代荧光光源，使细胞壁被击穿，外源DNA进入受体细胞。7.花粉管通道法 这种方法最早是由周光宇1983年建立。花粉管通道法是将外源的DNA片段在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，使外源DNA沿花粉管通道进入胚囊，转化受精卵或其前后细胞，转化率高达10%。这一方法的建立开创了整株活体转化的先例，可以应用于任何开花植物。（二）农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化人们很早就发现双子叶植物常发生一种冠瘿瘤病，该病在法国、东欧和意大利的葡萄和果树上曾大面积发生。 1907年Smith和Townsent等首先发现这种冠瘿瘤病是由根癌农杆菌引发的。1974年Zaenen等在根癌农杆菌内发现并分离了一种与肿瘤诱导有关的大型质粒（大于200kb），称为Ti质粒。1977年Chilton等在研究农杆菌侵染后形成的植物肿瘤细胞时，用分子杂交发现在肿瘤细胞中存在着农杆菌Ti质粒的一个片段，称为T-DNA（Transfer-DNA）。实验表明，T-DNA转移到植物细胞后整合进植物基因组中并得以表达，从而导致了冠瘿瘤的发生。进一步研究发现，整合到植物基因组中的T-DNA可以通过减数分裂稳定地传给植物的后代，Ti质粒的上述特性成为农杆菌介导法植物遗传转化的重要基础。Ti质粒为根癌农杆菌核外的一种环状双链DNA分子，长约200Kb。其中含有一段称为T-DNA的可转移区段，当农杆菌侵染寄主细胞后，T-DNA可以从农杆菌转移到寄主细胞内并整合到寄主细胞的基因组中。Ti质粒的这一特性为农杆菌介导法植物转基因奠定了基础。T-DNA的长约23Kb，在其两端各有一个25bp左右的正向重复序列，称之为T-DNA的边界序列。在不同的农杆菌Ti质粒上该序列高度保守，一般认为右端重复序列对T-DNA的转移起决定性作用。第二节 转基因植物的筛选与检测无论使用哪种转基因方法，转化细胞与非转化细胞相比都只占少数。为获得真正的转基因植株，进行基因转化后的第一步工作是筛选转化细胞。在含有选择压力的培养基上诱导转化细胞分化，形成转化芽，再诱导芽生长、生根，形成转化植株。第二步是对转化植株进行分子生物学鉴定。第三步则是进行性状鉴定及外源基因的表达调控研究。 （一）抗性基因一般用抗性基因来富集转化细胞。抗性基因应满足以下几点：（1）抗性基因应是显性基因。（2）在选择压力下，转化细胞能继续生长，而非转化细胞受到抑制，从而使转化子得到富集。（3）抗性基因产物本身不能对转化细胞的生长或发育有抑制作用。（4）选择物价廉易得。1.抗生素抗性基因（1）npt 新霉素磷酸转移酶基因，对卡那霉素、巴龙霉素、新霉素具有抗性。（2）aphIV 潮霉素磷酸转移酶基因，对潮霉素具有抗性。（3）spt 链霉素磷酸转移酶基因，对链霉素具有抗性。（4）cat 氯霉素乙酰转移酶基因，使氯霉素丧失抗生素活性。等等。 2.抗除草剂基因l 除草剂抗性基因在植物遗传转化中可同时用作选择标记和培养抗除草剂的作物。l 抗除草剂基因主要有抗PPT的bar和pat基因以及抗草甘膦的epsps基因。（二）显色或发光报告基因1.GUS酶活性检测 gus基因存在于某些细菌体内，编码-葡萄糖苷酶（-glucuronidase，Gus），该酶是一种水解酶，能催化许多-葡萄糖苷酯类物质的水解。因为绝大多数植物细胞内不存在内源的Gus活性，因此gus基因广泛用作转基因植物的报告基因，尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化实验中广泛应有。此外，gus基因3端与其他结构形式的融合基因也能够正常表达，所产生的融合蛋白仍具有Gus活性，这对研究外源基因表达的具体细胞部位提供了方便条件，也是它相对于其他报告基因的一个优点。主要有一下三种检测方法： （1）组织化学染色定位法 该法以5-溴-4-氯-3-吲哚-D葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）为底物，通过显色反应可直接观察到组织器官中gus基因的活性。该方法不用将酶从组织中提取出来，而是使底物进入被测的植物组织、细胞或原生质体之中。将被测材料浸泡在含有底物的缓冲液中保温，若组织、细胞、原生质体发生了gus基因转化，表达出GUS，在适宜条件下该酶可将X-Gluc水解生成蓝色物质，初始产物并不带颜色，为无色的吲哚衍生物，后经氧化二聚作用形成5,5-二溴-4,4-二氯靛蓝染料，此靛蓝染料使具有Gus活性的部位或位点呈现蓝色，可用肉眼或在显微镜下观察到。（2）荧光法测定Gus活性 该法以4-甲基伞形酮酰-D-葡萄糖醛酸苷酯（4-MUG）为底物，Gus催化其水解为4-甲基伞形酮（4-MU）及-D葡萄糖醛酸。4-MU分子中的羟基解离后被365nm的光激发，产生455nm的荧光，可用荧光分光光度计定量。具体测定时有两种做法:仅在一个时间上测定溶液的总荧光量，测定时要设对照，以消除内源荧光强度；测定酶反应不同时间溶液荧光量（荧光法十分灵敏，微小的增加量也可以测定出来），在酶反应初始阶段，酶作用生成的荧光物质在反应体系中处于积累阶段，荧光产物与时间有线性关系，而内源性荧光物质的荧光量与时间无此种关系，因而可通过测定酶反应初始阶段几个时间的荧光量，得到的线性关系即可作为酶活力的依据。（3）分光光度法测定Gus活性 对硝基苯-D-葡萄糖醛酸苷（PNPG）是该法的最好底物，Gus将其水解，生成对硝基苯酚，在pH7.15时离子化的发色团吸收400420的光，溶液呈黄色，酶反应在pH7.0条件下进行，随反应进行，产物生成，逐渐碱化，显色增强。以对硝基苯酚为标准样品，分别在反应开始后不同时间取样，终止反应后于415nm测吸收值。这种方法简单，无需复杂仪器，但其灵敏度不高，可通过延长反应时间来增强显色。2.荧光素酶活性检测萤火虫萤光素酶催化的底物是6-羟基喹啉类，在镁离子、三磷酸腺苷及氧作用下，酶使底物氧化脱羧，生成激活态的氧化萤光素，其发射光子后转变成常态的氧化萤光素，反应中化学能转变成光能。检测的方法有两种：活体内萤光素酶活性测出，体外萤光素酶活性的检测。3.绿色荧光蛋白检测绿色荧光蛋白（green-fluorescent protein，Gfp）是一些腔肠动物所特有的生物荧光素蛋白，它是能够接收光辐射能并最终发射荧光的物质。 生物荧光素蛋白是指存在于生物体内，能在激发光作用下发射出荧光的蛋白质。 Gfp在异源细胞中的表达表明，Gfp于其他原核或真核细胞中，在蓝光激发下都能发出绿光，即发射团的形成无物种特异性，也不需要特异的辅助因子。因此gfp基因作为新型标记或报告基因在各种生物中广泛使用。（三）分子生物学检测方法1.酶联免疫吸附检测 酶联免疫吸附检测是指利用外源基因表达蛋白的抗体与抗原的特异性，通过结合在抗体上的酶作用于特定的底物后发生显色反应，借助比色鉴定转基因植物。可经免疫反应确定表达蛋白在转基因植物组织及细胞中的分布。2. PCR技术检测 是根据转基因植物中外源基因的特点，设计并合成相应的引物，以转基因植物DNA为模板进行PCR扩增反应。如PCR扩增反应的产物与外源基因片段相同，表明该植物为转基因植物。 PCR检测DNA用量少，操作简单，快速灵敏，不需用同位素即可完成。 应用PCR检测易出现假阳性，可用PCRSouthern杂交进一步验证。3.分子杂交检测利用探针与其互补的核苷酸序列杂交后，就可以从诸多的核苷酸序列中检测出与其互补的序列，因而分子杂交是重组子鉴定以及检测外源基因整合与表达的强有力的手段。它是证明外源基因在植物染色体上整合的最可靠方法。转基因植物分子杂交包括两部分，一是核酸分子杂交，其中又包括Southern杂交及Northern杂交。二是属于蛋白质分子“杂交”的western杂交。第三节 改进转基因的技术外源基因在植物细胞中的表达是植物基因工程的关键。然而，近几年许多研究者发现，转基因在受体植株内的遗传与表达往往事与愿违，转基因表达水平很不稳定，常常不表达或表达水平降低，这种现象便是转基因沉默现象。目前已成为植物遗传转化技术用于基础研究和应用研究的严重障碍。 因此，研究基因沉默的发生机理并探求控制其发生的方法、策略便成了当今遗传学家的研究热点。一、转基因植物中外源基因的沉默所谓植物转基因沉默，是指导入并整合到受体植物细胞核基因组上的外源基因，在当代或后代转基因植株中的表达活性受到抑制的现象。 影响转基因沉默的原因是多方面的，包括转基因的拷贝数和构型、环境条件和发育因子，以及DNA的甲基化作用等。 1.位置效应 位置效应是指转基因在寄主染色体基因组上插入部位及其周围的核苷酸组成对转基因表达活性的影响。目前通用的遗传转化方法通常导致转基因在宿主细胞基因组中的随机整合，外源基因进入细胞核后首先整合到染色质上，其整合位点与表达有密切的关系。如果整合到甲基化程度高、转录活性低的异染色体上，一般不表达；如果整合到甲基化程度低、转录活性高的常染色质上，其表达受两侧DNA序列的影响。 2. DNA甲基化 植物DNA甲基化程度是较高的，核基因组中几乎有20%30%的胞嘧啶残基处于甲基化状态。然而大量研究表明，在转基因植物中DNA甲基化却严重影响了转基因的正常表达。真核生物启动子的甲基化能够导致基因失活，它通常发生在DNA的CG和CNG序列的C碱基上。一般来说，外源基因编码区域的甲基化对基因表达的作用并不明显，而外源基因启动子区域的甲基化会引起启动子失活。 3.重复序列诱发基因沉默 外源基因如果以多拷贝的形式整合到染色体DNA的同一位点上，就会形成首尾相连的正向重复或头对头、尾对尾的反向重复，不能进行转录，并且拷贝数越多，基因沉默现象也就越严重。这可能是由于重复序列之间发生自发配对，形成可被甲基化酶特异性识别的结构而发生甲基化作用，从而抑制其表达。此外，重复序列间的相互配对也可以导致自身的异染色体化，抑制基因表达。 4.共抑制 共抑制是指在外源基因沉默的同时，与其同源的内源基因的表达也受到抑制。 共抑制属于转录后抑制。转录后水平基因沉默的特点是，外源基因能够转录成mRNA但不能积累，也就是说，mRNA一经合成就被降解或被相应的反义RNA或蛋白质封闭，从而失去合成蛋白质的功能。这可能是由于同源或重复的基因表达了过量mRNA的结果。 二、 提高外源基因表达水平的策略1.改进转化方法 重复序列容易引起基因沉默。 如采用农杆菌介导法产生的拷贝数相对较少，可以在一定程度上避免这个问题。2.选择强启动子和诱导型启动子 要使外源的基因能够在转基因植株中实现正常的乃至高效的表达，一个重要条件需要在其上游安置一个适当的启动子。迄今为止，在绝大多数高等植物转基因研究工作中，大都是使用组成型的启动子。然而随着研究工作的不断深入，要求外源基因能够在转基因植株中实现特异性表达，即在特定的组织和特定的发育阶段进行表达；或是对特定植物激素作出反应，以及对诸如热激、光照、创伤，乃至真菌感染等特定的环境信号作出反应。这就需要应用组织特异性启动子或是诱导型启动子。部分用于植物遗传转化的组织特异性启动子表达组织启动子来源目的植物作者花药烟草Ta29烟草 油菜Mariani （1990）种子菜豆植物凝集素基因PHA-L烟草Altabella （1990）叶片PEPC （Pepcarboxylase Gene of Maize）玉米Kozial （1993）韧皮部水稻蔗糖合酶基因RSs1烟草Shi （1994）果实ovary tissue （patent）番茄Martineau （1995）胚乳玉米淀粉合酶基因GBS玉米Russell （1997）根系发根农杆菌的rolD启动子番茄Varvara （2001）髓部玉米pGL2水稻Datta （1998）l 化学诱导型表达调控系统的原理化学诱导型调控系统是指可被某些化学物质诱导而表达启动或表达关闭的转基因调控系统。和植物天然的诱导型启动子相比，该类系统的应用更加灵活和自由，人们可以根据需求在转基因作物生长的任何时期对转基因的表达进行调控。 作为理想的化学诱导物必须具备以下特性：第一、化学诱导物要对转基因诱导的专一性高，在受体作物中其本身含量低且对受体作物无毒害作用；第二、对环境友好，且造价不高；第三、诱导效率要高，其工作浓度低且不是常用的化学物质；第四、方便于喷洒或蘸根处理。 一般来说，化学诱导调控系统都包含两个转录单元。第一个转录单元由一个组成型启动子（通常为35S启动子）驱动一个对特定化学成分敏感的转录调控因子构成；第二个转录单元由多拷贝的转录因子结合位点、微型植物启动子（通常为截短的35S启动子）和目的基因串联而成。 3.强终止子 植物基因的转录终止子，至少含有一个多聚腺苷酸信号（如AATAAA、AATTAA或AACCAA），但其功能的正常发挥，同样还需要其它的3序列结构成分。 在植物遗传转化中，最常用的终止子是CaMV35S终止子和根瘤农杆菌TDNA胭脂氨基酸合成酶的nos终4. 使用植物偏爱的密码子 由于转基因DNA序列与受体植物基因组DNA碱基不同是引发DNA甲基化的重要原因，所以在开展遗传转化前有必要对转基因进行密码子优化工作，使用植物偏爱密码子。5.使用基质结合区序列 细胞核基质 结合区(matrix attachment region MAR) 是真核细胞核去除核小体中核心蛋白与连接蛋白后，牢固地附着在细胞核基质上的大量伸展成环状结构域的DNA 。 MAR序列位于转录活跃的DNA环状结构域边界，从而阻断了附件序列对基因表达的影响，有利于表达。6.使用增强子 从植物基因中分离相应的增强子并构建嵌合基因，可望确保转化基因按照合适的调控模式表达，消除因基因表达在时空上的专一性所产生的失活问题。 增强子对转录的调控特性有：增加作用元件位置与取向性，即增强子的排列方向以及与基因的距离均能表现出增强效应。增强效应明显性，一般增强子能使基因转录频率增强10200倍，有的达上千倍。序列重复性，即增强子大多为重复系列，一般长度约50bp，适合于某些蛋白因子结合。组织和细胞特异性，只有特定的蛋白质参与才能发挥其功能。无基因专一性，可以在不同的基因组合上表现增强效应。增强子的可调控性，增强子受到外部信号的调控。7.外源基因的修饰与改造（1）避免基因间的同源性 在构建载体时，尽量降低所设计的序列与内源基因的同源性，以减少和避免配对。（2）避免重复序列的出现 在选择作为育种材料的转基因植株时，应尽量选择单拷贝插入的个体，来减少重复序列的存在。（3）在载体上增加增强翻译序列和核糖体结合位点 通常植物起始密码子周边序列具有如下特征：AACAAUGGCX第四节 农作物基因工程一、抗虫转基因作物苏云金杆菌（Bt）产生的毒素蛋白，有高度特异杀鳞